Name: simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells
Uploaded: 2022-07-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells at JoVE.com

इस काम को जोहान्स केपलर यूनिवर्सिटी लिंज़ (बीईआरएम 16108001) से योंग यू को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

1. सेलुलर सेनेसेंस को प्रेरित करने के लिए मैफोस्फेमाइड या डौनोरुबिसिन उपचार के साथ डीएलबीसीएल सेल लाइनें
नोट: प्रोटोकॉल भी अनुयायी कैंसर कोशिकाओं के लिए काम करता है। सेल आकार के आधार प?...

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	<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essence+of+senescence.">The essence of senescence.</a> Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li><li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene-induced+senescence+is+a+DNA+damage+response+triggered+by+DNA+hyper-replication.">Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication.</a> Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).</li><li>Milanovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+reprogramming+promotes+cancer+stemness.">Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness.</a> Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).</li><li>Passos, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+between+p21+and+reactive+oxygen+production+is+necessary+for+cell+senescence.">Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence.</a> Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).</li><li>Lee, S., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+nature+of+senescence+in+cancer.">The dynamic nature of senescence in cancer.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).</li><li>Toussaint, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+premature+senescence+or+stress-induced+senescence-like+phenotype:+one+in+vivo+reality,+two+possible+definitions.">Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions.</a> The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).</li><li>Collado, M., Blasco, M. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmasking+senescence:+context-dependent+effects+of+SASP+in+cancer.">Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).</li><li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease:+from+mechanisms+to+therapy.">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li><li>Chandra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reorganization+of+the+nuclear+landscape+in+senescent+cells.">Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells.</a> Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).</li><li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+DNA+damage+signalling+triggers+senescence-associated+inflammatory+cytokine+secretion.">Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion.</a> Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9me3-mediated+epigenetic+regulation+of+senescence+in+mice+predicts+outcome+of+lymphoma+patients.">H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients.</a> Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).</li><li>Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+ageing:+from+mechanisms+to+therapeutic+opportunities.">Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).</li><li>Fan, D. N., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+markers+of+therapy-induced+senescence+in+cancer+cells.">Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).</li><li>Schmitt, C. A., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+and+chemoresistance+in+transgenic+cancer+models.">Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models.</a> Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).</li><li>Dorr, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethal+metabolic+targeting+of+cellular+senescence+in+cancer+therapy.">Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy.</a> Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).</li><li>Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxic+stress-induced+senescence.">Genotoxic stress-induced senescence.</a> Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).</li><li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts.">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li><li>Biran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+identification+of+senescent+cells+in+aging+and+disease.">Quantitative identification of senescent cells in aging and disease.</a> Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).</li><li>Rossi, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+senescent+surface+biomarkers+as+senotherapeutic+targets.">The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets.</a> Cells. 10 (7), 1740 (2021).</li><li>Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo.">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li></ol>

इस पद्धति ने उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग और प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित मात्रा का ठहराव के साथ कीमोथेरेपी उपचार पर चार अलग-अलग डीएलबीसीएल सेल लाइनों की सीनेसेंस-प्रवेश क्षमता की जांच की। एकल-कोशिका स्तर प...

