Name: simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells
Uploaded: 2022-07-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells at JoVE.com

Bu çalışma, Linz Johannes Kepler Üniversitesi'nden Yong Yu'ya verilen bir hibe ile desteklenmiştir (BERM16108001).

1. Hücresel yaşlanmayı indüklemek için mafosfamid veya daunorubisin tedavisi ile DLBCL hücre hatları
NOT: Protokol aynı zamanda yapışkan kanser hücreleri için de çalışır. Hücre büyüklüğüne bağlı olarak, tohum 1-2, 10 5 hücreyi 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna × ve plakayı, işlemden bir gece önce%5 CO2, 37 ° C inkübatörde inkübe edin. Protokol adımları, süspansiyon hücreleri ile aynıdır, ancak iki istisna dışı...

<ol>
	<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essence+of+senescence.">The essence of senescence.</a> Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li><li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene-induced+senescence+is+a+DNA+damage+response+triggered+by+DNA+hyper-replication.">Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication.</a> Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).</li><li>Milanovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+reprogramming+promotes+cancer+stemness.">Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness.</a> Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).</li><li>Passos, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+between+p21+and+reactive+oxygen+production+is+necessary+for+cell+senescence.">Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence.</a> Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).</li><li>Lee, S., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+nature+of+senescence+in+cancer.">The dynamic nature of senescence in cancer.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).</li><li>Toussaint, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+premature+senescence+or+stress-induced+senescence-like+phenotype:+one+in+vivo+reality,+two+possible+definitions.">Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions.</a> The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).</li><li>Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+cancer+and+aging.">Cellular senescence in cancer and aging.</a> Cell. 130 (2), 223-233 (2007).</li><li>Munoz-Espin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+senescence+during+mammalian+embryonic+development.">Programmed cell senescence during mammalian embryonic development.</a> Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).</li><li>Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmasking+senescence:+context-dependent+effects+of+SASP+in+cancer.">Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).</li><li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease:+from+mechanisms+to+therapy.">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li><li>Chandra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reorganization+of+the+nuclear+landscape+in+senescent+cells.">Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells.</a> Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).</li><li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+DNA+damage+signalling+triggers+senescence-associated+inflammatory+cytokine+secretion.">Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion.</a> Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9me3-mediated+epigenetic+regulation+of+senescence+in+mice+predicts+outcome+of+lymphoma+patients.">H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients.</a> Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).</li><li>Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+ageing:+from+mechanisms+to+therapeutic+opportunities.">Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).</li><li>Fan, D. N., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+markers+of+therapy-induced+senescence+in+cancer+cells.">Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).</li><li>Schmitt, C. A., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+and+chemoresistance+in+transgenic+cancer+models.">Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models.</a> Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).</li><li>Dorr, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethal+metabolic+targeting+of+cellular+senescence+in+cancer+therapy.">Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy.</a> Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).</li><li>Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxic+stress-induced+senescence.">Genotoxic stress-induced senescence.</a> Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).</li><li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts.">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li><li>Biran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+identification+of+senescent+cells+in+aging+and+disease.">Quantitative identification of senescent cells in aging and disease.</a> Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).</li><li>Rossi, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+senescent+surface+biomarkers+as+senotherapeutic+targets.">The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets.</a> Cells. 10 (7), 1740 (2021).</li><li>Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo.">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li></ol>

Bu yöntem, kemoterapi tedavisi üzerine dört farklı DLBCL hücre hattının yaşlanma giriş kabiliyetini, parlak alan görüntüleme ve akış sitometrisine dayalı niceleme ile inceledi. Tek hücreli bir düzeyde, tedavi edilen KARPAS422 ve WSU-DLCL2 hücrelerinde ve OCI-LY1 hücrelerinde daha az ölçüde majör C12FDG + EdU-Ki67 + yaşlanan popülasyonları başarıyla tespit ettik, SU-DHL6 hücre hattı tedaviye dirençliydi. Hücre hatları arasındaki yaşlanma giriş...

