Name: simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells
Uploaded: 2022-07-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом Юн Ю от Университета Иоганна Кеплера в Линце (BERM16108001).

1. Клеточные линии DLBCL с лечением мафосфамидом или даунорубицином для индуцирования клеточного старения
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол также работает для адгезивных раковых клеток. В зависимости от размера клетки, семена 1-2 × 105 клеток в одну лунку из 6-луночной пласти...

<ol>
	<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essence+of+senescence.">The essence of senescence.</a> Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li><li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene-induced+senescence+is+a+DNA+damage+response+triggered+by+DNA+hyper-replication.">Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication.</a> Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).</li><li>Milanovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+reprogramming+promotes+cancer+stemness.">Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness.</a> Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).</li><li>Passos, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+between+p21+and+reactive+oxygen+production+is+necessary+for+cell+senescence.">Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence.</a> Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).</li><li>Lee, S., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+nature+of+senescence+in+cancer.">The dynamic nature of senescence in cancer.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).</li><li>Toussaint, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+premature+senescence+or+stress-induced+senescence-like+phenotype:+one+in+vivo+reality,+two+possible+definitions.">Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions.</a> The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).</li><li>Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+cancer+and+aging.">Cellular senescence in cancer and aging.</a> Cell. 130 (2), 223-233 (2007).</li><li>Munoz-Espin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+senescence+during+mammalian+embryonic+development.">Programmed cell senescence during mammalian embryonic development.</a> Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).</li><li>Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmasking+senescence:+context-dependent+effects+of+SASP+in+cancer.">Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).</li><li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease:+from+mechanisms+to+therapy.">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li><li>Chandra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reorganization+of+the+nuclear+landscape+in+senescent+cells.">Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells.</a> Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).</li><li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+DNA+damage+signalling+triggers+senescence-associated+inflammatory+cytokine+secretion.">Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion.</a> Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9me3-mediated+epigenetic+regulation+of+senescence+in+mice+predicts+outcome+of+lymphoma+patients.">H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients.</a> Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).</li><li>Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+ageing:+from+mechanisms+to+therapeutic+opportunities.">Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).</li><li>Fan, D. N., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+markers+of+therapy-induced+senescence+in+cancer+cells.">Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).</li><li>Schmitt, C. A., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+and+chemoresistance+in+transgenic+cancer+models.">Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models.</a> Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).</li><li>Dorr, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethal+metabolic+targeting+of+cellular+senescence+in+cancer+therapy.">Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy.</a> Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).</li><li>Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxic+stress-induced+senescence.">Genotoxic stress-induced senescence.</a> Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).</li><li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts.">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li><li>Biran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+identification+of+senescent+cells+in+aging+and+disease.">Quantitative identification of senescent cells in aging and disease.</a> Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).</li><li>Rossi, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+senescent+surface+biomarkers+as+senotherapeutic+targets.">The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets.</a> Cells. 10 (7), 1740 (2021).</li><li>Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo.">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li></ol>

Этот метод исследовал способность к проникновению в старение четырех различных клеточных линий DLBCL при химиотерапии с визуализацией яркого поля и количественной оценкой на основе проточной цитометрии. На одноклеточном уровне мы успешно обнаружили основные C12FDG + EdU-Ki67</sup...

