Name: simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells
Uploaded: 2022-07-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק ליונג יו מאוניברסיטת יוהנס קפלר לינץ (BERM16108001).

1. קווי תאים DLBCL עם טיפול באפוספמיד או דאונורוביצין כדי לגרום לסנסנציה תאית
הערה: הפרוטוקול פועל גם עבור תאים סרטניים חסידיים. בהתאם לגודל התא, זרע 1-2 × 105 תאים לתוך באר אחת של צלחת 6 בארות ולדגום את הצלחת באינקובטור 5% CO2, 37 °C לילה לפני הטיפול. שלבי הפרוטוקול ?...

<ol>
	<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essence+of+senescence.">The essence of senescence.</a> Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li><li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene-induced+senescence+is+a+DNA+damage+response+triggered+by+DNA+hyper-replication.">Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication.</a> Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).</li><li>Milanovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+reprogramming+promotes+cancer+stemness.">Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness.</a> Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).</li><li>Passos, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+between+p21+and+reactive+oxygen+production+is+necessary+for+cell+senescence.">Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence.</a> Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).</li><li>Lee, S., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+nature+of+senescence+in+cancer.">The dynamic nature of senescence in cancer.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).</li><li>Toussaint, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+premature+senescence+or+stress-induced+senescence-like+phenotype:+one+in+vivo+reality,+two+possible+definitions.">Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions.</a> The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).</li><li>Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+cancer+and+aging.">Cellular senescence in cancer and aging.</a> Cell. 130 (2), 223-233 (2007).</li><li>Munoz-Espin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+senescence+during+mammalian+embryonic+development.">Programmed cell senescence during mammalian embryonic development.</a> Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).</li><li>Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmasking+senescence:+context-dependent+effects+of+SASP+in+cancer.">Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).</li><li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease:+from+mechanisms+to+therapy.">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li><li>Chandra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reorganization+of+the+nuclear+landscape+in+senescent+cells.">Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells.</a> Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).</li><li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+DNA+damage+signalling+triggers+senescence-associated+inflammatory+cytokine+secretion.">Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion.</a> Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9me3-mediated+epigenetic+regulation+of+senescence+in+mice+predicts+outcome+of+lymphoma+patients.">H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients.</a> Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).</li><li>Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+ageing:+from+mechanisms+to+therapeutic+opportunities.">Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).</li><li>Fan, D. N., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+markers+of+therapy-induced+senescence+in+cancer+cells.">Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).</li><li>Schmitt, C. A., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+and+chemoresistance+in+transgenic+cancer+models.">Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models.</a> Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).</li><li>Dorr, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethal+metabolic+targeting+of+cellular+senescence+in+cancer+therapy.">Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy.</a> Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).</li><li>Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxic+stress-induced+senescence.">Genotoxic stress-induced senescence.</a> Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).</li><li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts.">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li><li>Biran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+identification+of+senescent+cells+in+aging+and+disease.">Quantitative identification of senescent cells in aging and disease.</a> Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).</li><li>Rossi, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+senescent+surface+biomarkers+as+senotherapeutic+targets.">The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets.</a> Cells. 10 (7), 1740 (2021).</li><li>Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo.">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li></ol>

שיטה זו בחנה את יכולת הכניסה לסנסנציה של ארבעה קווי תאי DLBCL שונים עם טיפול כימותרפי, עם הדמיה בשדה בהיר וכימות מבוסס ציטומטריה של זרימה. ברמה של תא יחיד, זיהינו בהצלחה אוכלוסיות סנסנטיות עיקריות של C12FDG+EdU-Ki67+ בתאי KARPAS422 ו-WSU-DLCL2 שטופלו, ובמידה פחותה בתאי OCI-LY1, בעוד שקו הת...