Çeşitli uyaranlar hücresel yaşlanmayı tetikleyebilir ve hücrelerin kararlı bir hücre döngüsü tutuklaması durumuna girmesine neden olabilir. Bu uyaranlar, içsel sinyal değişikliklerini veya dışsal stresleri içerir. İçsel sinyaller arasında ilerleyici telomer kısalması, telomer yapısındaki değişiklikler, epigenetik modifikasyon, proteostaz bozuklukları, mitokondriyal disfonksiyon ve onkogenlerin aktivasyonu sayılabilir. Dışsal stresler arasında enflamatuar ve/veya doku hasarı sinyalleri, radyasyon veya kimyasal tedavi ve beslenme yoksunluğu 1,2,3,4 bulunur. Farklı yaşlanma türleri arasında en sık görülen ve iyi çalışılanlar replikatif yaşlanma, onkogen kaynaklı yaşlanma (OIS), radyasyona bağlı yaşlanma ve tedaviye bağlı yaşlanmadır (TIS). OIS, anormal onkogen aktivasyonu ile oluşan replikatif stresin neden olduğu genotoksik hasara akut hücresel bir yanıttır ve bir dereceye kadar preneoplastik bir lezyondan tam gelişmiş bir tümöre patolojik ilerlemeyi önleyebilir. TIS, tümör hücreleri kemoterapötik ilaçlar veya iyonlaştırıcı radyasyon 5,6 ile strese girdiğinde meydana gelir.
Yaşlanma, son derece dinamik doğası nedeniyle patolojide iki ucu keskin bir kılıç olarak kabul edilir. Başlangıçta, hasarlı hücreleri bölünen hücrelerin dolaşım havuzundan çıkarmak, organların normal işlevini korumak ve tümör büyümesini inhibe etmek için yararlı bir tümör baskılayıcı mekanizma olarak tanımlanmıştır 7,8,9. Bununla birlikte, ortaya çıkan kanıtlar yaşlanmanın karanlık bir tarafını öne sürmüştür. Yaşlanan hücreler, yaşlanma ile ilişkili sekretuar fenotip (SASP) olarak bilinen proinflamatuar sitokinler salgılar, fibroz ve arızalı organlara yol açar ve tümörün başlamasını ve ilerlemesini teşvik eder10. Ayrıca, yaşlanan kanser hücreleri, kromatin yeniden şekillenmesine ve sürekli bir DNA hasarı yanıtının (DDR) aktivasyonuna paralel olarak epigenetik ve gen ekspresyonu yeniden programlamasına tabi tutulur 11,12, yeni kanser-kök hücre özellikleri3. Her ne kadar yaşlanma yeteneğine sahip tümörler yaşlanma yeteneğine sahip olmayanlara kıyasla terapötik müdahaleye daha iyi yanıt verse de13, yaşlanan hücrelerin kalıcılığı, senolitik ilaçlarla etkili bir şekilde tanımlanmadıkları ve elimine edilmedikleri takdirde uzun vadeli prognozun kötü olmasına neden olabilir5. Her iki durumda da, yaşlanmayı değerlendirmek için güvenilir bir yöntem, sadece tedavi tedavisinin prognozu için değil, aynı zamanda yaşlanan hücreleri hedef alan yeni stratejilerin geliştirilmesi için de önemli klinik ilgi çekicidir.
Farklı tetikleyicilerden bağımsız olarak, yaşlanan hücreler, büyük vakuollerle genişlemiş, düzleşmiş, çok çekirdekli morfoloji, önemli ölçüde genişlemiş çekirdekler, çekirdekte H3K9me3 bakımından zengin yaşlanma ile ilişkili heterokromatin (SAHF) oluşumu, DNA hasar belirteci γH2AX odaklarının sürekli birikmesi, aktive edilmiş p53-p21CIP1 ve Rb-p16INK4a gibi bazı ortak özellikler sergiler. hücre döngüsü düzenleyici mekanizmalar, stabil G1 hücre döngüsü arresti, SASP'nin masif indüksiyonu ve yüksek yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-gal) aktivitesi14. Yaşlanmayı tanımlamak için tek bir belirteç yeterli olmadığından, yaşlanma tespiti için altın standart olarak kabul edilen SA-β-gal aktivitesi için enzimatik boyama, genellikle TIS15'i tespit etmek için H3K9me3 ve Ki67 için immünohistokimyasal boyama ile birleştirilir. Bununla birlikte, kimyasal kromojenik bazlı SA-β-gal'in ölçülmesi zordur. Burada, 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-D-galaktopyranoside (C 12 FDG) floresan bazlı SA-β-gal (fSA-β-gal) tespitini, γH2AX ve EdU-dahil DNA için immünofloresan boyama ile birleştirerek, C 12 FDG + EdU-γH2AX+ yaşlanan hücreleri tanımlamak için hız, duyarlılık ve ayrıntılı tek hücreli görüntüleri akış sitometrisi ve mikroskopi ile sağlanamayan uzamsal bilgilerle birleştirdik. Bu yöntem, hücreler içindeki floresan sinyallerinin konumlandırılmasına ve nicelleştirilmesine izin veren yüksek çözünürlüklü görüntülerin hızlı bir şekilde üretilmesini sağlarken, standart boru hatları oluşturarak birden fazla numunenin hızlı analizini lisanslar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>613407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>350509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-&#946;-D-Galactopyranoside)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11590276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroquin -diphosphat</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>C6628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser (Coulter Clenz)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C10418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daunorubicin</td>
			<td>Medchemexpress</td>
			<td>HY-13062A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler (70% Isopropanol)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.3704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis software (Amnis&#160;IDEAS&#160;6.3)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>CN-SW69-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument and imaging software (Amnis&#160;ImageStreamX&#160;Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>100220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KARPAS</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mafosfamide cyclohexylamine</td>
			<td>Niomech</td>
			<td>D-17272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCI-LY1</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11473704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG (2-Phenylethyl-&#946;-D-thiogalactosid)&#160;</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>P4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saponin</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBead Kit for ImageStream</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>400041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-DHL6</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSU-DLCL2</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 575</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells

Kemoterapötik ilaçlar, kanser hücrelerinde onarılamaz DNA hasarına neden olarak apoptoza veya erken yaşlanmaya neden olabilir. Apoptotik hücre ölümünün aksine, yaşlanma, kanser hücrelerinin yayılmasını kısıtlayan temelde farklı bir makinedir. Onlarca yıllık bilimsel çalışmalar, yaşlanan kanser hücrelerinin tümörlerde ve kanser hücrelerini ve stromal hücreleri modüle eden mikro ortamlarda karmaşık patolojik etkilerini ortaya koymuştur. Yeni kanıtlar, yaşlanmanın kanser tedavisi sırasında güçlü bir prognostik faktör olduğunu ve bu nedenle kanser örneklerinde yaşlanan hücrelerin hızlı ve doğru bir şekilde tespit edilmesinin gerekli olduğunu göstermektedir. Bu yazıda kanser hücrelerinde tedaviye bağlı yaşlanmayı (TIS) görselleştirmek ve saptamak için bir yöntem sunulmaktadır. Diffüz büyük B hücreli lenfoma (DLBCL) hücre hatları mafosfamid (MAF) veya daunorubisin (DN) ile tedavi edildi ve yaşlanma belirteci, yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-gal), DNA sentez belirteci 5-etinil-2′-deoksiüridin (EdU) ve DNA hasar belirteci gama-H2AX (γH2AX) açısından incelendi. Akış sitometresi görüntüleme, kanser hücrelerindeki üç belirteci aynı anda görselleştirmek ve ölçmek için kısa sürede yüksek çözünürlüklü tek hücreli görüntüler üretmeye yardımcı olabilir.

Tek renkli kontrol örneklerinin kayıtlı verileri yüklenerek görüntü analiz yazılımı kullanılarak bir kompanzasyon matrisi oluşturulmuştur. Ek Şekil S1'de gösterildiği gibi, EdU'dan C12FDG'ye ihmal edilemeyen (katsayı değeri ≥ 0.1) bir ışık yayılımı 0.248 çapraz konuşma katsayısı değeri ile tespit edilirken, diğer kanallar arasındaki çapraz konuşma anlamlı değildi. Dört farklı DLBCL hücre hattı, hücresel yaşlanmayı indüklemek için 5 μg / mL MAF vey...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells at JoVE.com

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Burada, tek hücrelerde çoklu yaşlanma ile ilişkili belirteçlerin görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi için akış sitometrisine dayalı bir yöntem sunuyoruz.

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinde Çoklu Floresan Yaşlanma Belirteçlerinin Eşzamanlı Görüntüleme ve Akış Sitometrisine Dayalı Tespiti