विभिन्न प्रकार की उत्तेजनाएं सेलुलर सेनेसेंस को ट्रिगर कर सकती हैं, जिससे कोशिकाएं स्थिर सेल चक्र गिरफ्तारी की स्थिति में प्रवेश कर सकती हैं। इन उत्तेजनाओं में आंतरिक सिग्नलिंग परिवर्तन या बाहरी तनाव शामिल हैं। आंतरिक संकेतों में प्रगतिशील टेलोमेयर शॉर्टनिंग, टेलोमेयर संरचना में परिवर्तन, एपिजेनेटिक संशोधन, प्रोटियोस्टेसिस विकार, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन और ऑन्कोजीन की सक्रियता शामिल है। बाहरी तनाव में भड़काऊ और / या ऊतक क्षति संकेत, विकिरण या रासायनिक उपचार, और पोषण संबंधी अभाव 1,2,3,4 शामिल हैं। विभिन्न प्रकार के सेनेसेंस में, सबसे अधिक देखा और अच्छी तरह से अध्ययन किया जाता है प्रतिकृति सेनेसेंस, ऑन्कोजीन-प्रेरित सेनेसेंस (ओआईएस), विकिरण-प्रेरित सेनेसेंस और थेरेपी-प्रेरित सेनेसेंस (टीआईएस)। ओआईएस जीनोटॉक्सिक क्षति के लिए एक तीव्र सेलुलर प्रतिक्रिया है जो विचलित ऑन्कोजीन सक्रियण द्वारा उत्पन्न प्रतिकृति तनाव के कारण होती है और कुछ हद तक प्रीनोप्लास्टिक घाव से पूर्ण विकसित ट्यूमर तक रोग संबंधी प्रगति को रोक सकती है। टीआईएस तब होता है जब ट्यूमर कोशिकाओं को कीमोथेरेप्यूटिक दवाओं या आयनीकरण विकिरण 5,6 द्वारा जोर दिया जाता है।
सेनेसेंस को इसकी अत्यधिक गतिशील प्रकृति के कारण पैथोलॉजी में एक दोधारी तलवार माना जाता है। इसे शुरू में विभाजित कोशिकाओं के परिसंचारी पूल से क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को हटाने के लिए एक फायदेमंद ट्यूमर-दमनकारी तंत्र के रूप में वर्णित किया गया था, अंगों के सामान्य कार्य की रक्षा करना और ट्यूमर के विकास को 7,8,9 रोकना। हालांकि, उभरते सबूतों ने बुढ़ापे के एक अंधेरे पक्ष का सुझाव दिया है। सेनेसेंट कोशिकाएं प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स का स्राव करती हैं, जिसे सेनेसेंस से जुड़े स्रावी फेनोटाइप (एसएएसपी) के रूप में जाना जाता है, जिससे फाइब्रोसिस और खराब अंग होते हैं और ट्यूमर दीक्षा और प्रगति को बढ़ावामिलता है 10. इसके अलावा, सेनेसेंट कैंसर कोशिकाएं क्रोमैटिन रीमॉडेलिंग और निरंतर डीएनए-क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) 11,12 के सक्रियण के समानांतर एपिजेनेटिक और जीन-अभिव्यक्ति रीप्रोग्रामिंग से गुजरती हैं, नए कैंसर-स्टेम-सेल गुणों को प्राप्त करती हैं 3. यद्यपि सेनेसेंस-सक्षम ट्यूमर सेनेसेंस-असमर्थ लोगों की तुलना में चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए बेहतर प्रतिक्रिया देते हैं13, सेनेसेंट कोशिकाओं की दृढ़ता से खराब दीर्घकालिक रोग का निदान हो सकता है यदि उन्हें प्रभावी ढंग से पहचाना और सेनोलिटिक दवाओं द्वारा समाप्त नहीं किया जाता है5. किसी भी तरह से, बुढ़ापे का आकलन करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका महत्वपूर्ण नैदानिक रुचि का है, न केवल चिकित्सा उपचार के पूर्वानुमान के लिए बल्कि सेनेसेंट कोशिकाओं को लक्षित करने वाली उपन्यास रणनीतियों के विकास के लिए भी।
विभिन्न ट्रिगर्स के बावजूद, सेनेसेंट कोशिकाएं कुछ सामान्य विशेषताओं का प्रदर्शन करती हैं, जिनमें बड़े रिक्तिकाओं के साथ बढ़े हुए, चपटा, बहुआयामी आकृति विज्ञान, काफी विस्तारित नाभिक, नाभिक में एच 3 के 9 एम ई 3 समृद्ध सेनेसेंस से जुड़े हेटरोक्रोमैटिन (एसएएचएफ) का गठन, डीएनए क्षति मार्कर αH2AX फोसी का लगातार संचय, सक्रिय पी 53-पी21 सीआईपी 1 और आरबी-पी 16आईएनके 4 ए सेल चक्र नियामक तंत्र, स्थिर जी 1 सेल चक्र गिरफ्तारी, एसएएसपी के बड़े पैमाने पर प्रेरण, और ऊंचा सेनेसेंस से जुड़े β-गैलेक्टोसिडेस (एसए-β-गैल) गतिविधि14. चूंकि सीनेसेंस को परिभाषित करने के लिए कोई भी मार्कर पर्याप्त नहीं है, एसए-β-गैल गतिविधि के लिए एंजाइमेटिक धुंधला, जिसे सेनेसेंस डिटेक्शन के लिए स्वर्ण मानक माना जाता है, आमतौर पर टीआईएस15 का पता लगाने के लिए एच 3 के 9 एमई 3 और केआई 67 के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला के साथ जोड़ा जाता है। हालांकि, रासायनिक क्रोमोजेनिक-आधारित एसए-β-गैल को निर्धारित करना मुश्किल है। यहां, हमने 5-डोडेकानोइलामिनोफ्लोरेसिन-डि-β-डी-गैलेक्टोपिरानोसाइड (सी12एफडीजी) प्रतिदीप्ति-आधारित एसए-β-गैल (एफएसए-β-गैल) का पता लगाने के साथ γएच 2 एएक्स और ईडीयू-शामिल डीएनए के लिए इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला होने के साथ सी12एफडीजी + ईडीयू-एच 2 एएक्स + सेनेसेंट कोशिकाओं को जोड़ा यह विधि मानक पाइपलाइनों के निर्माण द्वारा कई नमूनों के तेजी से विश्लेषण को लाइसेंस देते हुए कोशिकाओं के भीतर फ्लोरोसेंट संकेतों की स्थिति और मात्रा का ठहराव की अनुमति देने वाली उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों की तेजी से पीढ़ी को सक्षम बनाती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>613407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>350509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-&#946;-D-Galactopyranoside)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11590276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroquin -diphosphat</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>C6628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser (Coulter Clenz)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C10418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daunorubicin</td>
			<td>Medchemexpress</td>
			<td>HY-13062A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler (70% Isopropanol)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.3704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis software (Amnis&#160;IDEAS&#160;6.3)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>CN-SW69-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument and imaging software (Amnis&#160;ImageStreamX&#160;Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>100220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KARPAS</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mafosfamide cyclohexylamine</td>
			<td>Niomech</td>
			<td>D-17272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCI-LY1</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11473704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG (2-Phenylethyl-&#946;-D-thiogalactosid)&#160;</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>P4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saponin</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBead Kit for ImageStream</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>400041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-DHL6</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSU-DLCL2</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 575</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells

कीमोथेरेप्यूटिक दवाएं कैंसर कोशिकाओं में अपूरणीय डीएनए क्षति को प्रेरित कर सकती हैं, जिससे एपोप्टोसिस या समय से पहले बुढ़ापा हो सकता है। एपोप्टोटिक कोशिका मृत्यु के विपरीत, वृद्धावस्था एक मौलिक रूप से अलग मशीनरी है जो कैंसर कोशिकाओं के प्रसार को रोकती है। दशकों के वैज्ञानिक अध्ययनों से ट्यूमर और माइक्रोएन्वायरमेंट में सेनेसेंट कैंसर कोशिकाओं के जटिल रोग संबंधी प्रभावों का पता चला है जो कैंसर कोशिकाओं और स्ट्रोमल कोशिकाओं को संशोधित करते हैं। नए सबूत बताते हैं कि कैंसर के उपचार के दौरान वृद्धावस्था एक शक्तिशाली पूर्वानुमान कारक है, और इसलिए कैंसर के नमूनों में वृद्ध कोशिकाओं का तेजी से और सटीक पता लगाना आवश्यक है। यह पेपर कैंसर कोशिकाओं में थेरेपी-प्रेरित सेनेसेंस (टीआईएस) की कल्पना और पता लगाने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। फैलाना बड़े बी-सेल लिंफोमा (डीएलबीसीएल) सेल लाइनों को माफोसफेमाइड (एमएएफ) या डौनोरुबिसिन (डीएन) के साथ इलाज किया गया था और सेनेसेंस मार्कर, सेनेसेंस से जुड़े β-गैलेक्टोसिडेस (एसए-β-गैल), डीएनए संश्लेषण मार्कर 5-एथिनाइल -2'-डीऑक्सीयूरिडीन (ईडीयू), और डीएनए क्षति मार्कर गामा-एच 2 ए के लिए जांच की गई थी। फ्लो साइटोमीटर इमेजिंग कैंसर कोशिकाओं में तीन मार्करों की एक साथ कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए थोड़े समय में उच्च-रिज़ॉल्यूशन एकल-सेल छवियों को उत्पन्न करने में मदद कर सकता है।

एकल-रंग नियंत्रण नमूनों के रिकॉर्ड किए गए डेटा को लोड करके छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एक मुआवजा मैट्रिक्स उत्पन्न किया गया था। जैसा कि पूरक चित्रा एस 1 में दिखाया गया है, ईडीयू से सी 12 ए?...