מגוון גירויים יכולים לגרום לסנסנציה תאית, ולגרום לתאים להיכנס למצב של עצירה יציבה של מחזור התא. גירויים אלה כוללים שינויי איתות פנימיים או לחצים חיצוניים. אותות פנימיים כוללים קיצור טלומרים פרוגרסיבי, שינויים במבנה הטלומרים, שינוי אפיגנטי, הפרעות פרוטאוסטזיס, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה והפעלה של אונקוגנים. לחצים חיצוניים כוללים אותות דלקת ו/או נזק לרקמות, קרינה או טיפול כימי, וחסך תזונתי 1,2,3,4. מבין הסוגים המובהקים של סנסנציה, הנפוצים ביותר הנראים והנחקרים היטב הם סנסנציה משכפלת, סנסנציה המושרה על ידי אונקוגן (OIS), סנסנציה המושרה על ידי קרינה וסנסנציה המושרה על ידי טיפול (TIS). OIS היא תגובה תאית חריפה לנזק גנוטוקסי הנגרם על ידי עקה משכפלת הנוצרת על ידי הפעלת אונקוגן חריגה ויכולה במידה מסוימת למנוע את ההתקדמות הפתולוגית מנגע קדם-אופלסטי לגידול מלא. TIS קורה כאשר תאי הגידול נלחצים על ידי תרופות כימותרפיות או קרינה מייננת 5,6.
Senescence נחשב חרב פיפיות בפתולוגיה בשל אופיו הדינמי מאוד. הוא תואר בתחילה כמנגנון מדכא גידול מועיל להסרת תאים פגומים ממאגר התאים המתחלקים במחזור הדם, תוך שמירה על תפקודם התקין של האיברים ועיכוב צמיחת הגידול 7,8,9. עם זאת, עדויות חדשות מצביעות על צד אפל של סנסנציה. תאים סנסנטיים מפרישים ציטוקינים פרו-דלקתיים, הידועים בשם פנוטיפ הפרשה הקשור לסנסנציה (SASP), מה שמוביל לפיברוזיס ואיברים לא תקינים ומקדם את התחלת הגידול והתקדמותו10. יתר על כן, תאים סרטניים סנסנטיים עוברים תכנות מחדש אפיגנטי וביטוי גנים במקביל לשיפוץ כרומטין והפעלה של תגובה מתמשכת של נזק לדנ"א (DDR)11,12, תוך רכישת תכונות חדשות של תאי סרטן-גזע3. אף על פי שגידולים בעלי יכולת סנסנסנציה מגיבים טוב יותר להתערבות טיפולית בהשוואה לגידולים שאינם מסוגלים לסנסנציה13, ההתמדה של תאים סנסנטיים עלולה להוביל לפרוגנוזה גרועה לטווח ארוך אם הם לא יזוהו ביעילות ויסולקו על ידי תרופות סנוליטיות5. כך או כך, שיטה אמינה להערכת סנסנציה היא בעלת עניין קליני משמעותי, לא רק לפרוגנוזה של הטיפול, אלא גם לפיתוח אסטרטגיות חדשניות המכוונות לתאים סנסנטיים.
ללא קשר לטריגרים שונים, תאים סנסנטיים מציגים כמה מאפיינים נפוצים, כולל מורפולוגיה מוגדלת, שטוחה ורב-גרעינית עם ואקואולות גדולות, גרעינים מורחבים באופן משמעותי, היווצרות של הטרוכרומטין עשיר בסנסנציה H3K9me3 (SAHF) בגרעין, הצטברות מתמשכת של סמן נזק לדנ"א γH2AX מוקדים, מופעל p53-p21CIP1 ו- Rb-p16INK4a מנגנוני ויסות מחזור התא, עצירת מחזור תאי G1 יציבה, אינדוקציה מסיבית של SASP ופעילות מוגברת הקשורה לסנסנציה β-גלקטוזידאז (SA-β-gal)14. מכיוון שאין מספיק סמן יחיד כדי להגדיר סנסנציה, צביעה אנזימטית עבור פעילות SA-β-gal, הנחשבת לתקן הזהב לזיהוי סנסנציות, משולבת בדרך כלל עם צביעה אימונוהיסטוכימית עבור H3K9me3 ו- Ki67 כדי לזהות TIS15. עם זאת, קשה לכמת SA-β-gal המבוסס על כרומוגניה כימית. כאן, שילבנו 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) מבוסס פלואורסצנציה מבוסס SA-β-gal (fSA-β-gal) עם צביעה אימונופלואורסנטית עבור γH2AX ו- DNA משולב EdU כדי לזהות C12FDG+EdU-γH2AX+ תאים סנסנטיים באמצעות מערכת ציטומטר זרימת ההדמיה המתקדמת, המשלבת את המהירות, הרגישות ותמונות מפורטות של תא יחיד עם מידע מרחבי שלא ניתן לספק על ידי ציטומטריה של זרימה ומיקרוסקופיה. שיטה זו מאפשרת יצירה מהירה של תמונות ברזולוציה גבוהה המאפשרת מיקום וכימות של אותות פלואורסצנטיים בתוך תאים, תוך מתן רישיון לניתוח מהיר של דגימות מרובות על ידי בניית צינורות סטנדרטיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>613407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>350509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-&#946;-D-Galactopyranoside)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11590276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroquin -diphosphat</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>C6628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser (Coulter Clenz)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C10418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daunorubicin</td>
			<td>Medchemexpress</td>
			<td>HY-13062A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler (70% Isopropanol)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.3704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis software (Amnis&#160;IDEAS&#160;6.3)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>CN-SW69-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument and imaging software (Amnis&#160;ImageStreamX&#160;Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>100220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KARPAS</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mafosfamide cyclohexylamine</td>
			<td>Niomech</td>
			<td>D-17272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCI-LY1</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11473704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG (2-Phenylethyl-&#946;-D-thiogalactosid)&#160;</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>P4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saponin</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBead Kit for ImageStream</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>400041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-DHL6</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSU-DLCL2</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 575</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells

תרופות כימותרפיות יכולות לגרום לנזק בלתי הפיך לדנ"א בתאים סרטניים, מה שמוביל לאפופטוזיס או לסנסנציה מוקדמת. שלא כמו מוות של תאים אפופטוטיים, סנסנציה היא מנגנון שונה במהותו המרסן את התפשטותם של תאים סרטניים. עשרות שנים של מחקרים מדעיים חשפו את ההשפעות הפתולוגיות המורכבות של תאי סרטן סנסנטיים בגידולים ובמיקרו-סביבה המווסתים תאים סרטניים ותאים סטרומליים. ראיות חדשות מצביעות על כך שסנסנציה היא גורם פרוגנוסטי רב עוצמה במהלך הטיפול בסרטן, ולכן זיהוי מהיר ומדויק של תאים סנסנטיים בדגימות סרטן הוא חיוני. מאמר זה מציג שיטה לדמיין ולזהות סנסנציה הנגרמת על ידי טיפול (TIS) בתאים סרטניים. קווי תאים מתפזרים של לימפומה של תאי B גדולים (DLBCL) טופלו באמצעות מאפוספמיד (MAF) או דאונורוביצין (DN) ונבדקו לאיתור סמן הסנסנציה, β-גלקטוזידאז הקשור לסנסנציה (SA-β-gal), סמן סינתזת הדנ"א 5-אתניל-2′-דאוקסיורידין (EdU), וסמן הנזק לדנ"א gamma-H2AX (γH2AX). הדמיית ציטומטר זרימה יכולה לסייע ביצירת תמונות חד-תאיות ברזולוציה גבוהה בפרק זמן קצר כדי לדמיין ולכמת בו-זמנית את שלושת הסמנים בתאים סרטניים.

מטריצת פיצוי נוצרה באמצעות תוכנת ניתוח תמונות על ידי טעינת נתונים מוקלטים של דגימות בקרה בצבע יחיד. כפי שניתן לראות באיור המשלים S1, זליגת אור לא זניחה (ערך מקדם ≥ 0.1) מ-EdU ל-C12FDG זוהתה עם ערך מקדם crosstalk 0.248, בעוד שה-crosstalk בין ערוצים אחרים לא היה משמעותי. ארבעה קווי תאים שונים של DLBCL...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells at JoVE.com

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

כאן אנו מציגים שיטה מבוססת ציטומטריית זרימה להדמיה וכימות של סמנים מרובים הקשורים לסנסנציה בתאים בודדים.

הדמיה סימולטנית וזיהוי מבוסס זרימה-ציטומטריה של סמני סנסנציה פלואורסצנטיים מרובים בתאי סרטן סנסנטיים המושרים על ידי טיפול

