Name: simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells
Uploaded: 2022-07-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por una subvención a Yong Yu de la Universidad Johannes Kepler de Linz (BERM16108001).

1. Líneas celulares DLBCL con tratamiento con mafosfamida o daunorrubicina para inducir senescencia celular
NOTA: El protocolo también funciona para las células cancerosas adherentes. Dependiendo del tamaño de la célula, sembra 1-2 × 105 células en un pozo de una placa de 6 pocillos e incuba la placa en una incubadora de 5% de CO2, 37 ° C durante la noche antes del tratamiento. Los pasos del protocolo son los mismos que para las celdas de suspensió...

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	<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essence+of+senescence.">The essence of senescence.</a> Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li><li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene-induced+senescence+is+a+DNA+damage+response+triggered+by+DNA+hyper-replication.">Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication.</a> Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).</li><li>Milanovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+reprogramming+promotes+cancer+stemness.">Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness.</a> Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).</li><li>Passos, J. 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A., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+cancer+and+aging.">Cellular senescence in cancer and aging.</a> Cell. 130 (2), 223-233 (2007).</li><li>Munoz-Espin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+senescence+during+mammalian+embryonic+development.">Programmed cell senescence during mammalian embryonic development.</a> Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).</li><li>Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmasking+senescence:+context-dependent+effects+of+SASP+in+cancer.">Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).</li><li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease:+from+mechanisms+to+therapy.">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li><li>Chandra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reorganization+of+the+nuclear+landscape+in+senescent+cells.">Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells.</a> Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).</li><li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+DNA+damage+signalling+triggers+senescence-associated+inflammatory+cytokine+secretion.">Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion.</a> Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9me3-mediated+epigenetic+regulation+of+senescence+in+mice+predicts+outcome+of+lymphoma+patients.">H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients.</a> Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).</li><li>Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+ageing:+from+mechanisms+to+therapeutic+opportunities.">Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).</li><li>Fan, D. N., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+markers+of+therapy-induced+senescence+in+cancer+cells.">Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).</li><li>Schmitt, C. A., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+and+chemoresistance+in+transgenic+cancer+models.">Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models.</a> Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).</li><li>Dorr, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethal+metabolic+targeting+of+cellular+senescence+in+cancer+therapy.">Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy.</a> Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).</li><li>Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxic+stress-induced+senescence.">Genotoxic stress-induced senescence.</a> Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).</li><li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts.">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li><li>Biran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+identification+of+senescent+cells+in+aging+and+disease.">Quantitative identification of senescent cells in aging and disease.</a> Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).</li><li>Rossi, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+senescent+surface+biomarkers+as+senotherapeutic+targets.">The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets.</a> Cells. 10 (7), 1740 (2021).</li><li>Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo.">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li></ol>

Este método examinó la capacidad de entrada de senescencia de cuatro líneas celulares diferentes de DLBCL durante el tratamiento de quimioterapia, con imágenes de campo brillante y cuantificación basada en citometría de flujo. A nivel unicelular, detectamos con éxito poblaciones senescentes C12FDG+EdU-Ki67+ principales en células KARPAS422 y WSU-DLCL2 tratadas, y en menor medida en células OCI-LY1, mientras que la línea celular SU-DHL6 fue resistente al tratamiento. L...

