Name: measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل وكالة المنح في جمهورية التشيك (18-02699S) ، ومشروع البحث المؤسسي للأكاديمية التشيكية للعلوم (RVO 68378050) ، ومشروع MEYS CR NICR EXCELES (LX22NPO05102). CIISB ، مركز Instruct-CZ التابع لاتحاد Instruct-ERIC EU ، بتمويل من مشروع البنية التحتية MEYS CR LM2018127 ومشروع الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية "UP CIISB" (رقم. CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) ماليا القياسات في CF Nanobiotechnology, CEITEC MU. كما نعترف بالمرفق الأساسي للفحص المجهري الضوئي ، IMG CAS ، براغ ، جمهورية التشيك ، بدعم من MEYS (LM2018129 ، CZ.02.1.01 / 0.0 / 0.0 / 18_046 / 0016045) و RVO: 68378050-KAV-NPUI ، لدعمهم مع التصوير المجهري المقدم هنا.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

يوفر البروتوكول المقدم طريقة قابلة للتكرار خطوة بخطوة لقياس AFM لأنسجة كبد الفأر الطبيعية والليفية. يوفر الفحص المجهري للاستقطاب المقترن دقة مكانية عالية ويتيح تصور ألياف الكولاجين بسبب انكسارها. علاوة على ذلك ، يتم توفير وصف مفصل لتحليل منحنيات القوة التي تم الحصول عليها. يمكن إجراء قياس صلابة AFM على المستوى الخلوي ، مما يسمح بمراقبة التغيرات المحلية في الخواص الميكانيكية لأنسجة الكبد بسبب تطور مرض ليفي. تليف الكبد ليس عملية متجانسة تؤثر على العضو بأكمله. على العكس من ذلك ، تتخلل مناطق الحاجز الليفي الغني بالكولاجين مناطق ذات رواسب كولاجين منخفضة أو معدومة. وبالتالي ، فإن تغيرات الصلابة خاصة بالبيئة المكروية المحلية وتؤثر فقط على الخلايا الملامسة محليا للمناطق التي تضررت من الإصابة. هذا المقياس المجهري لعدم تجانس الصلابة واضح أيضا في تفاصيل خرائط معامل AFM Young ، حيث تحد نقاط الصلابة العالية مناطق الصلابة الطبيعية تقريبا. يوضح هذا الاختلاف أنه حتى منطقة أنسجة ندبة الكولاجين ليست متجانسة ميكانيكيا وتتطلب قياس AFM ليتم توصيفه على المستوى الخلوي (الشكل 4).
يسمح البروتوكول المقدم بقياسات تصلب الكبد بواسطة AFM بشكل مستقل عن مجموعة الكبد ، حيث يمكن تخزين فصوص الكبد بأكملها المضمنة في OCT لفترة طويلة عند -80 درجة مئوية. ومع ذلك ، بمجرد تقسيم الأنسجة ، نوصي بقياس العينات في غضون ~ 2 أسابيع حيث لاحظنا تليين تدريجي لأقسام الأنسجة المخزنة لفترات زمنية أطول (الشكل 5).
يسمح AFM المجهز بمجهر الاستقطاب بتحديد منطقة الاهتمام بدقة داخل بنية فصيص الكبد. ومع ذلك ، فإنه يحتوي أيضا على بعض القيود التي يجب مراعاتها عند تفسير النتائج. تم قياس قيم الصلابة التي تم الحصول عليها هنا في درجة حرارة الغرفة. نفترض أن تأثيرات درجة الحرارة على الخواص الميكانيكية للأنسجة الرخوة ستكون صغيرة ؛ ومع ذلك ، قد يكون هذا أحد أسباب الاختلافات بين القيم المبلغ عنها في الجسم الحي للخواص الميكانيكية لأنسجة الكبد والقيم في هذه الدراسة.
علاوة على ذلك ، يسمح هذا البروتوكول بتحليل AFM لأنسجة الكبد لمدة تصل إلى 3 ساعات ، الأمر الذي يتطلب تثبيتا خفيفا للأنسجة. من المرجح أن يؤثر التثبيت المعتدل لأقسام الأنسجة ، وكذلك دورة التجميد والذوبان ، على القيم المطلقة لمعامل يونغ. وبالتالي ، قد تختلف القيم المبلغ عنها لوحدات يونغ عن القيم في الجسم الحي . هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحسين بروتوكول قياس القيم المطلقة لمعامل يونغ من أقسام الكبد ، والتي يمكن تحقيقها بطريقة مختلفة لتثبيت أنسجة الكبد64.
ومع ذلك ، لاحظنا زيادة تصلب المناطق الغنية بالكولاجين في كبد الفئران المعالجة ب CCl4 لمدة 3 أسابيع مقارنة ب 6 أسابيع. تتوافق هذه التغييرات مع تطور التليف أثناء الإصابة المطولة (الشكل 4) وتظهر أنه يمكن التحقيق في الاختلافات النسبية بين العلاجات المختلفة باستخدام البروتوكول المقدم. هذا يتفق مع ملاحظات Calò et al. ، الذين أظهروا أن أقسام الكبد الثابتة بشكل معتدل تظهر اختلافات مماثلة في قيم الصلابة بين المناطق الغنية بالكولاجين والمناطق التي تفتقر إلى الكولاجين كما هو الحال في الأنسجة الطازجة25.