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

שיטה זו יכולה ליצור במהירות תמונות ברזולוציה גבוהה המאפשרות ניתוח של התפלגות מרחבית וכימות של אותות פלואורסצנטיים בתוך תאים תוך מתן אפשרות לניתוח מהיר של דגימות מרובות. התאים נמדדים באמצעות מערכת ציטומטריה מתקדמת של זרימת הדמיה, המשלבת מהירות, רגישות ותמונות מפורטות של תאים בודדים עם מידע מרחבי המניב נתונים ייחודיים שלא ניתן לספק על ידי אופטומטריה של זרימות או מיקרוסקופיה. עצה חשובה אחת היא לספק מספיק תאים כדי לקבוע את הגדרות המכשיר ואנחנו משעים את התאים בצפיפות הגבוהה עבור המדידות.מלבד זאת רכישת נתונים היא פשוטה ודומה לציטומטריית זרימה קונבנציונלית. ראשית ליצור את קווי התא DLBCL כפי שמתואר בכתב היד. לאחר מכן הוסיפו תמיסת EdU של 10 מילימולאר ביחס של 1 ל-1000 לתוך תרבית התאים DLBCL ודגרו את הצלחת באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות לאחר ערבוב הצלחת על ידי נדנדה עדינה.הוציאו את הצלחת לאחר הדגירה והוסיפו תמיסת כלורוקווין 100 מילימולר לריכוז סופי של 75 מיקרומולר. מערבבים על ידי נדנדה עדינה ודוגרים במשך 30 דקות. לאחר מכן הוסיפו 20 מילימולר C12 FDG לריכוז סופי של 20 מיקרומולר.לאחר ערבוב עדין, דגרו את הצלחת למשך שעה כפי שהוכח קודם לכן. לאחר מכן, הוסף 100 מילימולר 2-פנילתיל-בטא-d-thiogalactoside פתרון אחד עד 50 כדי לעצור את כתמי בטא-גל FSA. ומסובבים בעדינות את הצלחת כדי לערבב.מעבירים את התאים לצינורות צנטריפוגה סטריליים של 15 מיליליטר ומסתובבים פי 100 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שהסופרנטנט מושלך, שטפו את התאים בארבעה מיליליטר של PBS וצנטריפוגה ב-100 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן השהה מחדש את כדורי התא ב-500 מיקרוליטרים בתמיסת קיבוע של 4% פרפורמלדהיד.לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה ב-250 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופר-נטנט ושטפו את התאים עם ארבעה מיליליטר של PBS פעמיים וצנטריפוגה ב-100 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הכביסה, יש להשליך את הסופר-נטנט ולהשעות מחדש את גלולת התא ב-200 מיקרוליטרים של מאגר חלחול של סאפונין.עכשיו להעביר את ההשעיה לצינור חדש 1.5 מיליליטר לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. גלולו את התאים ב-250 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן להשעות מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטרים של תמיסת נוגדנים ראשונית ולדגור בארבע מעלות צלזיוס בן לילה, בחושך.צנטריפוגה של הצינורות ב 250 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. יש להשליך את הסופר-נטנט ולשטוף עם 100 מיקרוליטרים של תמיסת שטיפת סאפונין. לאחר שטיפת התאים פעמיים, יש להשליך את הסופר-נאטנט ולהשעות מחדש את כדורי התאים ב-500 מיקרוליטרים של קוקטייל זיהוי EdU.דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות בחושך וצנטריפוגה ב-250 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. יש להשליך את הסופר-נטנט ולשטוף עם מיליליטר אחד של תמיסת שטיפת סאפונין. חזרו על הכביסה פעמיים, השליכו את הסופר-נטנט והשעו מחדש את כדורי התא ב-20 עד 50 מיקרוליטרים של PBS.לפני הפעלת המכשיר, רוקן את בקבוק נוזל הפסולת ובדוק את רמות SpeedBeads, מעקר, מנקה, debubbler ו נדן מספיק נוזלים. לאחר הפעלת המכשיר ותוכנת ההדמיה, לחץ על כפתור ההפעלה כדי לאתחל fluidics וכיול המערכת. הגדר את ההגדלה ל- 40 פעמים והגדר את מהירות הזרימה לנמוכה.לאחר הפעלת הלייזרים, הפעל לייזר של 405 ננומטר כדי למדוד את EdU Pacific Blue, 488 ננומטר כדי למדוד C12-FDG ו-642 ננומטר כדי למדוד את Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX. הגדר ערוץ שש לערוץ הפיזור, ערוץ 1 וערוץ תשע לשדה הבהיר. לאחר מכן התחל עם הדגימה שצפויה להיות בעלת הפלואורסצנטיות הגבוהה ביותר כדי להגדיר את עוצמת הלייזרים והפוך בעדינות את צינור הדגימה כדי לערבב.לאחר פתיחת מכסה הצינור, הכנס את צינור הדגימה לרציף. לחץ על טען כדי להתחיל ולפתוח עלילת פיזור. לאחר מכן, בחר את אזור תכונות, קו תחתון MO1 ויחס גובה-רוחב מדגישים MO1 עבור צירי X ו- Y בהתאמה.הגדר שער מעל יחס גובה-רוחב של 0.5 כדי לא לכלול כפילים וצברי תאים מתחת ובצד ימין ואת אוכלוסיית SpeedBead בצד שמאל. כעת, פתחו את 'התוויית היסטוגרמה' ובחרו בריבוע הממוצע של שורש מעבר הצבע של מסיכה 1 ובערוץ 1 עבור ציר X. בחר את אוכלוסיית הסינגלט והגדר את השער לבחירה עבור תאים ממוקדים.פתחו התוויית היסטוגרמה ובחרו עוצמות פיקסלים מרביות גולמיות לערוץ שתיים, שבע ו-11 בציר X. לאחר מכן התאם את עוצמות הלייזר של 488 ננומטר, 405 ננומטר ו- 642 ננומטר לייזרים לערוץ שתיים, שבע ו -11 בהתאמה, כך שלכל פלואורוכרום יש ערך פיקסלים מקסימלי גולמי בין 100 ל -4, 000 כדי למנוע פיזור יתר. בחר את האוכלוסייה הממוקדת להקלטה ולחץ על רכוש כדי למדוד את דגימות DLBCL עם הגדרות עקביות.בעת שינוי דגימות למדידה, לחץ על חזור כדי לשחזר את צינור הדגימה. לחצו על 'טען' כדי למחוק את הדגימה. לאחר מדידת כל הדגימות, כבה את השדה הבהיר ופיזר לייזר.מדוד דגימות בקרת צבע בודדות כדי ליצור מטריצת פיצוי. לחץ על כיבוי כדי לסגור את מערכת ההדמיה. נתח את הנתונים בתוכנת ניתוח התמונות.השתמש בכלי Spot Wizard של תוכנת ניתוח התמונות כדי לספור ולכמת באופן אוטומטי מוקדי גמא H2AX גרעיניים ותמונות של תאים חיים. בחר שתי אוכלוסיות תאים, אחת עם ספירת נקודות גבוהה ואחת עם ספירת נקודות נמוכה כדי לאמן את אשף הספוט לניתוח אוטומטי נוסף של ספירת נקודות. שיטת הציטומטריה של זרימה בתמונות של תאים בודדים הראתה עלייה ב-C12-FDG חיובי, נגטיב EdU, גמא H2AX חיובי, אוכלוסייה סנסקית ו-KARPAS422.תאי WSU-DLCL2 ו-OCI-LY1, אך לא בתאי SU-DHL6. הניתוח מבוסס ההדמיה הציג מספרים גבוהים משמעותית של מוקדי גמא H2AX ו-KARPAS422, WSU-DLCL2 ו-OCI-LY1, אך לא בתאי SU-DHL6. תוצאות דומות היו מיוצגות על ידי נתוני תדירות וכימות.הוספת סאפונין לתרחיף התא היא חיונית, אחרת הנוגדנים אינם יכולים להגיע לאנטיגנים הפנימיים של התא ודטרגנטים קשים מובילים לאובדן אות C12-FTG הדמיה ציטומטריה אופטימלית לניתוח שינויים בלוקליזציה של סמנים כמו טרנסלוקציה של גורם שעתוק לגרעין בתגובה לגירויים מסוימים. ניתוח כזה יכול להיות מושגת גם עם הפרוטוקול שלנו. שיטה זו מאפשרת הדמיה של סמנים פלואורסצנטיים מרובים ברמה של תא יחיד המסייעת לזהות את הנוכחות, העוצמה והלוקליזציה של האותות הבודדים.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

