Name: simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells
Uploaded: 2022-07-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa para Yong Yu da Universidade Johannes Kepler Linz (BERM16108001).

1. Linhas celulares DLBCL com tratamento de mafosfamida ou daunorubicina para induzir senescência celular
NOTA: O protocolo também funciona para células cancerígenas aderentes. Dependendo do tamanho da célula, a semente 1-2 × 105 células em um poço de uma placa de 6 poços e incubar a placa em uma incubadora de 5% de CO2, 37 °C durante a noite antes do tratamento. As etapas do protocolo são as mesmas das células de suspensão, mas com duas exceç...

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	<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethal+metabolic+targeting+of+cellular+senescence+in+cancer+therapy.">Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy.</a> Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).</li><li>Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxic+stress-induced+senescence.">Genotoxic stress-induced senescence.</a> Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).</li><li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts.">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li><li>Biran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+identification+of+senescent+cells+in+aging+and+disease.">Quantitative identification of senescent cells in aging and disease.</a> Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).</li><li>Rossi, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+senescent+surface+biomarkers+as+senotherapeutic+targets.">The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets.</a> Cells. 10 (7), 1740 (2021).</li><li>Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo.">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li></ol>

Este método examinou a capacidade de entrada de senescência de quatro diferentes linhas celulares DLBCL após o tratamento quimioterápico, com imagem de campo brilhante e quantificação baseada em citometria de fluxo. Em um nível unicelular, detectamos com sucesso populações senescentes C12FDG+EdU-Ki67+ em células KARPAS422 e WSU-DLCL2 tratadas, e em menor grau nas células OCI-LY1, enquanto a linha celular SU-DHL6 era resistente ao tratamento. A diferença na capacidad...

