Name: simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells
Uploaded: 2022-07-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av et stipend til Yong Yu fra Johannes Kepler University Linz (BERM16108001).

1. DLBCL-cellelinjer med mafosfamid- eller daunorubicinbehandling for å indusere cellulær senescens
MERK: Protokollen fungerer også for adherent kreftceller. Avhengig av cellestørrelse, frø 1-2 × 105 celler i en brønn av en 6-brønns plate og inkuberer platen i en 5% CO2, 37 ° C inkubator over natten før behandling. Protokolltrinnene er de samme som for suspensjonsceller, men med to unntak. Først må cellene trypsiniseres av platen etter trinn 3.4...

<ol>
	<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essence+of+senescence.">The essence of senescence.</a> Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li><li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene-induced+senescence+is+a+DNA+damage+response+triggered+by+DNA+hyper-replication.">Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication.</a> Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).</li><li>Milanovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+reprogramming+promotes+cancer+stemness.">Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness.</a> Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).</li><li>Passos, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+between+p21+and+reactive+oxygen+production+is+necessary+for+cell+senescence.">Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence.</a> Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).</li><li>Lee, S., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+nature+of+senescence+in+cancer.">The dynamic nature of senescence in cancer.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).</li><li>Toussaint, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+premature+senescence+or+stress-induced+senescence-like+phenotype:+one+in+vivo+reality,+two+possible+definitions.">Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions.</a> The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).</li><li>Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+cancer+and+aging.">Cellular senescence in cancer and aging.</a> Cell. 130 (2), 223-233 (2007).</li><li>Munoz-Espin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+senescence+during+mammalian+embryonic+development.">Programmed cell senescence during mammalian embryonic development.</a> Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).</li><li>Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmasking+senescence:+context-dependent+effects+of+SASP+in+cancer.">Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).</li><li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease:+from+mechanisms+to+therapy.">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li><li>Chandra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reorganization+of+the+nuclear+landscape+in+senescent+cells.">Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells.</a> Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).</li><li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+DNA+damage+signalling+triggers+senescence-associated+inflammatory+cytokine+secretion.">Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion.</a> Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9me3-mediated+epigenetic+regulation+of+senescence+in+mice+predicts+outcome+of+lymphoma+patients.">H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients.</a> Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).</li><li>Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+ageing:+from+mechanisms+to+therapeutic+opportunities.">Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).</li><li>Fan, D. N., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+markers+of+therapy-induced+senescence+in+cancer+cells.">Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).</li><li>Schmitt, C. A., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+and+chemoresistance+in+transgenic+cancer+models.">Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models.</a> Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).</li><li>Dorr, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethal+metabolic+targeting+of+cellular+senescence+in+cancer+therapy.">Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy.</a> Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).</li><li>Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxic+stress-induced+senescence.">Genotoxic stress-induced senescence.</a> Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).</li><li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts.">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li><li>Biran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+identification+of+senescent+cells+in+aging+and+disease.">Quantitative identification of senescent cells in aging and disease.</a> Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).</li><li>Rossi, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+senescent+surface+biomarkers+as+senotherapeutic+targets.">The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets.</a> Cells. 10 (7), 1740 (2021).</li><li>Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo.">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li></ol>

Denne metoden undersøkte senescens-entering-evnen til fire forskjellige DLBCL-cellelinjer ved kjemoterapibehandling, med lysfeltavbildning og flowcytometribasert kvantifisering. På enkeltcellenivå påviste vi store C12FDG+EdU-Ki67+senescentpopulasjoner i behandlede KARPAS422- og WSU-DLCL2-celler, og i mindre grad i OCI-LY1-celler, mens SU-DHL6-cellelinjen var resistent mot behandlingen. Forskjellen i senescens-entering evne blant cellelinjer kan forklares av deres distinkte ...