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Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

यहां हम एकल कोशिकाओं में कई सेनेसेंस से जुड़े मार्करों के दृश्य और मात्रा का ठहराव के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित विधि प्रस्तुत करते हैं।

थेरेपी-प्रेरित सेनेसेंट कैंसर कोशिकाओं में कई फ्लोरोसेंट सेनेसेंस मार्करों का एक साथ इमेजिंग और फ्लो-साइटोमेट्री-आधारित डिटेक्शन

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

यह विधि तेजी से उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियों को उत्पन्न कर सकती है जो कई नमूनों के तेजी से विश्लेषण की अनुमति देते हुए कोशिकाओं के भीतर फ्लोरोसेंट संकेतों के स्थानिक वितरण और मात्रा का ठहराव के विश्लेषण की अनुमति देती है। कोशिकाओं को उन्नत इमेजिंग प्रवाह साइटोमेट्री प्रणाली का उपयोग करके मापा जाता है, गति, संवेदनशीलता और विस्तृत एकल सेल छवियों को स्थानिक जानकारी के साथ अद्वितीय डेटा प्रदान किया जाता है जिसे प्रवाह ऑप्टोमेट्री या माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदान नहीं किया जा सकता है। एक महत्वपूर्ण सलाह साधन सेटिंग्स स्थापित करने के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को प्रदान करना है और हम माप के लिए उच्च घनत्व पर कोशिकाओं को निलंबित करते हैं।इसके अलावा डेटा अधिग्रहण सीधा और पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री के समान है। पहले पांडुलिपि में वर्णित डीएलबीसीएल सेल लाइनों को उत्पन्न करें। फिर डीएलबीसीएल सेल संस्कृति में एक से 1000 के अनुपात में 10 मिलीमोलर ईडीयू समाधान जोड़ें और कोमल रॉकिंग द्वारा प्लेट को मिलाने के बाद तीन घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में प्लेट को सेते हैं।इनक्यूबेशन के बाद प्लेट को बाहर निकालें और 75 माइक्रोमोलर की अंतिम एकाग्रता में 100 मिलीमोलर क्लोरोक्वीन समाधान जोड़ें। धीरे-धीरे रॉकिंग करके मिलाएं और 30 मिनट के लिए सेते हैं। फिर 20 माइक्रोमोलर की अंतिम एकाग्रता में 20 मिलीमोलर सी 12 एफडीजी समाधान जोड़ें।कोमल मिश्रण के बाद, प्लेट को एक घंटे के लिए सेते हैं जैसा कि पहले दिखाया गया था। इसके बाद, एफएसए बीटा-गैल धुंधला होने से रोकने के लिए एक से 50 पर 100 मिलीमोलर 2-फिनाइलेथिल-बीटा-डी-थियोगलैक्टोसाइड समाधान जोड़ें। और मिश्रण करने के लिए धीरे से प्लेट घुमाएं।कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूबों में स्थानांतरित करें और चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 100 गुना जी पर स्पिन करें। एक बार सतह पर तैरनेवाला त्याग दिया जाता है, पीबीएस के चार मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें और चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 100 गुना जी पर अपकेंद्रित्र। फिर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड निर्धारण समाधान पर 500 माइक्रोलीटर में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें।कमरे के तापमान पर 10 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए 250 गुना जी पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और दो बार पीबीएस के चार मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें और कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए 100 गुना जी पर अपकेंद्रित्र करें। धोने के बाद, सतह पर तैरनेवाला त्यागें और सैपोनिन पारगम्य बफर के 200 माइक्रोलीटर में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।अब निलंबन को एक नई 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए 250 गुना जी पर कोशिकाओं गोली। फिर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 200 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और अंधेरे में रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 250 बार जी पर ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और सैपोनिन धोने के समाधान के 100 माइक्रोलीटर के साथ धो लें। कोशिकाओं को दो बार धोने के बाद, सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ईडीयू डिटेक्शन कॉकटेल के 500 माइक्रोलीटर में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें।अंधेरे में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं और कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए 250 गुना जी पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और सैपोनिन धोने के समाधान के एक मिलीलीटर के साथ धो लें। धोने को दो बार दोहराएं, सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पीबीएस के 20 से 50 माइक्रोलीटर में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें।उपकरण को चालू करने से पहले, अपशिष्ट तरल पदार्थ की बोतल को खाली करें और स्पीडबीड्स, स्टेरिलाइज़र, क्लीनर, डीबबलर और म्यान पर्याप्त तरल पदार्थ के स्तर की जांच करें। साधन और इमेजिंग सॉफ़्टवेयर को चालू करने के बाद, तरल पदार्थ और सिस्टम अंशांकन शुरू करने के लिए स्टार्टअप बटन पर क्लिक करें। आवर्धन को 40 बार सेट करें और द्रव गति को कम पर सेट करें।लेजर पर स्विच करने के बाद, एडीयू पैसिफिक ब्लू को मापने के लिए 405 नैनोमीटर लेजर, सी 12-एफडीजी को मापने के लिए 488 नैनोमीटर और एलेक्सा-फ्लोर -647-गामा-एच 2 एएक्स को मापने के लिए 642 नैनोमीटर चालू करें। स्कैटर चैनल के लिए चैनल छह सेट करें, उज्ज्वल क्षेत्र के लिए चैनल एक और चैनल नौ। फिर लेजर की तीव्रता स्थापित करने के लिए उच्चतम प्रतिदीप्ति होने की उम्मीद वाले नमूने के साथ शुरू करें और मिश्रण करने के लिए नमूना ट्यूब को धीरे-धीरे फ्लिप करें।ट्यूब ढक्कन खोलने के बाद, गोदी पर नमूना ट्यूब डालें। एक स्कैटर प्लॉट शुरू करने और खोलने के लिए लोड पर क्लिक करें। अगला, सुविधाएँ क्षेत्र का चयन करें, एमओ 1 को रेखांकित करें और पहलू अनुपात क्रमशः एक्स और वाई अक्षों के लिए एमओ 1 को रेखांकित करते हैं।नीचे और दाईं ओर डबलेट्स और सेल समुच्चय और बाईं ओर स्पीडबीड आबादी को बाहर करने के लिए 0.5 के पहलू अनुपात के ऊपर एक गेट सेट करें। अब, हिस्टोग्राम प्लॉट खोलें और एक्स अक्ष के लिए मास्क एक और चैनल वन के फीचर ग्रेडिएंट रूट माध्य वर्ग का चयन करें। सिंगलेट आबादी चुनें और केंद्रित कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए गेट सेट करें।एक हिस्टोग्राम प्लॉट खोलें और एक्स अक्ष चैनल दो, सात और 11 के लिए कच्चे अधिकतम पिक्सेल तीव्रता का चयन करें। फिर चैनल दो, सात और 11 के लिए क्रमशः 488 नैनोमीटर, 405 नैनोमीटर और 642 नैनोमीटर लेजर की लेजर शक्तियों को समायोजित करें ताकि प्रत्येक फ्लोरोक्रोम में ओवरसैचुरेशन से बचने के लिए 100 और 4, 000 के बीच कच्चा अधिकतम पिक्सेल मूल्य हो। रिकॉर्ड करने के लिए केंद्रित आबादी चुनें और सुसंगत सेटिंग्स के साथ डीएलबीसीएल नमूनों को मापने के लिए अधिग्रहण पर क्लिक करें।माप के लिए नमूने बदलते समय, नमूना ट्यूब को पुनर्प्राप्त करने के लिए वापसी पर क्लिक करें। नमूना छोड़ने के लिए लोड दबाएँ। सभी नमूनों को मापने के बाद, उज्ज्वल क्षेत्र और स्कैटर लेजर को बंद कर दें।एक मुआवजा मैट्रिक्स उत्पन्न करने के लिए एकल रंग नियंत्रण नमूने मापें। इमेजिंग सिस्टम को बंद करने के लिए शटडाउन पर क्लिक करें। छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में डेटा का विश्लेषण करें।स्वचालित रूप से गिनती और परमाणु गामा H2AX foci और लाइव सेल छवियों की मात्रा निर्धारित करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के स्पॉट विज़ार्ड उपकरण का उपयोग करें। आगे स्वचालित स्पॉट काउंट विश्लेषण के लिए स्पॉट विज़ार्ड को प्रशिक्षित करने के लिए दो सेल आबादी का चयन करें, एक उच्च और कम स्पॉट काउंट के साथ एक। एकल कोशिका छवियों में प्रवाह साइटोमेट्री विधि ने सी 12-एफडीजी सकारात्मक, ईडीयू नकारात्मक, गामा एच 2 एएक्स सकारात्मक, सेनेसेस्ड आबादी और कार्पास 422 में वृद्धि दिखाई।डब्ल्यूएसयू-डीएलसीएल 2 और ओसीआई-एलवाई 1 कोशिकाएं, लेकिन एसयू-डीएचएल 6 कोशिकाओं में नहीं। इमेजिंग-आधारित विश्लेषण ने गामा एच 2 एएक्स फोकी और कार्पास 422, डब्ल्यूएसयू-डीएलसीएल 2 और ओसीआई-एलवाई 1 की काफी अधिक संख्या प्रस्तुत की, लेकिन एसयू-डीएचएल 6 कोशिकाओं में नहीं। इसी तरह के परिणामों को आवृत्ति और परिमाणीकरण डेटा द्वारा दर्शाया गया था।सेल निलंबन में सैपोनिन जोड़ना महत्वपूर्ण है, अन्यथा एंटीबॉडी सेल आंतरिक एंटीजन तक नहीं पहुंच सकते हैं और कठोर डिटर्जेंट सी 12-एफटीजी सिग्नल के नुकसान का कारण बनते हैं इमेजिंग साइटोमेट्री मार्कर स्थानीयकरण में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए इष्टतम है जैसे कुछ उत्तेजनाओं के जवाब में नाभिक में प्रतिलेखन कारक का अनुवाद। इस तरह के विश्लेषण को हमारे प्रोटोकॉल के साथ भी प्राप्त किया जा सकता है। यह विधि एकल-कोशिका स्तर पर कई फ्लोरोसेंट मार्करों के दृश्य की अनुमति देती है जो व्यक्तिगत संकेतों की उपस्थिति, तीव्रता और स्थानीयकरण का पता लगाने में मदद करती है।