Uma variedade de estímulos pode desencadear senescência celular, fazendo com que as células entrem em um estado de parada estável do ciclo celular. Esses estímulos incluem alterações intrínsecas de sinalização ou tensões extrínsecas. Sinais intrínsecos incluem encurtamento progressivo do telômero, alterações na estrutura do telômero, modificação epigenética, distúrbios da proteostase, disfunção mitocondrial e ativação de oncogênicos. As tensões extrínsecas incluem sinais inflamatórios e/ou de danos teciduais, radiação ou tratamento químico e privação nutricional 1,2,3,4. Entre os tipos distintos de senescência, os mais comumente vistos e bem estudados são senescência replicativa, senescência induzida por oncogênico (OIS), senescência induzida por radiação e senescência induzida pela terapia (IS). OIS é uma resposta celular aguda aos danos genotoxicos causados pelo estresse replicativo gerado pela ativação do oncogene aberrante e pode, em certa medida, impedir a progressão patológica de uma lesão pré-inoplástica para um tumor completo. O TIS acontece quando as células tumorais são estressadas por drogas quimioterápicas ou radiação ionizante 5,6.
Senescência é considerada uma espada de dois gumes em patologia devido à sua natureza altamente dinâmica. Foi inicialmente descrito como um mecanismo benéfico para remover células danificadas da piscina circulante de células divisórias, salvaguardando a função normal dos órgãos e inibindo o crescimento do tumor 7,8,9. No entanto, evidências emergentes sugerem um lado negro da senescência. As células senescentes secretam citocinas proinflamatórias, conhecidas como fenótipo secreto associado à senescência (SASP), levando à fibrose e órgãos defeituosos e promovendo a iniciação e progressão do tumor10. Além disso, as células cancerígenas senescentes passam por reprogramação epigenética e de expressão genética em paralelo com a remodelação da cromatina e ativação de uma resposta sustentada de danos de DNA (DDR)11,12, recém-adquirindo novas propriedades de células-troncocancerosas 3. Embora os tumores capazes de senescência respondam melhor à intervenção terapêutica em comparação com os indeferidores de senescência13, a persistência das células senescentes pode levar a um prognóstico de longo prazo ruim se não forem efetivamente identificados e eliminados por drogas senolíticas5. De qualquer forma, um método confiável para avaliar a senescência é de interesse clínico significativo, não apenas para o prognóstico do tratamento terapêutico, mas também para o desenvolvimento de novas estratégias voltadas para células senescentes.
Independentemente de diferentes gatilhos, as células senescentes apresentam algumas características comuns, incluindo morfologia ampliada, achatada, multinucleada com grandes vacúolos, núcleos significativamente expandidos, formação de heterocromatina associada à senescência h3K9me3 (SAHF) no núcleo, acúmulo persistente de focos de dano de DNA γH2AX, ativação p53-p21CIP1 e RB-p16INK mecanismos regulatórios do ciclo celular, detenção estável do ciclo celular G1, indução maciça de SASP e atividade de β-galactosidase associada à senescência elevada (SA-β-gal)atividade 14. Uma vez que nenhum marcador único é suficiente para definir senescência, a coloração enzimática para a atividade SA-β-gal, que é considerada o padrão ouro para detecção de senescência, é geralmente combinada com coloração imunohistoquímica para H3K9me3 e Ki67 para detectar TIS15. No entanto, a sa-β-gal de base cromogênica química é difícil de quantificar. Aqui, combinamos 5-dodecanoylaminofluoresceín-di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) baseado em fluorescência SA-β-gal (fSA-β tecção de imunofluorescentes para γH2AX e DNA incorporado edu para identificar células senescentes C12FDG+EdU-ΓH2AX+ usando o sistema avançado de citômetro de fluxo de imagem, que combina a velocidade, sensibilidade e imagens detalhadas unicelulares com informações espaciais que não podem ser fornecidas por citometria de fluxo e microscopia. Este método permite a rápida geração de imagens de alta resolução permitindo o posicionamento e quantificação de sinais fluorescentes dentro das células, ao mesmo tempo em que licencia a análise rápida de várias amostras através da construção de dutos padrão.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>613407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>350509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-&#946;-D-Galactopyranoside)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11590276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroquin -diphosphat</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>C6628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser (Coulter Clenz)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C10418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daunorubicin</td>
			<td>Medchemexpress</td>
			<td>HY-13062A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler (70% Isopropanol)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.3704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis software (Amnis&#160;IDEAS&#160;6.3)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>CN-SW69-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument and imaging software (Amnis&#160;ImageStreamX&#160;Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>100220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KARPAS</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mafosfamide cyclohexylamine</td>
			<td>Niomech</td>
			<td>D-17272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCI-LY1</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11473704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG (2-Phenylethyl-&#946;-D-thiogalactosid)&#160;</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>P4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saponin</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBead Kit for ImageStream</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>400041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-DHL6</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSU-DLCL2</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 575</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells

Drogas quimioterápicas podem induzir danos irreparáveis de DNA em células cancerosas, levando à apoptose ou senescência prematura. Ao contrário da morte celular apoptótica, a senescência é uma máquina fundamentalmente diferente que restringe a propagação de células cancerígenas. Décadas de estudos científicos revelaram os efeitos patológicos complexos das células cancerígenas senescentes em tumores e microambientes que modulam células cancerígenas e células estromais. Novas evidências sugerem que a senescência é um fator prognóstico potente durante o tratamento do câncer e, portanto, a detecção rápida e precisa de células senescentes em amostras de câncer é essencial. Este artigo apresenta um método para visualizar e detectar senescência induzida por terapia (TIS) em células cancerosas. Linhas celulares difusas de grandes células B (DLBCL) foram tratadas com mafosfamida (MAF) ou daunorubicina (DN) e examinadas para o marcador de senescência, β-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal), o marcador de síntese de DNA 5-ethynyl-2′-desoxyuridina (EdU), e o marcador de dano de DNA gama-H2AX (γH2AX). A imagem do citómetro de fluxo pode ajudar a gerar imagens unicelulares de alta resolução em um curto período de tempo para visualizar e quantificar simultaneamente os três marcadores em células cancerosas.