Una variedad de estímulos puede desencadenar la senescencia celular, haciendo que las células entren en un estado de detención estable del ciclo celular. Estos estímulos incluyen cambios intrínsecos de señalización o tensiones extrínsecas. Las señales intrínsecas incluyen acortamiento progresivo de los telómeros, cambios en la estructura de los telómeros, modificación epigenética, trastornos de proteostasis, disfunción mitocondrial y activación de oncogenes. Las tensiones extrínsecas incluyen señales de daño inflamatorio y/o tisular, radiación o tratamiento químico y privación nutricional 1,2,3,4. Entre los distintos tipos de senescencia, los más comúnmente vistos y bien estudiados son la senescencia replicativa, la senescencia inducida por oncogén (OIS), la senescencia inducida por radiación y la senescencia inducida por terapia (TIS). La OIS es una respuesta celular aguda al daño genotóxico causado por el estrés replicativo generado por la activación aberrante del oncogén y puede, en cierta medida, prevenir la progresión patológica de una lesión preneoplásica a un tumor en toda regla. El TIS ocurre cuando las células tumorales están estresadas por medicamentos quimioterapéuticos o radiación ionizante 5,6.
La senescencia se considera un arma de doble filo en patología debido a su naturaleza altamente dinámica. Inicialmente se describió como un mecanismo supresor de tumores beneficioso para eliminar las células dañadas del grupo circulante de células en división, salvaguardando la función normal de los órganos e inhibiendo el crecimiento tumoral 7,8,9. Sin embargo, la evidencia emergente ha sugerido un lado oscuro de la senescencia. Las células senescentes secretan citoquinas proinflamatorias, conocidas como fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP), que conducen a fibrosis y órganos defectuosos y promueven el inicio y la progresión del tumor10. Además, las células cancerosas senescentes se someten a una reprogramación epigenética y de expresión génica en paralelo con la remodelación de la cromatina y la activación de una respuesta sostenida de daño al ADN (DDR)11,12, adquiriendo recientemente nuevas propiedades de células madre cancerosas3. Aunque los tumores con capacidad de senescencia responden mejor a la intervención terapéutica en comparación con los incapaces de senescencia13, la persistencia de las células senescentes puede conducir a un mal pronóstico a largo plazo si no son identificados y eliminados eficazmente por los fármacos senolíticos5. De cualquier manera, un método confiable para evaluar la senescencia es de gran interés clínico, no solo para el pronóstico del tratamiento terapéutico, sino también para el desarrollo de nuevas estrategias dirigidas a las células senescentes.
Independientemente de los diferentes desencadenantes, las células senescentes exhiben algunas características comunes, incluida la morfología agrandada, aplanada y multinucleada con grandes vacuolas, núcleos significativamente expandidos, formación de heterocromatina asociada a la senescencia rica en H3K9me3 (SAHF) en el núcleo, acumulación persistente de focos del marcador de daño al ADN γH2AX,cip1 p53-p21 activado y RB-p16INK4a mecanismos reguladores del ciclo celular, detención estable del ciclo celular G1, inducción masiva de SASP y actividad elevada asociada a la β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal)14. Dado que ningún marcador único es suficiente para definir la senescencia, la tinción enzimática para la actividad SA-β-gal, que se considera el estándar de oro para la detección de senescencia, generalmente se combina con la tinción inmunohistoquímica para H3K9me3 y Ki67 para detectar TIS15. Sin embargo, el SA-β-gal basado en cromosomas químicos es difícil de cuantificar. Aquí, combinamos la detección de SA-β-gal basada en fluorescencia de 5-dodecanoylaminofluoresce-di-β-D-galactopiranosido (C12FDG) basada en fluorescencia (fSA-β-gal) con tinción inmunofluorescente para γH2AX y ADN incorporado a EdU para identificar células senescentes C12FDG + EdU-γH2AX + utilizando el sistema de citómetro de flujo de imágenes avanzadas, que combina la velocidad, la sensibilidad y las imágenes detalladas de una sola célula con información espacial que no se puede proporcionar mediante citometría de flujo y microscopía. Este método permite la generación rápida de imágenes de alta resolución que permiten el posicionamiento y la cuantificación de señales fluorescentes dentro de las células, al tiempo que autoriza el análisis rápido de múltiples muestras mediante la construcción de tuberías estándar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>613407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>350509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-&#946;-D-Galactopyranoside)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11590276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroquin -diphosphat</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>C6628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser (Coulter Clenz)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C10418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daunorubicin</td>
			<td>Medchemexpress</td>
			<td>HY-13062A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler (70% Isopropanol)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.3704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis software (Amnis&#160;IDEAS&#160;6.3)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>CN-SW69-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument and imaging software (Amnis&#160;ImageStreamX&#160;Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>100220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KARPAS</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mafosfamide cyclohexylamine</td>
			<td>Niomech</td>
			<td>D-17272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCI-LY1</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11473704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG (2-Phenylethyl-&#946;-D-thiogalactosid)&#160;</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>P4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saponin</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBead Kit for ImageStream</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>400041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-DHL6</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSU-DLCL2</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 575</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells

Los medicamentos quimioterapéuticos pueden inducir daños irreparables en el ADN en las células cancerosas, lo que lleva a la apoptosis o senescencia prematura. A diferencia de la muerte celular apoptótica, la senescencia es una maquinaria fundamentalmente diferente que restringe la propagación de las células cancerosas. Décadas de estudios científicos han revelado los complejos efectos patológicos de las células cancerosas senescentes en tumores y microambientes que modulan las células cancerosas y las células estromales. La nueva evidencia sugiere que la senescencia es un potente factor pronóstico durante el tratamiento del cáncer y, por lo tanto, la detección rápida y precisa de las células senescentes en muestras de cáncer es esencial. Este artículo presenta un método para visualizar y detectar la senescencia inducida por la terapia (TIS) en las células cancerosas. Las líneas celulares de linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) se trataron con mafosfamida (MAF) o daunorrubicina (DN) y se examinaron para detectar el marcador de senescencia, la β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal), el marcador de síntesis de ADN 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) y el marcador gamma-H2AX de daño al ADN (γH2AX). Las imágenes del citómetro de flujo pueden ayudar a generar imágenes unicelulares de alta resolución en un corto período de tiempo para visualizar y cuantificar simultáneamente los tres marcadores en las células cancerosas.

Se generó una matriz de compensación utilizando un software de análisis de imágenes mediante la carga de datos grabados de muestras de control de un solo color. Como se muestra en la Figura Suplementaria S1, se detectó un derrame de luz no despreciable (valor de coeficiente ≥ 0.1) de EdU a C12FDG con un valor de coeficiente de diafonía de 0.248, mientras que la diafonía entre otros canales no fue significativa. Cuatro líneas celulares diferentes de DLBCL fueron tratadas con 5 μg/mL ...

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Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Aquí presentamos un método basado en citometría de flujo para la visualización y cuantificación de múltiples marcadores asociados a la senescencia en células individuales.

Detección simultánea basada en imágenes y citometría de flujo de múltiples marcadores de senescencia fluorescente en células cancerosas senescentes inducidas por terapia