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

Bu yöntem, birden fazla numunenin hızlı bir şekilde analiz edilmesine izin verirken, hücrelerdeki floresan sinyallerinin uzamsal dağılımının ve miktarının analizine izin veren yüksek çözünürlüklü görüntüleri hızla üretebilir. Hücreler, gelişmiş görüntüleme akışı sitometri sistemi kullanılarak ölçülür, hız, hassasiyet ve ayrıntılı tek hücreli görüntüleri, akışlar optometrisi veya mikroskopi tarafından sağlanamayan benzersiz veriler veren uzamsal bilgilerle birleştirir. Önemli bir tavsiye, cihaz ayarlarını oluşturmak için yeterli hücre sağlamaktır ve ölçümleri için hücreleri yüksek yoğunlukta askıya alırız.Bunun dışında veri toplama basittir ve geleneksel akış sitometrisine benzer. İlk önce makalede açıklandığı gibi DLBCL hücre çizgilerini oluşturun. Daha sonra DLBCL hücre kültürüne bir ila 1000 oranında 10 milimolar EdU çözeltisi ekleyin ve plakayı hafifçe sallayarak karıştırdıktan sonra üç saat boyunca plakayı% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin.Kuluçkadan sonra plakayı çıkarın ve 75 mikromolar'lık bir son konsantrasyona 100 milimolar klorokin çözeltisi ekleyin. Hafifçe sallayarak karıştırın ve 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Ardından, 20 mikromolar'lık son konsantrasyona 20 milimolar C12 FDG çözeltisi ekleyin.Nazik karıştırmadan sonra, plakayı daha önce gösterildiği gibi bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, FSA beta-gal boyamasını durdurmak için bir ila 50 arasında 100 milimolar 2-feniletil-beta-d-tiyogalaktosid çözeltisi ekleyin. Ve karıştırmak için plakayı yavaşça döndürün.Hücreleri 15 mililitrelik steril santrifüj tüplerine aktarın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 100 kez G'de döndürün. Süpernatant atıldıktan sonra, hücreleri dört mililitre PBS ile yıkayın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 100 kez G'de santrifüj yapın. Daha sonra hücre peletlerini% 4 paraformaldehit fiksasyon çözeltisinde 500 mikrolitre içinde tekrar askıya alın.Oda sıcaklığında 10 dakikalık inkübasyondan sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 250 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve hücreleri iki kez dört mililitre PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 100 kez G'de santrifüj yapın. Yıkadıktan sonra, süpernatantı atın ve hücre peletini 200 mikrolitre saponin geçirgenlik tamponunda tekrar askıya alın.Şimdi süspansiyonu yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 250 kez G'de toplayın. Daha sonra hücreleri 200 mikrolitre birincil antikor çözeltisinde tekrar askıya alın ve karanlıkta gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.Tüpleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 250 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve 100 mikrolitre saponin yıkama çözeltisi ile yıkayın. Hücreleri iki kez yıkadıktan sonra, süpernatantı atın ve hücre peletlerini 500 mikrolitre EdU algılama kokteylinde tekrar askıya alın.Karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 250 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve bir mililitre saponin yıkama çözeltisi ile yıkayın. Yıkamayı iki kez tekrarlayın, süpernatantı atın ve hücre peletlerini 20 ila 50 mikrolitre PBS içinde tekrar askıya alın.Cihazı açmadan önce, atık sıvı şişesini boşaltın ve SpeedBeads, sterilizatör, temizleyici, kabarcık çözücü seviyelerini kontrol edin ve yeterli sıvıları kılıflayın. Cihazı ve görüntüleme yazılımını açtıktan sonra, akışkanları ve sistem kalibrasyonunu başlatmak için başlangıç düğmesine tıklayın. Büyütmeyi 40 kata ayarlayın ve akışkan hızını düşük olarak ayarlayın.Lazerleri açtıktan sonra, EdU Pacific Blue'yu ölçmek için 405 nanometrelik bir lazeri, C12-FDG'yi ölçmek için 488 nanometreyi ve Alexa-Fluor-647-gama-H2AX'i ölçmek için 642 nanometreyi açın. Dağılım kanalı için altı kanalı, parlak alan için birinci kanalı ve dokuzuncu kanalı ayarlayın. Ardından, lazerlerin yoğunluğunu ayarlamak için en yüksek floresana sahip olması beklenen numune ile başlayın ve karıştırmak için numune tüpünü yavaşça çevirin.Tüp kapağını açtıktan sonra, numune tüpünü rıhtıma yerleştirin. Bir dağılım grafiğini başlatmak ve açmak için Yükle'ye tıklayın. Ardından, Özellikler alanını seçin, sırasıyla X ve Y eksenleri için MO1'in altını çizin ve en boy oranı MO1'in altını çizin.Aşağıdaki ve sağ taraftaki çiftleri ve hücre toplamlarını ve sol taraftaki SpeedBead popülasyonunu hariç tutmak için 0,5 en boy oranının üzerinde bir kapı ayarlayın. Şimdi, Histogram Grafiği'ni açın ve X ekseni için bir maskenin ve kanal birin unsur gradyan kökü ortalama karesini seçin. Tekli popülasyonu seçin ve odaklanmış hücreler için seçilecek kapıyı ayarlayın.Bir histogram grafiği açın ve X ekseni kanal iki, yedi ve 11 için ham maksimum piksel yoğunluklarını seçin. Ardından, sırasıyla kanal iki, yedi ve 11 için 488 nanometre, 405 nanometre ve 642 nanometre lazerlerin lazer güçlerini ayarlayın, böylece her florokromun aşırı doygunluğu önlemek için 100 ila 4.000 arasında ham maksimum piksel değeri vardır. Kaydedilecek odaklanmış popülasyonu seçin ve DLBCL örneklerini tutarlı ayarlarla ölçmek için Al'a tıklayın.Numuneleri ölçüm için değiştirirken, numune tüpünü kurtarmak için geri dön'e tıklayın. Örneği atmak için Yükle'ye basın. Tüm numuneler ölçüldükten sonra, parlak alan ve saçılma lazerini kapatın.Bir ücret matrisi oluşturmak için tek renk kontrol örneklerini ölçün. Görüntüleme sistemini kapatmak için Kapat'a tıklayın. Görüntü analiz yazılımındaki verileri analiz edin.Nükleer gama H2AX odaklarını ve canlı hücre görüntülerini otomatik olarak saymak ve ölçmek için görüntü analiz yazılımının Spot Sihirbazı aracını kullanın. Nokta Sihirbazı'nı daha fazla otomatik nokta sayımı analizi için eğitmek üzere biri yüksek, diğeri düşük nokta sayısına sahip iki hücre popülasyonu seçin. Tek hücreli görüntülerde akım sitometri yönteminde artmış C12-FDG pozitif, EdU negatif, gama H2AX pozitif, yaşlanmış popülasyon ve KARPAS422 görüldü.WSU-DLCL2 ve OCI-LY1 hücreleri, ancak SU-DHL6 hücrelerinde değil. Görüntüleme tabanlı analiz, SU-DHL6 hücrelerinde değil, önemli ölçüde daha yüksek sayıda gama H2AX odağı ve KARPAS422, WSU-DLCL2 ve OCI-LY1 sundu. Benzer sonuçlar frekans ve niceleme verileri ile temsil edildi.Hücre süspansiyonuna saponin eklenmesi çok önemlidir, aksi takdirde antikorlar hücre iç antijenlerine ulaşamaz ve sert deterjanlar C12-FTG sinyalinin kaybına neden olur Görüntüleme sitometrisi, belirli uyaranlara yanıt olarak bir transkripsiyon faktörünün çekirdeğe translokasyonu gibi belirteç lokalizasyonundaki değişiklikleri analiz etmek için idealdir. Böyle bir analiz protokolümüzle de sağlanabilir. Bu yöntem, bireysel sinyallerin varlığını, yoğunluğunu ve lokalizasyonunu tespit etmeye yardımcı olan tek hücre seviyesinde çoklu floresan belirteçlerin görselleştirilmesine izin verir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Akış Sitometresi tabanlı uyuşturucu Glioblastoma kök hücre hücresel farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlanması için eleme sistemi