Различные стимулы могут вызвать клеточное старение, заставляя клетки входить в состояние остановки стабильного клеточного цикла. Эти стимулы включают внутренние сигнальные изменения или внешние стрессы. Внутренние сигналы включают прогрессирующее укорочение теломер, изменения в структуре теломер, эпигенетическую модификацию, нарушения протеостаза, митохондриальную дисфункцию и активацию онкогенов. Внешние стрессы включают воспалительные сигналы и /или повреждения тканей, радиационную или химическую обработку и лишение питания 1,2,3,4. Среди различных типов старения наиболее часто наблюдаемыми и хорошо изученными являются репликативное старение, онкоген-индуцированное старение (OIS), радиационно-индуцированное старение и старение, вызванное терапией (TIS). ОИС является острым клеточным ответом на генотоксическое повреждение, вызванное репликативным стрессом, вызванным активацией аберрантного онкогена, и может в некоторой степени предотвратить патологическое прогрессирование от пренеопластического поражения до полномасштабной опухоли. ТИС возникает, когда опухолевые клетки подвергаются стрессу химиотерапевтическими препаратами или ионизирующим излучением 5,6.
Старение считается обоюдоострым мечом в патологии из-за его высокодинамичной природы. Первоначально он был описан как полезный опухолеподавляющий механизм для удаления поврежденных клеток из циркулирующего пула делящихся клеток, защищая нормальную функцию органов и ингибируя рост опухоли 7,8,9. Тем не менее, новые данные свидетельствуют о темной стороне старения. Стареющие клетки секретируют провоспалительные цитокины, известные как секреторный фенотип, ассоциированный со старением (SASP), что приводит к фиброзу и сбоям в работе органов и способствует инициации и прогрессированию опухоли10. Кроме того, стареющие раковые клетки подвергаются эпигенетическому и экспрессии генов перепрограммированию параллельно с ремоделированием хроматина и активацией устойчивого ответа на повреждение ДНК (DDR)11,12, вновь приобретая новые свойства раковых стволовых клеток3. Хотя опухоли, способные к старению, лучше реагируют на терапевтическое вмешательство по сравнению с опухолями, неспособными к старению13, персистенция стареющих клеток может привести к плохому долгосрочному прогнозу, если они не будут эффективно идентифицированы и устранены сенолитическими препаратами5. В любом случае, надежный метод оценки старения представляет значительный клинический интерес не только для прогноза терапевтического лечения, но и для разработки новых стратегий, нацеленных на стареющие клетки.
Независимо от различных триггеров, стареющие клетки проявляют некоторые общие черты, включая увеличенную, уплощенную, многоядерную морфологию с большими вакуолями, значительно расширенные ядра, образование H3K9me3-богатого старением-ассоциированного гетерохроматина (SAHF) в ядре, стойкое накопление очагов маркера повреждения ДНК γH2AX, активированные p53-p21CIP1 и Rb-p16INK4a регуляторные механизмы клеточного цикла, стабильная остановка клеточного цикла G1, массивная индукция SASP и повышенная активность β-галактозидазы (SA-β-gal)14, связанная со старением. Поскольку ни один маркер не является достаточным для определения старения, ферментативное окрашивание для активности SA-β-gal, которое считается золотым стандартом для обнаружения старения, обычно сочетается с иммуногистохимическим окрашиванием для H3K9me3 и Ki67 для обнаружения TIS15. Тем не менее, химические хромогенные SA-β-gal трудно поддаются количественной оценке. Здесь мы объединили обнаружение флуоресценции 5-додеканоиламинофлуоресцеин-ди-β-D-галактопиранозида (C12FDG) на основе флуоресценции SA-β-gal (fSA-β-gal) с иммунофлуоресцентным окрашиванием для γH2AX и EdU-интегрированной ДНК для идентификации стареющих клеток C12FDG + EdU-γH2AX + с использованием передовой системы визуализации проточного цитометра, которая сочетает в себе скорость, чувствительность и подробные одноклеточные изображения с пространственной информацией, которая не может быть предоставлена проточной цитометрией и микроскопией. Этот метод позволяет быстро генерировать изображения с высоким разрешением, позволяющие позиционировать и количественно оценивать флуоресцентные сигналы в ячейках, одновременно лицензируя быстрый анализ нескольких образцов путем создания стандартных трубопроводов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>613407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>350509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-&#946;-D-Galactopyranoside)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11590276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroquin -diphosphat</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>C6628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser (Coulter Clenz)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C10418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daunorubicin</td>
			<td>Medchemexpress</td>
			<td>HY-13062A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler (70% Isopropanol)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.3704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis software (Amnis&#160;IDEAS&#160;6.3)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>CN-SW69-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument and imaging software (Amnis&#160;ImageStreamX&#160;Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>100220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KARPAS</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mafosfamide cyclohexylamine</td>
			<td>Niomech</td>
			<td>D-17272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCI-LY1</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11473704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG (2-Phenylethyl-&#946;-D-thiogalactosid)&#160;</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>P4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saponin</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBead Kit for ImageStream</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>400041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-DHL6</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSU-DLCL2</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 575</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells

Химиотерапевтические препараты могут вызывать непоправимое повреждение ДНК в раковых клетках, что приводит к апоптозу или преждевременному старению. В отличие от апоптотической гибели клеток, старение является принципиально иным механизмом, сдерживающим размножение раковых клеток. Десятилетия научных исследований выявили сложные патологические эффекты стареющих раковых клеток в опухолях и микросредах, которые модулируют раковые клетки и стромальные клетки. Новые данные свидетельствуют о том, что старение является мощным прогностическим фактором во время лечения рака, и поэтому быстрое и точное обнаружение стареющих клеток в образцах рака имеет важное значение. В данной работе представлен метод визуализации и выявления вызванного терапией старения (ТИ) в раковых клетках. Диффузные крупные В-клеточные линии лимфомы (DLBCL) обрабатывали мафосфамидом (MAF) или даунорубицином (DN) и исследовали на наличие маркера старения, связанного со старением β-галактозидазы (SA-β-gal), маркера синтеза ДНК 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU) и маркера повреждения ДНК gamma-H2AX (γH2AX). Визуализация проточного цитометра может помочь генерировать одноклеточные изображения с высоким разрешением за короткий период времени для одновременной визуализации и количественной оценки трех маркеров в раковых клетках.

