Name: simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells
Uploaded: 2022-07-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett bidrag till Yong Yu från Johannes Kepler University Linz (BERM16108001).

1. DLBCL-cellinjer med mafosfamid- eller daunorubicinbehandling för att inducera cellulär åldrande
OBS: Protokollet fungerar också för vidhäftande cancerceller. Beroende på cellstorlek ×1-2 celler i en brunn på en 6-brunnsplatta och inkubera plattan i en 5% CO2, 37 ° C inkubator över natten före behandling. Protokollstegen är desamma som för suspensionsceller men med två undantag. Först måste celler trypsiniseras från plattan efter steg 3....

<ol>
	<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essence+of+senescence.">The essence of senescence.</a> Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li><li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene-induced+senescence+is+a+DNA+damage+response+triggered+by+DNA+hyper-replication.">Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication.</a> Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).</li><li>Milanovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+reprogramming+promotes+cancer+stemness.">Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness.</a> Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).</li><li>Passos, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+between+p21+and+reactive+oxygen+production+is+necessary+for+cell+senescence.">Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence.</a> Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).</li><li>Lee, S., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+nature+of+senescence+in+cancer.">The dynamic nature of senescence in cancer.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).</li><li>Toussaint, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+premature+senescence+or+stress-induced+senescence-like+phenotype:+one+in+vivo+reality,+two+possible+definitions.">Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions.</a> The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).</li><li>Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+cancer+and+aging.">Cellular senescence in cancer and aging.</a> Cell. 130 (2), 223-233 (2007).</li><li>Munoz-Espin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+senescence+during+mammalian+embryonic+development.">Programmed cell senescence during mammalian embryonic development.</a> Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).</li><li>Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmasking+senescence:+context-dependent+effects+of+SASP+in+cancer.">Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).</li><li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease:+from+mechanisms+to+therapy.">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li><li>Chandra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reorganization+of+the+nuclear+landscape+in+senescent+cells.">Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells.</a> Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).</li><li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+DNA+damage+signalling+triggers+senescence-associated+inflammatory+cytokine+secretion.">Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion.</a> Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9me3-mediated+epigenetic+regulation+of+senescence+in+mice+predicts+outcome+of+lymphoma+patients.">H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients.</a> Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).</li><li>Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+ageing:+from+mechanisms+to+therapeutic+opportunities.">Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).</li><li>Fan, D. N., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+markers+of+therapy-induced+senescence+in+cancer+cells.">Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).</li><li>Schmitt, C. A., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+and+chemoresistance+in+transgenic+cancer+models.">Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models.</a> Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).</li><li>Dorr, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethal+metabolic+targeting+of+cellular+senescence+in+cancer+therapy.">Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy.</a> Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).</li><li>Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxic+stress-induced+senescence.">Genotoxic stress-induced senescence.</a> Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).</li><li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts.">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li><li>Biran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+identification+of+senescent+cells+in+aging+and+disease.">Quantitative identification of senescent cells in aging and disease.</a> Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).</li><li>Rossi, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+senescent+surface+biomarkers+as+senotherapeutic+targets.">The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets.</a> Cells. 10 (7), 1740 (2021).</li><li>Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo.">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li></ol>

Denna metod undersökte åldrandets inträdande förmåga hos fyra olika DLBCL-cellinjer vid kemoterapibehandling, med ljusfältsavbildning och flödescytometribaserad kvantifiering. På encellsnivå upptäckte vi framgångsrikt stora C12FDG + EdU-Ki67 + senescentpopulationer i behandlade KARPAS422- och WSU-DLCL2-celler, och i mindre utsträckning i OCI-LY1-celler, medan SU-DHL6-cellinjen var resistent mot behandlingen. Skillnaden i åldrande-ingångsförmåga mellan cellinjer ...