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

Multipl Miyelom kemik iliği Xenografts NOG farelerde Multimodal kollarındaki ve pozitronik emisyon tomografi/Hesaplamalı tomografi görüntüleme

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Floresan peptid Zymography tarafından proteaz aktivitesinin algılama

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Ultrason Görüntüleme ile Farelerde Akciğer Tümörü İlerlemesinin Saptanması

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Zebrabalığında Fonksiyonel Floresan Silika Nano partikülleri ile Ksenogreftli İnsan Kanser Hücrelerinin Vivo Hedeflemesinde

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

İnsan Kolon Kanseri Hücrelerinde DNA Hasarı ve Onarım Foci İmmünofloresan Görüntüleme

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated ÃƒÅ½Ã‚Â²-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Akış Sitometrisi ile Yaşlanan Tümör Hücrelerinin Tanımlanması ve Zenginleştirilmesi için Uzak Kırmızı Floresan Yaşlanma İlişkili β-Galaktosidaz Probu

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Kanser Hücrelerinin İç Karotis Arter Enjeksiyonu ile Beyin Metastazının Modellenmesi

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

Bir Antikanser Aptamerinin Seçiciliğini ve Özgüllüğünü Değerlendirmek için Akış Sitometrisine Dayalı Hücre Yüzeyi Protein Bağlama Testi

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Farelerde Hasta Kaynaklı Kanser Hücrelerinin Ortotopik İmplantasyonu, İleri Kolorektal Kanseri Özetliyor

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...