Uma matriz de compensação foi gerada por meio de software de análise de imagem, carregando dados gravados de amostras de controle de cor única. Como mostrado na Figura Suplementar S1, foi detectado um derramamento de luz não desprezível (coeficiente ≥ 0,1) de EdU para C12FDG com valor de coeficiente de crosstalk 0,248, enquanto o crosstalk entre outros canais não foi significativo. Quatro diferentes linhas celulares DLBCL foram tratadas com 5 μg/mL MAF ou 20 ng/mL DN para induzir sen...

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Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Aqui apresentamos um método baseado em citometria de fluxo para visualização e quantificação de marcadores associados à senescência múltipla em células únicas.

Detecção simultânea baseada em imagens e flutometria de marcadores de senescência fluorescentes múltiplas em células cancerígenas senescentes induzidas por terapia

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

Este método pode gerar rapidamente imagens de alta resolução que permitem uma análise da distribuição espacial e quantificação de sinais fluorescentes dentro das células, permitindo a análise rápida de múltiplas amostras. As células são medidas usando o sistema avançado de citometria de fluxo de imagem, combinando velocidade, sensibilidade e imagens de célula única detalhada com informações espaciais que produzem dados únicos que não podem ser fornecidos por optometria ou microscopia de fluxos. Um conselho importante é fornecer células suficientes para estabelecer as configurações do instrumento e suspendemos as células na alta densidade para as medições.Além dessa aquisição de dados é simples e semelhante à citometria de fluxo convencional. Primeiro gerar as linhas celulares DLBCL como descrito no manuscrito. Em seguida, adicione 10 milimões de solução EdU a uma proporção de um a 1000 na cultura celular DLBCL e incubar a placa em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius por três horas depois de misturar a placa por balanço suave.Tire a placa após a incubação e adicione 100 milimonas de solução de cloroquina a uma concentração final de 75 micromolar. Misture balançando suavemente e incubar por 30 minutos. Em seguida, adicione 20 milimões C12 FDG soluções a uma concentração final de 20 micromolar.Após uma mistura suave, incubar a placa por uma hora como demonstrado anteriormente. Em seguida, adicione 100 milimilmolar 2-fenilethyl-beta-d-thiogalactoside solução em um a 50 para parar a mancha beta-gal FSA. E gire suavemente a placa para misturar.Transfira as células para tubos de centrífuga estéril de 15 mililitros e gire a 100 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Uma vez que o supernante é descartado, lave as células com quatro mililitros de PBS e centrífuga a 100 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, suspenda novamente as pelotas celulares em 500 microliters a 4% de solução de fixação de paraformaldeído.Após 10 minutos de incubação à temperatura ambiente, centrífuga a 250 vezes G durante cinco minutos em temperatura ambiente. Descarte o supernatante e lave as células com quatro mililitros de PBS duas vezes e centrífuga a 100 vezes G durante cinco minutos em temperatura ambiente. Após a lavagem, descarte o supernascer e suspenda a pelota celular em 200 microliters de tampão de permeabilização de saponina.Agora transfira a suspensão para um novo tubo de 1,5 mililitro e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Pelota as células a 250 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, suspenda novamente as células em 200 microlitres da solução primária de anticorpos e incubam a quatro graus Celsius durante a noite, no escuro.Centrifugar os tubos a 250 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e lave com 100 microliters de solução de lavagem de saponina. Depois de lavar as células duas vezes, descarte o sobrenante e suspenda as pelotas celulares em 500 microliters de coquetel de detecção de EdU.Incubar à temperatura ambiente por 30 minutos no escuro e centrífuga a 250 vezes G durante cinco minutos em temperatura ambiente. Descarte o supernatante e lave com um mililitro de solução de lavagem de saponina. Repita a lavagem duas vezes, descarte o supernascer e suspenda as pelotas celulares em 20 a 50 microliters de PBS.Antes de ligar o instrumento, esvazie a garrafa de fluido de resíduo e verifique os níveis de SpeedBeads, esterilizador, limpador, depurador e bainha suficientes. Depois de ligar o instrumento e o software de imagem, clique no botão de inicialização para inicializar fluidez e calibração do