En mängd olika stimuli kan utlösa cellulär åldrande, vilket får celler att gå in i ett tillstånd av stabil cellcykelstopp. Dessa stimuli inkluderar inneboende signalförändringar eller yttre påfrestningar. Inneboende signaler inkluderar progressiv telomerförkortning, förändringar i telomerstruktur, epigenetisk modifiering, proteostasstörningar, mitokondriell dysfunktion och aktivering av onkogener. Yttre påfrestningar inkluderar inflammatoriska och / eller vävnadsskadesignaler, strålning eller kemisk behandling och näringsbrist 1,2,3,4. Bland olika typer av åldrande är de vanligaste och välstuderade replikativ åldrande, onkogeninducerad åldrande (OIS), strålningsinducerad åldrande och terapiinducerad åldrande (TIS). OIS är ett akut cellulärt svar på genotoxisk skada orsakad av replikativ stress genererad av avvikande onkogenaktivering och kan till viss del förhindra den patologiska utvecklingen från en preneoplastisk lesion till en fullblåst tumör. TIS händer när tumörceller stressas av kemoterapeutiska läkemedel eller joniserande strålning 5,6.
Senescence anses vara ett tveeggat svärd i patologi på grund av dess mycket dynamiska natur. Det beskrevs ursprungligen som en fördelaktig tumörundertryckande mekanism för att ta bort skadade celler från den cirkulerande poolen av delande celler, skydda organens normala funktion och hämma tumörtillväxt 7,8,9. Nya bevis har dock föreslagit en mörk sida av åldrande. Senescenta celler utsöndrar proinflammatoriska cytokiner, känd som åldrande-associerad sekretorisk fenotyp (SASP), vilket leder till fibros och felaktiga organ och främjar tumörinitiering och progression10. Dessutom genomgår senescenta cancerceller epigenetisk och genuttrycksomprogrammering parallellt med kromatinombyggnad och aktivering av ett ihållande DNA-skadesvar (DDR)11,12, vilket nyligen förvärvar nya cancer-stamcellsegenskaper3. Även om åldrande-kapabla tumörer svarar bättre på terapeutisk ingrepp jämfört med åldrande-oförmögna13, kan persistensen hos åldrande celler leda till en dålig långsiktig prognos om de inte effektivt identifieras och elimineras av senolytiska läkemedel5. Hur som helst är en tillförlitlig metod för att bedöma åldrande av betydande kliniskt intresse, inte bara för prognosen för terapibehandling utan också för utvecklingen av nya strategier riktade mot åldrande celler.
Oavsett olika utlösare uppvisar åldrande celler några gemensamma egenskaper, inklusive förstorad, tillplattad, flerkärnig morfologi med stora vakuoler, signifikant expanderade kärnor, bildning av H3K9me3-rik åldrandeassocierad heterokromatin (SAHF) i kärnan, ihållande ackumulering av DNA-skademarkör γH2AX-foci, aktiverad p53-p21CIP1 och Rb-p16INK4a cellcykelregleringsmekanismer, stabil G1-cellcykelstopp, massiv induktion av SASP och förhöjd åldrande-associerad β-galaktosidas (SA-β-gal) aktivitet14. Eftersom ingen enskild markör är tillräcklig för att definiera åldrande kombineras enzymatisk färgning för SA-β-gal-aktivitet, som anses vara guldstandarden för åldrandedetektering, vanligtvis med immunohistokemisk färgning för H3K9me3 och Ki67 för att detektera TIS15. Kemisk kromogenbaserad SA-β-gal är dock svår att kvantifiera. Här kombinerade vi 5-dodekanoylaminofluorescein-di-β-D-galaktopyranosid (C12FDG) fluorescensbaserad SA-β-gal (fSA-β-gal) detektion med immunofluorescerande färgning för γH2AX och EdU-inkorporerat DNA för att identifiera C12FDG + EdU-γH2AX + åldrande celler med hjälp av det avancerade bildflödescytometersystemet, som kombinerar hastighet, känslighet och detaljerade encellsbilder med rumslig information som inte kan tillhandahållas med flödescytometri och mikroskopi. Denna metod möjliggör snabb generering av högupplösta bilder som möjliggör positionering och kvantifiering av fluorescerande signaler i celler, samtidigt som den möjliggör snabb analys av flera prover genom att bygga standardledningar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>613407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>350509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-&#946;-D-Galactopyranoside)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11590276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroquin -diphosphat</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>C6628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser (Coulter Clenz)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C10418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daunorubicin</td>
			<td>Medchemexpress</td>
			<td>HY-13062A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler (70% Isopropanol)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.3704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis software (Amnis&#160;IDEAS&#160;6.3)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>CN-SW69-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument and imaging software (Amnis&#160;ImageStreamX&#160;Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>100220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KARPAS</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mafosfamide cyclohexylamine</td>
			<td>Niomech</td>
			<td>D-17272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCI-LY1</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11473704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG (2-Phenylethyl-&#946;-D-thiogalactosid)&#160;</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>P4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saponin</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBead Kit for ImageStream</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>400041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-DHL6</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSU-DLCL2</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 575</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells

Kemoterapeutiska läkemedel kan inducera irreparabel DNA-skada i cancerceller, vilket leder till apoptos eller för tidig åldrande. Till skillnad från apoptotisk celldöd är åldrande ett fundamentalt annorlunda maskineri som hindrar förökning av cancerceller. Årtionden av vetenskapliga studier har avslöjat de komplexa patologiska effekterna av åldrande cancerceller i tumörer och mikromiljöer som modulerar cancerceller och stromaceller. Nya bevis tyder på att åldrande är en potent prognostisk faktor under cancerbehandling, och därför är snabb och exakt upptäckt av åldrande celler i cancerprover avgörande. Denna artikel presenterar en metod för att visualisera och detektera terapiinducerad åldrande (TIS) i cancerceller. Diffusa cellinjer med stort B-celllymfom (DLBCL) behandlades med mafosfamid (MAF) eller daunorubicin (DN) och undersöktes med avseende på åldrandemarkören, åldrandeassocierad β-galaktosidas (SA-β-gal), DNA-syntesmarkören 5-etynyl-2′-deoxyuridin (EdU) och DNA-skademarkören gamma-H2AX (γH2AX). Flödescytometeravbildning kan hjälpa till att generera högupplösta encellsbilder på kort tid för att samtidigt visualisera och kvantifiera de tre markörerna i cancerceller.