Компенсационная матрица была сгенерирована с использованием программного обеспечения для анализа изображений путем загрузки записанных данных одноцветных контрольных образцов. Как показано на дополнительном рисунке S1, при значении коэффициента перекрестных помех 0,248 был ?...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells at JoVE.com

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Здесь мы представляем метод визуализации и количественной оценки множественных маркеров, связанных со старением, в отдельных клетках.

Одновременная визуализация и обнаружение на основе проточной цитометрии множественных флуоресцентных маркеров старения в терапевтических стареющих раковых клетках, вызванных терапией

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

Этот метод может быстро генерировать изображения с высоким разрешением, которые позволяют анализировать пространственное распределение и количественную оценку флуоресцентных сигналов в клетках, обеспечивая при этом быстрый анализ нескольких образцов. Клетки измеряются с использованием усовершенствованной системы визуализации потоковой цитометрии, сочетающей скорость, чувствительность и подробные изображения одиночных клеток с пространственной информацией, дающей уникальные данные, которые не могут быть предоставлены оптометрией потоков или микроскопией. Одним из важных советов является предоставление достаточного количества ячеек для установления настроек прибора, и мы подвешиваем ячейки с высокой плотностью для измерений.Кроме того, сбор данных прост и аналогичен обычной проточной цитометрии. Сначала сгенерируйте клеточные линии DLBCL, как описано в рукописи. Затем добавляют 10 миллимоляров раствора EdU в соотношении один к 1000 в культуру клеток DLBCL и инкубируют пластину в 5%-ном инкубаторе диоксида углерода при 37 градусах Цельсия в течение трех часов после смешивания пластины мягким раскачиванием.Выньте пластину после инкубации и добавьте 100 растворов миллимолярного хлорохина до конечной концентрации 75 микромоляров. Аккуратно перемешать, покачивая, и инкубировать в течение 30 минут. Затем добавляют 20 растворов миллимоляров C12 FDG до конечной концентрации 20 микромоляров.После тщательного перемешивания высиживайте пластину в течение одного часа, как было показано ранее. Затем добавьте 100 миллимоляров 2-фенилэтил-бета-d-тиогалактозида в один-50, чтобы остановить окрашивание бета-гала FSA. И аккуратно поверните пластину, чтобы перемешать.Перенесите клетки в 15-миллилитровые стерильные центрифужные трубки и вращайтесь в 100 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Как только супернатант будет выброшен, промыть клетки четырьмя миллилитрами PBS и центрифугой в 100 раз больше G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Затем повторно суспендируют клеточные гранулы в 500 микролитрах при 4% растворе для фиксации параформальдегида.После 10-минутной инкубации при комнатной температуре центрифугируют при 250 G в течение пяти минут при комнатной температуре. Выбросьте супернатант и промыть ячейки четырьмя миллилитрами PBS дважды и центрифугировать в 100 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре. После промывки выбросьте супернатант и повторно суспендируйте ячейку гранулы в 200 микролитрах буфера пермеабилизации сапонина.Теперь переложите суспензию в новую 1,5-миллилитровую трубку и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. Гранулируйте ячейки в 250 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем повторно приостанавливают клетки в 200 микролитрах раствора первичных антител и инкубируют при четырех градусах Цельсия в течение ночи, в темноте.Центрифугируйте трубки в 250 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта и промойте 100 микролитрами раствора для промывки сапонина. После промывки клеток дважды отбросьте супернатант и повторно приостановите гранулы клеток в 500 микролитрах коктейля обнаружения EdU.Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте и центрифугировать в 250 раз в G в течение пяти минут при комнатной температуре. Откажитесь от супернатанта и промойте одним миллилитром промывочного раствора сапонина. Повторите промывку два раза, выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулы ячейки в 20-50 микролитрах PBS.Перед включением прибора опорожните бутылку с отработанной жидкостью и проверьте уровни SpeedBeads, стерилизатора, очистителя, дебублера и достаточного количества жидкостей. После включения прибора и программного обеспечения для обработки изображений нажмите кнопку запуска, чтобы инициализировать флюидику и калибровку системы. Установите увеличение в 40 раз и установите низкую скорость жидкости.После включения лазеров включите 405-нанометровый лазер для измерения EdU Pacific Blue, 488 нанометров для измерения C12-FDG и 642 нанометра для измерения Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX. Установите шестой канал для канала рассеяния, первый канал и девятый канал для яркого поля. Затем начните с образца, который, как ожидается, будет иметь самую высокую флуоресценцию, чтобы установить интенсивность лазеров, и осторожно переверните пробу для смешивания.