En rekke stimuli kan utløse cellulær senescens, noe som får celler til å gå inn i en tilstand av stabil cellesyklusarrest. Disse stimuli inkluderer inneboende signalendringer eller ekstrinsiske påkjenninger. Intrinsiske signaler inkluderer progressiv telomerforkortelse, endringer i telomerstruktur, epigenetisk modifikasjon, proteostaseforstyrrelser, mitokondriell dysfunksjon og aktivering av onkogener. Ytre påkjenninger inkluderer betennelses- og/eller vevsskadesignaler, stråling eller kjemisk behandling, og næringsdeprivasjon 1,2,3,4. Blant forskjellige typer senescens er de mest sett og godt studerte replikativ senescens, onkogenindusert senescens (OIS), strålingsindusert senescens og terapi-indusert senescens (TIS). OIS er en akutt cellulær respons på gentoksisk skade forårsaket av replikativt stress generert av avvikende onkogenaktivering og kan til en viss grad forhindre den patologiske progresjonen fra en preneoplastisk lesjon til en fullblåst tumor. TIS skjer når tumorceller blir stresset av kjemoterapeutiske legemidler eller ioniserende stråling 5,6.
Senescence regnes som et tveegget sverd i patologi på grunn av sin svært dynamiske natur. Det ble opprinnelig beskrevet som en gunstig tumorundertrykkende mekanisme for å fjerne skadede celler fra det sirkulerende bassenget av delende celler, beskytte organets normale funksjon og hemme tumorvekst 7,8,9. Imidlertid har nye bevis antydet en mørk side av senescence. Senescentceller utskiller proinflammatoriske cytokiner, kjent som senescensassosiert sekretorisk fenotype (SASP), noe som fører til fibrose og funksjonsfeil organer og fremmer tumorinitiering og progresjon10. Videre gjennomgår senescent kreftceller epigenetisk og genuttrykksreprogrammering parallelt med kromatinremodellering og aktivering av en vedvarende DNA-skaderespons (DDR)11,12, nyinnkjøp av nye kreftstamcelleegenskaper3. Selv om senescens-kompatible svulster reagerer bedre på terapeutisk intervensjon sammenlignet med senescence-incapable de13, kan persistensen av senescentceller føre til en dårlig langsiktig prognose hvis de ikke effektivt identifiseres og elimineres av senolytiske legemidler5. Uansett er en pålitelig metode for å vurdere senescens av betydelig klinisk interesse, ikke bare for prognosen for terapibehandling, men også for utvikling av nye strategier rettet mot senescentceller.
Uavhengig av forskjellige utløsere, viser senescentceller noen vanlige trekk, inkludert forstørret, flatt, multinukleær morfologi med store vakuoler, signifikant utvidede kjerner, dannelse av H3K9me3-rik senescensassosiert heterokromatin (SAHF) i kjernen, vedvarende akkumulering av DNA-skademarkør γH2AX foci, aktivert p53-p21CIP1 og Rb-p16INK4a cellesyklusreguleringsmekanismer, stabil G1-cellesyklusarrest, massiv induksjon av SASP og forhøyet senescensassosiert β-galaktosidase (SA-β-gal) aktivitet14. Siden ingen enkelt markør er tilstrekkelig til å definere senescens, kombineres enzymatisk farging for SA-β-gal-aktivitet, som regnes som gullstandarden for senescensdeteksjon, vanligvis med immunhistokjemisk farging for H3K9me3 og Ki67 for å oppdage TIS15. Kjemisk kromogenbasert SA-β-gal er imidlertid vanskelig å kvantifisere. Her kombinerte vi 5-dodekanoylaminofluorescein-di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) fluorescensbasert SA-β-gal (fSA-β-gal) deteksjon med immunfluorescerende farging for γH2AX og EdU-inkorporert DNA for å identifisere C12FDG + EdU-γH2AX + senescentceller ved hjelp av det avanserte imaging flow cytometer-systemet, som kombinerer hastighet, følsomhet og detaljerte enkeltcellebilder med romlig informasjon som ikke kan leveres ved flowcytometri og mikroskopi. Denne metoden muliggjør rask generering av høyoppløselige bilder som muliggjør posisjonering og kvantifisering av fluorescerende signaler i celler, samtidig som den lisensierer rask analyse av flere prøver ved å bygge standard rørledninger.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>613407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>350509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-&#946;-D-Galactopyranoside)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11590276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroquin -diphosphat</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>C6628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser (Coulter Clenz)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C10418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daunorubicin</td>
			<td>Medchemexpress</td>
			<td>HY-13062A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler (70% Isopropanol)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.3704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis software (Amnis&#160;IDEAS&#160;6.3)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>CN-SW69-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument and imaging software (Amnis&#160;ImageStreamX&#160;Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>100220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KARPAS</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mafosfamide cyclohexylamine</td>
			<td>Niomech</td>
			<td>D-17272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCI-LY1</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11473704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG (2-Phenylethyl-&#946;-D-thiogalactosid)&#160;</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>P4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saponin</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBead Kit for ImageStream</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>400041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-DHL6</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSU-DLCL2</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 575</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells

Kjemoterapeutiske legemidler kan indusere uopprettelig DNA-skade i kreftceller, noe som fører til apoptose eller for tidlig senescens. I motsetning til apoptotisk celledød, er senescence et fundamentalt annet maskineri som begrenser forplantning av kreftceller. Tiår med vitenskapelige studier har avslørt de komplekse patologiske effektene av senescent kreftceller i svulster og mikromiljøer som modulerer kreftceller og stromale celler. Nye bevis tyder på at senescens er en potent prognostisk faktor under kreftbehandling, og derfor er rask og nøyaktig påvisning av senescentceller i kreftprøver avgjørende. Denne artikkelen presenterer en metode for å visualisere og oppdage terapiindusert senescens (TIS) i kreftceller. Diffuse store B-cellelymfom (DLBCL) cellelinjer ble behandlet med mafosfamid (MAF) eller daunorubicin (DN) og undersøkt for senescensmarkør, senescensassosiert β-galaktosidase (SA-β-gal), DNA-syntesemarkør 5-ethynyl-2′-deoksyuridin (EdU) og DNA-skademarkør gamma-H2AX (γH2AX). Flowcytometeravbildning kan bidra til å generere høyoppløselige enkeltcellebilder på kort tid for samtidig å visualisere og kvantifisere de tre markørene i kreftceller.

En kompensasjonsmatrise ble generert ved hjelp av bildeanalyseprogramvare ved å laste inn registrerte data fra enkeltfargekontrollprøver. Som vist i supplerende figur S1 ble det påvist en ikke-neglisjerbar (koeffisientverdi ≥ 0,1) lysoverløp fra EdU til C12FDG med crosstalk-koeffisientverdi 0,248, mens crosstalk blant andre kanaler ikke var signifikant. Fire forskjellige DLBCL-cellelinjer ble behandlet med 5 μg / ml MAF eller 20 ng / ml DN for å indusere cellulær senescens og analyser...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells at JoVE.com

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Her presenterer vi en flowcytometribasert metode for visualisering og kvantifisering av multiple senescensassosierte markører i enkeltceller.

Samtidig avbildning og flowcytometribasert påvisning av flere fluorescerende senescensmarkører i terapiinduserte senescent kreftceller