sistema. Defina a ampliação para 40 vezes e coloque a velocidade fluida em baixa.Depois de ligar os lasers, ligue um laser de 405 nanômetros para medir EdU Pacific Blue, 488 nanômetros para medir C12-FDG e 642 nanômetros para medir Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX. Defina o canal seis para o canal de dispersão, canal um e canal nove para o campo brilhante. Em seguida, comece com a amostra esperada para ter a maior fluorescência para configurar a intensidade dos lasers e gentilmente virar o tubo de amostra para misturar.Depois de abrir a tampa do tubo, insira o tubo de amostra na doca. Clique em Carregar para iniciar e abrir um gráfico de dispersão. Em seguida, selecione a área características, enfatize MO1 e a proporção enfatize MO1 para os eixos X e Y, respectivamente.Defina um portão acima da proporção de 0,5 para excluir doublets e agregados celulares abaixo e no lado direito e na população speedBead no lado esquerdo. Agora, abra o Plot histograma e selecione o quadrado médio de gradiente da máscara um e o canal um para o eixo X. Escolha a população singlet e defina o portão para selecionar para células focadas.Abra um gráfico de histograma e selecione intensidades de pixel máximos brutas para o eixo X canal dois, sete e 11. Em seguida, ajuste os poderes laser de 488 nanômetros, 405 nanômetros e 642 nanômetros lasers para o canal dois, sete e 11, respectivamente, para que cada fluorocromo tenha um valor máximo bruto de pixel entre 100 e 4.000 para evitar a supersaturação. Escolha a população focada para gravar e clicar em Adquirir para medir as amostras de DLBCL com configurações consistentes.Ao alterar amostras para medição, clique em retornar para recuperar o tubo de amostra. Pressione a carga para descartar a amostra. Depois que todas as amostras forem medidas, desligue o campo brilhante e espalhe o laser.Meça amostras de controle de cor única para gerar uma matriz de compensação. Clique em Shutdown para fechar o sistema de imagem. Analise os dados no software de análise de imagens.Use a ferramenta Spot Wizard do software de análise de imagens para contar e quantificar automaticamente os focos nucleares gama H2AX e imagens de células ao vivo. Selecione duas populações de células, uma com alta e outra com baixa contagem de pontos para treinar o Assistente spot para uma análise adicional automática da contagem de pontos. O método de citometria de fluxo em imagens unicelulares mostrou aumento do C12-FDG positivo, EdU negativo, gama H2AX positivo, população senesced e KARPAS422.Células WSU-DLCL2 e OCI-LY1, mas não em células SU-DHL6. A análise baseada em imagens apresentou números significativamente maiores de focos gama H2AX e KARPAS422, WSU-DLCL2 e OCI-LY1, mas não em células SU-DHL6. Resultados semelhantes foram representados por dados de frequência e quantificação.Adicionar saponina à suspensão celular é crucial, caso contrário, os anticorpos não podem atingir os antígenos internos da célula e detergentes severos levam à perda de sinal C12-FTG A citometria de imagem é ideal para analisar mudanças na localização do marcador, como a translocação de um fator de transcrição para o núcleo em resposta a certos estímulos. Tal análise também pode ser alcançada com nosso protocolo. Este método permite visualizar múltiplos marcadores fluorescentes em um nível unicelular que ajuda a detectar a presença, intensidade e localização dos sinais individuais.

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With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Fluorescente Sílica Nanopartículas em Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Imagens de imunofluorescência de dna dano e reparo de focos em células cancerígenas de cólon humano

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated ÃƒÅ½Ã‚Â²-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Sonda de β-Galactosidase Associada à Senescência Fluorescente Vermelha Distante para Identificação e Enriquecimento de Células Tumorais Senescentes por Citometria de Fluxo

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Modelagem de Metástases Cerebrais por Injeção de Células Cancerígenas na Artéria Carótida Interna

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

Um ensaio de ligação de proteínas de superfície celular baseado em citometria de fluxo para avaliar a seletividade e a especificidade de um Aptamer anticancerígeno

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Implante Ortotópico de Células Cancerosas Derivadas do Paciente em Camundongos Recapitula o Câncer Colorretal Avançado

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...