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

Este método puede generar rápidamente imágenes de alta resolución que permiten un análisis de la distribución espacial y la cuantificación de señales fluorescentes dentro de las células, al tiempo que permite un análisis rápido de múltiples muestras. Las células se miden utilizando el sistema avanzado de citometría de flujo de imágenes, que combina velocidad, sensibilidad e imágenes detalladas de células individuales con información espacial que produce datos únicos que no pueden ser proporcionados por optometría de flujos o microscopía. Un consejo importante es proporcionar suficientes celdas para establecer la configuración del instrumento y suspendemos las celdas a alta densidad para las mediciones.Aparte de esto, la adquisición de datos es sencilla y similar a la citometría de flujo convencional. Primero genere las líneas celulares DLBCL como se describe en el manuscrito. Luego agregue una solución de EdU milimolar a una proporción de uno a 1000 en el cultivo celular DLBCL e incube la placa en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante tres horas después de mezclar la placa balanceándola suavemente.Saque la placa después de la incubación y agregue 100 milimolares de solución de cloroquina a una concentración final de 75 micromolares. Mezclar meciendo suavemente e incubar durante 30 minutos. Luego agregue 20 soluciones milimolares de C12 FDG a una concentración final de 20 micromolares.Después de mezclar suavemente, incubar el plato durante una hora como se demostró anteriormente. A continuación, agregue 100 milimolares de solución de 2-feniletil-beta-d-tiogalactósido de uno a 50 para detener la tinción de FSA beta-gal. Y gire suavemente la placa para mezclar.Transfiera las células a tubos de centrífuga estériles de 15 mililitros y gire a 100 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Una vez desechado el sobrenadante, lave las celdas con cuatro mililitros de PBS y centrifugar a 100 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Luego vuelva a suspender los gránulos celulares en 500 microlitros al 4% de solución de fijación de paraformaldehído.Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, centrifugar a 250 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y lave las células con cuatro mililitros de PBS dos veces y centrifugue a 100 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después del lavado, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 200 microlitros de tampón de permeabilización de saponina.Ahora transfiera la suspensión a un nuevo tubo de 1.5 mililitros e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Granular las células a 250 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego vuelva a suspender las células en 200 microlitros de solución de anticuerpos primarios e incube a cuatro grados centígrados durante la noche, en la oscuridad.Centrifugar los tubos a 250 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y lave con 100 microlitros de solución de lavado de saponina. Después de lavar las células dos veces, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos celulares en 500 microlitros de cóctel de detección EdU.Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad y centrifugar a 250 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y lave con un mililitro de solución de lavado de saponina. Repita el lavado dos veces, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos celulares en 20 a 50 microlitros de PBS.Antes de encender el instrumento, vacíe la botella de líquido residual y verifique los niveles de SpeedBeads, esterilizador, limpiador, desbocadillo y suficiente fluidos de vaina. Después de encender el instrumento y el software de imágenes, haga clic en el botón de inicio para inicializar la fluidez y la calibración del sistema. Ajuste el aumento a 40 veces y establezca la velocidad fluídica en baja.Después de encender los láseres, encienda un láser de 405 nanómetros para medir EdU Pacific Blue, 488 nanómetros para medir C12-FDG y 642 nanómetros para medir Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX. Establezca el canal seis para el canal de dispersión, el canal uno y el canal nueve para el campo claro. Luego comience con la muestra que se espera que tenga la fluorescencia más alta para configurar la intensidad de los láseres y voltee suavemente el tubo de muestra para mezclar.Después de abrir la tapa del tubo, inserte el tubo de muestra en la base. Haga clic en Cargar para iniciar y abrir un diagrama de dispersión. A continuación, seleccione el área Características, el subrayado MO1 y la relación de aspecto subrayar MO1 para los ejes X e Y, respectivamente.Establezca una puerta por encima de la relación de aspecto de 0,5 para excluir dobletes y agregados de celdas debajo y en el lado derecho y la población de SpeedBead en el lado izquierdo. Ahora, abra Gráfico de histograma y seleccione el cuadrado medio de la raíz del gradiente de entidad de la máscara uno y el canal uno para el eje X. Elija la población de singletes y establezca la puerta para seleccionar celdas enfocadas.Abra un gráfico de histograma y seleccione intensidades de píxeles máximas sin procesar para los canales dos, siete y 11 del eje X. Luego ajuste las potencias del láser de 488 nanómetros, 405 nanómetros y 642 nanómetros para los canales dos, siete y 11 respectivamente para que cada fluorocromo tenga un valor máximo de píxeles bruto entre 100 y 4, 000 para evitar la sobresaturación. Elija la población enfocada para registrar y haga clic en Adquirir para medir las muestras de DLBCL con configuraciones consistentes.Al cambiar las muestras para la medición, haga clic en retorno para recuperar el tubo de muestra. Pulse Cargar para descartar la muestra. Después de medir todas las muestras, apague el láser de campo brillante y dispersión.Mida muestras de control de un solo color para generar una matriz de compensación. Haga clic en Apagar para cerrar el sistema de imágenes. Analice los datos en el software de análisis de imágenes.Utilice la herramienta Spot Wizard del software de análisis de imágenes para contar y cuantificar automáticamente los focos gamma H2AX nucleares y las imágenes de células vivas. Seleccione dos poblaciones de celdas, una con un recuento de puntos alto y otro con un recuento de puntos bajo para entrenar al Asistente para obtener un análisis de recuento de puntos más detallado. El método de citometría de flujo en imágenes unicelulares mostró un aumento de C12-FDG positivo, EdU negativo, gamma H2AX positivo, población senescente y KARPAS422.Células WSU-DLCL2 y OCI-LY1, pero no en células SU-DHL6. El análisis basado en imágenes presentó un número significativamente mayor de focos gamma H2AX y KARPAS422, WSU-DLCL2 y OCI-LY1, pero no en células SU-DHL6. Resultados similares fueron representados por datos de frecuencia y cuantificación.Agregar saponina a la suspensión celular es crucial, de lo contrario los anticuerpos no pueden llegar a los antígenos internos de la célula y los detergentes fuertes conducen a la pérdida de la señal C12-FTG La citometría de imagen es óptima para analizar los cambios en la localización del marcador, como la translocación de un factor de transcripción al núcleo en respuesta a ciertos estímulos. Tal análisis también se puede lograr con nuestro protocolo. Este método permite la visualización de múltiples marcadores fluorescentes a nivel de una sola célula, lo que ayuda a detectar la presencia, intensidad y localización de las señales individuales.

Research

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The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Detección de la progresión del tumor pulmonar en ratones por imágenes por ultrasonido

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Imágenes de inmunofluorescencia de daños en el ADN y dosis de focos en células de cáncer de colon humano

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated ÃƒÅ½Ã‚Â²-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Sonda de β-galactosidasa asociada a senescencia fluorescente de color rojo lejano para la identificación y el enriquecimiento de células tumorales senescentes mediante citometría de flujo

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Modelado de metástasis cerebrales mediante inyección de células cancerosas en la arteria carótida interna

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

Un ensayo de unión a proteínas de superficie celular basado en citometría de flujo para evaluar la selectividad y la especificidad de un aptámero anticanceroso

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

La implantación ortotópica de células cancerosas derivadas de pacientes en ratones recapitula el cáncer colorrectal avanzado

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...