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

Denne metoden kan raskt generere bilder med høy oppløsning som tillater en analyse av romlig fordeling og kvantifisering av fluorescerende signaler i celler, samtidig som den tillater rask analyse av flere prøver. Celler måles ved hjelp av det avanserte bildeflytcytometrisystemet, som kombinerer hastighet, følsomhet og detaljerte enkeltcellebilder med romlig informasjon som gir unike data som ikke kan leveres av flytoptometri eller mikroskopi. Et viktig råd er å skaffe nok celler til å etablere instrumentinnstillingene, og vi suspenderer cellene med høy tetthet for målingene.Bortsett fra dette er datainnsamlingen enkel og lik konvensjonell flowcytometri. Først genererer DLBCL-cellelinjene som beskrevet i manuskriptet. Tilsett deretter 10 millimolar EdU-løsning i forholdet en til 1000 i DLBCL-cellekulturen og inkuber platen i en 5% karbondioksidinkubator ved 37 grader Celsius i tre timer etter blanding av platen ved forsiktig rocking.Ta platen ut etter inkubering og tilsett 100 millimolar klorokinoppløsning til en endelig konsentrasjon på 75 mikromolar. Bland ved å gynge forsiktig og ruge i 30 minutter. Tilsett deretter 20 millimolar C12 FDG-løsninger til en endelig konsentrasjon på 20 mikromolar.Etter forsiktig blanding, inkuber platen i en time som vist tidligere. Deretter tilsettes 100 millimolar 2-fenyletyl-beta-d-tiogalalaktosidløsning på en til 50 for å stoppe FSA beta-gal-farging. Og roter platen forsiktig for å blande.Overfør cellene til 15 milliliter sterile sentrifugerør og spinn ved 100 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius. Når supernatanten er kassert, vask cellene med fire milliliter PBS og sentrifuger ved 100 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius. Deretter suspenderes cellepellets i 500 mikroliter ved 4% paraformaldehydfikseringsløsning.Etter 10 minutters inkubasjon ved romtemperatur, sentrifuge ved 250 ganger G i fem minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten og vask cellene med fire milliliter PBS to ganger og sentrifuge ved 100 ganger G i fem minutter ved romtemperatur. Etter vask, kast supernatanten og suspender cellepelleten på nytt i 200 mikroliter saponinpermeabiliseringsbuffer.Overfør nå suspensjonen til et nytt 1,5 milliliter rør og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur. Pellet cellene ved 250 ganger G i fem minutter ved romtemperatur. Deretter suspenderer cellene i 200 mikroliter primær antistoffoppløsning og inkuberer ved fire grader Celsius over natten, i mørket.Sentrifuge rørene ved 250 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius. Kast supernatanten og vask med 100 mikroliter saponinvaskeoppløsning. Etter å ha vasket cellene to ganger, kast supernatanten og suspender cellepellets på nytt i 500 mikroliter EdU-deteksjonscocktail.Inkuber ved romtemperatur i 30 minutter i mørket og sentrifugen ved 250 ganger G i fem minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten og vask med en milliliter saponinvaskeoppløsning. Gjenta vasken to ganger, kast supernatanten og suspender cellepellets i 20 til 50 mikroliter PBS.Før du slår på instrumentet, tøm avfallsvæskeflasken og kontroller nivåene av SpeedBeads, sterilisator, renere, debubbler og skjede tilstrekkelig væske. Etter at du har slått på instrumentet og bildebehandlingsprogramvaren, klikker du på oppstartsknappen for å initialisere fluidikk og systemkalibrering. Sett forstørrelsen til 40 ganger og sett væskehastigheten til lav.Etter at du har slått på laserne, slår du på en 405 nanometer laser for å måle EdU Pacific Blue, 488 nanometer for å måle C12-FDG og 642 nanometer for å måle Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX. Angi kanal seks for spredningskanalen, kanal én og kanal ni for det lyse feltet. Start deretter med prøven som forventes å ha den høyeste fluorescensen for å sette opp intensiteten til laserne og snu prøverøret forsiktig for å blande.Etter å ha åpnet rørlokket, sett prøverøret på kaien. Klikk på Last inn for å starte og åpne et scatter-plott. Velg deretter Funksjoner-området, understrek MO1 og størrelsesforholdet understreker MO1 for henholdsvis X- og Y-aksen.Angi en port over størrelsesforhold på 0,5 for å ekskludere dubletter og celleaggregater under og på høyre side og SpeedBead-populasjonen på venstre side. Nå åpner du Histogram Plot og velger funksjonsgradientroten betyr kvadrat av maske en og kanal en for X-aksen. Velg singletpopulasjonen og sett porten til å velge for fokuserte celler.