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम कोशिकाओं के सेलुलर भेदभाव को बढ़ावा देने कि छोटे अणुओं की पहचान के लिए प्रवाह Cytometry आधारित दवा स्क्रीनिंग प्रणाली

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

Multimodal Bioluminescent और Positronic-उत्सर्जन टोमोग्राफी/Xenografts चूहों में एकाधिक मायलोमा अस्थि मज्जा नोग की गणना टोमोग्राफी इमेजिंग

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

फ्लोरोसेंट पेप्टाइड Zymography द्वारा चिढ़ा गतिविधि का पता लगाने

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

अल्ट्रासाउंड इमेजिंग द्वारा चूहों में फेफड़ों के ट्यूमर प्रगति का पता लगाना

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

वीवो में ज़ेब्राफ़िश में कार्यात्मक फ्लोरोसेंट सिलिका नैनोकणों के साथ Xenografted मानव कैंसर कोशिकाओं का लक्ष्यीकरण

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

मानव पेट के कैंसर कोशिकाओं में डीएनए क्षति और मरम्मत Foci के इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated ÃƒÅ½Ã‚Â²-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सेनेसेंट ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान और संवर्धन के लिए फार-रेड फ्लोरोसेंट सेनेसेंस-संबद्ध β-गैलेक्टोसिडेस जांच

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

कैंसर कोशिकाओं के आंतरिक कैरोटिड धमनी इंजेक्शन द्वारा मस्तिष्क मेटास्टेसिस मॉडलिंग

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

एंटीकैंसर एपटामर की चयनात्मकता और विशिष्टता का आकलन करने के लिए एक फ्लो साइटोमेट्री-आधारित सेल सरफेस प्रोटीन बाइंडिंग परख

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

चूहों में रोगी-व्युत्पन्न कैंसर कोशिकाओं का ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण उन्नत कोलोरेक्टल कैंसर को पुन: उत्पन्न करता है

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...