Открыв крышку трубки, вставьте пробку в док. Нажмите кнопку Загрузить, чтобы начать и открыть точечную диаграмму. Затем выберите область «Функции», подчеркните MO1 и подчеркните соотношение сторон MO1 для осей X и Y соответственно.Установите задворку выше соотношения сторон 0,5, чтобы исключить дублеты и агрегаты ячеек ниже и с правой стороны и популяцию SpeedBead с левой стороны. Теперь откройте Histogram Plot и выберите корневой средний квадрат корневого градиента объекта маски один и первого канала для оси X. Выберите популяцию синглетов и установите ворота для выбора сфокусированных ячеек.Откройте график гистограммы и выберите максимальную интенсивность пикселей для второго, седьмого и 11-го каналов оси X. Затем отрегулируйте мощность лазера 488 нанометров, 405 нанометров и 642 нанометров лазеров для второго канала, семи и 11 соответственно, чтобы каждый фторхром имел необработанное максимальное значение пикселя от 100 до 4 000, чтобы избежать перенасыщения. Выберите сфокусированную популяцию для записи и нажмите «Получить», чтобы измерить образцы DLBCL с согласованными настройками.При замене образцов для измерения нажмите кнопку возврата, чтобы восстановить пробу. Нажмите кнопку Загрузить, чтобы удалить образец. После того, как все образцы будут измерены, выключите яркое поле и рассейте лазер.Измерьте одноцветные контрольные образцы для создания компенсационной матрицы. Нажмите кнопку Shutdown (Завершение работы), чтобы закрыть систему обработки изображений. Анализируйте данные в программном обеспечении для анализа изображений.Используйте инструмент Spot Wizard программного обеспечения для анализа изображений для автоматического подсчета и количественной оценки ядерных гамма-фокусов H2AX и изображений живых клеток. Выберите две популяции клеток, одну с высоким и одну с низким количеством пятен, чтобы обучить Spot Wizard для дальнейшего автоматического анализа количества пятен. Метод проточной цитометрии на изображениях одиночных клеток показал увеличение C12-FDG положительного, EdU отрицательного, гамма H2AX положительного, сенексированной популяции и KARPAS422.Клетки WSU-DLCL2 и OCI-LY1, но не в клетках SU-DHL6. Анализ на основе визуализации показал значительно более высокое количество гамма-фокусов H2AX и KARPAS422, WSU-DLCL2 и OCI-LY1, но не в клетках SU-DHL6. Аналогичные результаты были представлены данными о частоте и количественной оценке.Добавление сапонина в клеточную суспензию имеет решающее значение, в противном случае антитела не могут достичь внутренних антигенов клетки, а жесткие моющие средства приводят к потере сигнала C12-FTG Визуализационная цитометрия оптимальна для анализа изменений локализации маркеров, таких как транслокация транскрипционного фактора в ядро в ответ на определенные стимулы. Такой анализ также может быть достигнут с помощью нашего протокола. Этот метод позволяет визуализировать несколько флуоресцентных маркеров на одноклеточном уровне, что помогает обнаружить наличие, интенсивность и локализацию отдельных сигналов.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Потока на основе цитометрии наркотиков скрининг системы для идентификации малых молекул, которые способствуют клеточной дифференцировки стволовых клеток глиобластомы

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

Смешанных биолюминесцентных и позитронный выбросов томография/вычислительная томография томография множественной миеломы ксенотрасплантатов костного мозга мышей Нагель

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Обнаружение активности протеаз, флуоресцентный пептид Зимография

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Обнаружение прогрессирования опухоли легких у мышей с помощью ультразвуковой визуализации

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

В Vivo Ориентация Ксенотрансплантированных раковых клеток человека с функциональными флуоресцентными наночастицами кремнезема в Зебрафиш

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Иммунофлуоресценция Визуализация повреждения ДНК и ремонт Фочи в раковых клетках толстой кишки человека

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated ÃƒÅ½Ã‚Â²-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Дальнекрасный флуоресцентный датчик старения, связанный с β-галактозидазой для идентификации и обогащения стареющих опухолевых клеток с помощью проточной цитометрии

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Моделирование метастазирования в мозг путем инъекции раковых клеток во внутреннюю сонную артерию

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

Анализ связывания белка клеточной поверхности на поверхности проточной цитометрии для оценки селективности и специфичности противоопухолевого аптамера

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Ортотопическая имплантация раковых клеток, полученных от пациентов, у мышей повторяет прогрессирующий колоректальный рак

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...