En kompensationsmatris genererades med hjälp av bildanalysprogramvara genom att ladda inspelade data från enfärgade kontrollprover. Som visas i kompletterande figur S1 detekterades en icke försumbar (koefficientvärde ≥ 0,1) ljusspridning från EdU till C12FDG med överhörningskoefficientvärde 0,248, medan överhörningen bland andra kanaler inte var signifikant. Fyra olika DLBCL-cellinjer behandlades med 5 μg /ml MAF eller 20 ng / ml DN för att inducera cellulär åldrande och analy...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells at JoVE.com

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Här presenterar vi en flödescytometribaserad metod för visualisering och kvantifiering av flera åldrandeassocierade markörer i enstaka celler.

Samtidig avbildning och flödescytometribaserad detektion av flera fluorescerande åldrande markörer i terapiinducerade senescenta cancerceller

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

Denna metod kan snabbt generera högupplösta bilder som möjliggör en analys av rumslig fördelning och kvantifiering av fluorescerande signaler i celler samtidigt som den möjliggör snabb analys av flera prover. Celler mäts med hjälp av det avancerade bildflödescytometrisystemet, som kombinerar hastighet, känslighet och detaljerade encellsbilder med rumslig information som ger unika data som inte kan tillhandahållas genom flödesoptometri eller mikroskopi. Ett viktigt råd är att tillhandahålla tillräckligt med celler för att fastställa instrumentinställningarna och vi suspenderar cellerna med hög densitet för mätningarna.Bortsett från detta är datainsamlingen enkel och liknar konventionell flödescytometri. Generera först DLBCL-cellinjerna enligt beskrivningen i manuskriptet. Tillsätt sedan 10 millimolar EdU-lösning i förhållandet ett till 1000 i DLBCL-cellkulturen och inkubera plattan i en 5% koldioxidinkubator vid 37 grader Celsius i tre timmar efter blandning av plattan genom mild gungning.Ta ut plattan efter inkubation och tillsätt 100 millimolär klorokinlösning till en slutlig koncentration av 75 mikromolar. Blanda genom att gunga försiktigt och inkubera i 30 minuter. Tillsätt sedan 20 millimolära C12 FDG-lösningar till en slutlig koncentration av 20 mikromolar.Efter mild blandning, inkubera plattan i en timme som visats tidigare. Tillsätt sedan 100 millimolar 2-fenyletyl-beta-d-tiogalaktosidlösning vid en till 50 för att stoppa FSA beta-galfärgningen. Och rotera försiktigt plattan för att blanda.Överför cellerna till 15 ml sterila centrifugrör och snurra vid 100 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius. När supernatanten har kasserats, tvätta cellerna med fyra milliliter PBS och centrifugera vid 100 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius. Suspendera sedan cellpelletsen i 500 mikroliter vid 4% paraformaldehydfixeringslösning.Efter 10 minuters inkubation vid rumstemperatur, centrifugera vid 250 gånger G i fem minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och tvätta cellerna med fyra milliliter PBS två gånger och centrifugera vid 100 gånger G i fem minuter vid rumstemperatur. Efter tvättning, kassera supernatanten och suspendera cellpelleten igen i 200 mikroliter saponin permeabilization buffert.Överför nu suspensionen till ett nytt 1,5 ml rör och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. Pellet cellerna vid 250 gånger G i fem minuter vid rumstemperatur. Suspendera sedan cellerna igen i 200 mikroliter primär antikroppslösning och inkubera vid fyra grader Celsius över natten, i mörkret.Centrifugera rören vid 250 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius. Kassera supernatanten och tvätta med 100 mikroliter saponintvättlösning. Efter att ha tvättat cellerna två gånger, kassera supernatanten och suspendera cellpelletsen igen i 500 mikroliter EdU-detektionscocktail.Inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter i mörkret och centrifugera vid 250 gånger G i fem minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och tvätta med en milliliter saponintvättlösning. Upprepa tvätten två gånger, kassera supernatanten och suspendera cellpelletsen igen i 20 till 50 mikroliter PBS.Innan du slår på instrumentet, töm spillvätskeflaskan och kontrollera nivåerna av SpeedBeads, sterilisator, rengöringsmedel, debubbler och mantel tillräckligt med vätskor. När du har slagit på instrumentet och bildprogramvaran klickar du på startknappen för att initiera fluidik och systemkalibrering. Ställ in förstoringen på 40 gånger och ställ in vätskehastigheten till låg.När du har slagit på lasrarna, slå på en 405 nanometer laser för att mäta EdU Pacific Blue, 488 nanometer för att mäta C12-FDG och 642 nanometer