Åpne et histogramplott, og velg rå maksimale bildepunktintensiteter for X-aksekanal to, sju og 11. Juster deretter lasereffektene på 488 nanometer, 405 nanometer og 642 nanometer lasere for kanal to, syv og 11 henholdsvis, slik at hver fluorokrom har en rå maks pikselverdi mellom 100 og 4.000 for å unngå overmetning. Velg den fokuserte populasjonen du vil registrere, og klikk på Hent for å måle DLBCL-prøvene med konsekvente innstillinger.Når du endrer prøver for måling, klikker du på retur for å gjenopprette prøverøret. Trykk Last inn for å forkaste prøven. Etter at alle prøvene er målt, slå av lysfelt- og spredningslaseren.Mål enkeltfargekontrolleksempler for å generere en kompensasjonsmatrise. Klikk på Shutdown for å lukke bildesystemet. Analyser dataene i bildeanalyseprogramvaren.Bruk spotveiviserverktøyet i bildeanalyseprogramvaren til automatisk å telle og kvantifisere kjernefysisk gamma H2AX-fokus og levende cellebilder. Velg to cellepopulasjoner, en med høy og en med lavt spotantall for å lære opp spotveiviseren for videre automatisk spottellingsanalyse. Flowcytometrimetoden i enkeltcellebilder viste økt C12-FDG-positiv, EdU-negativ, gamma H2AX-positiv, senesced populasjon og KARPAS422.WSU-DLCL2- og OCI-LY1-celler, men ikke i SU-DHL6-celler. Den bildebaserte analysen presenterte signifikant høyere antall gamma H2AX-foci og KARPAS422, WSU-DLCL2 og OCI-LY1, men ikke i SU-DHL6-celler. Lignende resultater ble representert av frekvens- og kvantifiseringsdata.Tilsetning av saponin til cellesuspensjonen er avgjørende, ellers kan antistoffene ikke nå cellens interne antigener og sterke vaskemidler fører til tap av C12-FTG-signal Imaging cytometri er optimal for å analysere endringer i markørlokalisering som translokasjon av en transkripsjonsfaktor til kjernen som respons på visse stimuli. En slik analyse kan også oppnås med vår protokoll. Denne metoden gjør det mulig å visualisere flere fluorescerende markører på enkeltcellenivå som bidrar til å oppdage tilstedeværelse, intensitet og lokalisering av de enkelte signalene.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Flow cytometri-baserte narkotika Screening System for identifisering av små molekyler som fremmer differensiering av glioblastom stilk celler

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

Flere Bioluminescent og Positronic-utslipp tomografi/beregningsorientert tomografi avbilding av myelom benmarg Xenografts i NOG mus

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Påvisning av Protease aktivitet av fluorescerende peptid Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Påvisning av lungetumorprogresjon hos mus ved ultralydavbildning

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

In Vivo Målretting av Xenografted Human Cancer Celler med funksjonalisert fluorescerende silika nanopartikler i sebrafisk

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescens Avbildning av DNA-skade og reparasjon av foci i humane tykktarmskreftceller

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated ÃƒÅ½Ã‚Â²-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Far-Red Fluorescerende Senescence-Associated β-Galactosidase Probe for identifisering og anrikning av Senescent tumorceller ved flowcytometri

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Modellering av hjernemetastase ved intern karotisarterieinjeksjon av kreftceller

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

En flowcytometribasert proteinbindingsanalyse for celleoverflate for å vurdere selektivitet og spesifisitet av en anticancer aptamer

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Ortotopisk implantasjon av pasientavledede kreftceller hos mus rekapitulerer avansert kolorektal kreft

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...