סמים מבוססי Cytometry זרימה מערכת הסינון לצורך זיהוי מולקולות קטנות המקדמים התמיינות של תאי גזע גליובלסטומה

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

הדמיה עם מודאלים מרובים זוהרים, פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה/חישובית טומוגרפיה של מיאלומה נפוצה מח עצם Xenografts בעכברים ליקר ביצים

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

זיהוי של פרוטאז פעילות על-ידי ניאון פפטידים Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

זיהוי של התקדמות הגידול ריאה בעכברים על ידי הדמיה אולטרסאונד

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

ב Vivo מיקוד של תאים סרטניים אנושיים Xenografted עם חלקיקים פלורסנט פונקציונלי סיליקה ב דגי זברה

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescence הדמיה של נזק לדנ א ותיקון Foci בתאי סרטן המעי הגס האנושי

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated ÃƒÅ½Ã‚Â²-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

בדיקה פלואורסצנטית פלואורסצנטית β-גלקטוזידאז הקשורה לזיהוי והעשרה של תאי גידול סנסנטיים על ידי ציטומטריה של זרימה

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

מידול גרורות במוח על ידי הזרקת עורק הצוואר הפנימי של תאים סרטניים

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

בדיקת קשירה של חלבון פני התא המבוסס על ציטומטריה של זרימה להערכת סלקטיביות וספציפיות של אפטמר אנטי-סרטני

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

השתלה אורתוטופית של תאים סרטניים שמקורם בחולה בעכברים משחזרת סרטן מעי גס מתקדם

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...