för att mäta Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX. Ställ in kanal sex för spridningskanalen, kanal ett och kanal nio för ljusfältet. Börja sedan med det prov som förväntas ha den högsta fluorescensen för att ställa in laserns intensitet och vänd försiktigt provröret för att blanda.När du har öppnat rörlocket, sätt in provröret på dockan. Klicka på Ladda för att starta och öppna ett spridningsdiagram. Välj sedan området Funktioner, understryk MO1 och bildförhållande understryker MO1 för X- respektive Y-axlarna.Ställ in en grind över bildförhållandet 0,5 för att utesluta dubbletter och cellaggregat under och på höger sida och SpeedBead-populationen på vänster sida. Öppna nu Histogram Plot och välj funktionen gradient root mean square of mask one och channel one för X-axeln. Välj singletpopulationen och ange porten för att välja för fokuserade celler.Öppna ett histogramdiagram och välj maximala pixelintensiteter för X-axelns kanal två, sju och 11. Justera sedan laserkrafterna på 488 nanometer, 405 nanometer och 642 nanometer lasrar för kanal två, sju respektive 11 så att varje fluorokrom har ett rå max pixelvärde mellan 100 och 4 000 för att undvika övermättnad. Välj den fokuserade populationen som ska spelas in och klicka på Hämta för att mäta DLBCL-proverna med konsekventa inställningar.När du byter prover för mätning, klicka på retur för att återställa provröret. Tryck på Läs in för att ignorera provet. När alla prover har mätts, stäng av ljusfältet och spridningslasern.Mät enstaka färgkontrollprover för att generera en kompensationsmatris. Klicka på Avstängning för att stänga bildsystemet. Analysera data i bildanalysprogramvaran.Använd spotguidens verktyg i bildanalysprogramvaran för att automatiskt räkna och kvantifiera nukleära gamma H2AX-foci och levande cellbilder. Välj två cellpopulationer, en med högt och en med lågt antal platser för att träna spotguiden för ytterligare automatisk punkträkningsanalys. Flödescytometrimetoden i encellsbilder visade ökad C12-FDG-positiv, EdU-negativ, gamma H2AX-positiv, senesced population och KARPAS422.WSU-DLCL2- och OCI-LY1-celler, men inte i SU-DHL6-celler. Den avbildningsbaserade analysen presenterade signifikant högre antal gamma H2AX-foci och KARPAS422, WSU-DLCL2 och OCI-LY1, men inte i SU-DHL6-celler. Liknande resultat representerades av frekvens- och kvantifieringsdata.Att tillsätta saponin till cellsuspensionen är avgörande, annars kan antikropparna inte nå cellens inre antigener och hårda tvättmedel leder till förlust av C12-FTG-signal Bildcytometri är optimal för att analysera förändringar i markörlokalisering som translokation av en transkriptionsfaktor till kärnan som svar på vissa stimuli. En sådan analys kan också uppnås med vårt protokoll. Denna metod gör det möjligt att visualisera flera fluorescerande markörer på encellsnivå som hjälper till att upptäcka närvaron, intensiteten och lokaliseringen av de enskilda signalerna.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Flöde flödescytometri-baserade Drug Screening System för identifiering av små molekyler som främjar celldifferentiering av Glioblastoma stamceller

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

Multimodala självlysande och Positronic-emission Tomography/Computational tomografisk avbildning av multipelt myelom benmärgen xenograft i NOG möss

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Påvisande av proteas aktivitet av fluorescerande peptid Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Upptäckt av lungtumörprogression hos möss av ultraljudsavbildning

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

In Vivo Targeting av Xenografted Human Cancer Cells med functionalized Fluorescent Silica Nanopartiklar i Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescens imaging av DNA-skador och reparation foci i mänskliga kolon cancerceller

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated ÃƒÅ½Ã‚Â²-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Långt-röd fluorescerande åldrande-associerad β-galaktosidassond för identifiering och anrikning av åldrande tumörceller genom flödescytometri

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Modellering av hjärnmetastaser genom inre halspulsåderinjektion av cancerceller

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

En flödescytometribaserad cellytproteinbindningsanalys för bedömning av selektivitet och specificitet hos en anticanceraptamer

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Ortotopisk implantation av patienthärledda cancerceller hos möss rekapitulerar avancerad kolorektal cancer

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...