استخدمنا الكابولي SD-qp-BioT-TL-10 (ثابت الربيع النظري ~ 0.09 نيوتن / م) المعدل بطرف كروي قطره 5.7 ميكرومتر لتقليل الاضطراب الميكانيكي لأنسجة الكبد أثناء القياسات. مكنت حبة 5.7 ميكرومتر المسافة البادئة الكافية للعينة للتحقق من صلابتها مع الحفاظ على سلامتها. يمكن استخدام حبة ذات قطر أصغر ، بعد عدة تحسينات ، للحصول على دقة أعلى في خرائط الصلابة ولكنها قد تؤدي إلى مزيد من المبالغة في تقدير قيم معامل يونغ (لمزيد من التفاصيل ، انظر Crichton et al.65). باستخدام مجموعة حبيبات الكابولي المحددة ، تمكنا من توصيف صلابة العينة في نطاق واسع ، من عشرات الوحدات من Pa إلى ~ 100 كيلو باسكال.
تم استخدام نموذج سنيدون لاشتقاق معامل يونغ من منحنيات القوة ، لأنه يسمح بتحليل المسافات البادئة العميقة باستخدام المجسات الغروية62. نموذج سنيدون ، على عكس نموذج هيرتز ، لا يعاني من القيد المتمثل في أن نصف قطر التلامس يجب أن يكون أصغر بكثير من نصف قطر الكرة. يفترض كذلك أن سمك العينة أكبر بعدة مرات من عمق المسافة البادئة30,66. في الدراسة الحالية ، كانت المسافة البادئة ~ 2 ميكرومتر بحجم حبة 5.7 ميكرومتر وسمك عينة 30 ميكرومتر في المناطق الغنية بالكولاجين. وهكذا ، كان نموذج سنيدون مناسبا. نماذج أخرى63 بالنظر إلى قوة الالتصاق بين الطرف والركيزة يمكن استخدامها لأنواع مختلفة من الأنسجة.
ينفذ التحليل في AtomicJ تصحيحات للسمك المحدود للعينات لتقليل مساهمة الركيزة أثناء اشتقاق معامل يونغ62,67. في تحليل منحنيات القوة التي تم الحصول عليها ، استخدمنا نسبة بواسون واحدة تبلغ 0.45 ، والتي تمت التوصية بها سابقا لأعضاء الأنسجة الرخوة24. هذا التقريب ليس له تأثير كبير على القيم المحسوبة لمعامل يونغ ، حيث أن التغير في قيمة نسبة بواسون من 0.4 إلى 0.5 ينتج عنه فقط انخفاض 0.893x في قيم معامل يونغ المحسوبة وفقا لمعادلة سنيدون. بالنظر إلى الاختلافات المتعددة في معامل يونغ بين الفترات المختلفة لعلاجات CCl4 ، فإن الأخطاء الناتجة عن تقريب نسبة بواسون هامشية فقط.
استخدمنا منحنيات السحب لحساب قيم الصلابة ، حيث كنا مهتمين بالاستجابة المرنة للأنسجة للحمل الذي يوفره الكابولي بدلا من الاستجابة البلاستيكية للمسافة البادئة68. نظرا للاستجابة اللزجة المرنة للأنسجة الرخوة ، قد تبالغ منحنيات السحب المناسبة في تقدير معامل يونغ ، والذي يجب أخذه في الاعتبار. علاوة على ذلك ، لاحظنا أن تحليل البيانات باستخدام منحنيات النهج ينتج عنه اتجاهات مماثلة في قيم الصلابة بين المناطق الليفية ومناطق التحكم ، على الرغم من أن القيم المطلقة أقل في المقابل (البيانات غير معروضة).
أثناء تحسين البروتوكول ، حددنا عدة خطوات حاسمة لتكرار القياسات. أولا ، من المهم التأكد من أن الخرزة موجودة تقريبا في وسط الطرف الشفاف أثناء ربطها بالكابولي. هذا يمنع عدم التوازن الميكانيكي المحتمل أثناء المسافة البادئة. ثانيا ، أثناء تثبيت الكبد مع PFA ، من الضروري اتباع الحدود الزمنية للذوبان والتثبيت بدقة. قد يؤثر تغيير توقيت هذه الخطوة بشدة على الخواص الميكانيكية لأقسام الأنسجة. ثالثا ، يجب معايرة الكابولي بشكل متكرر مع المراقبة المستمرة وإدخال قيم درجة الحرارة المتزامنة لتجنب أي قطع أثرية تحدث في قيم الصلابة بسبب تقلبات درجة الحرارة. أخيرا ، لا ينبغي قياس قسم كبد واحد لمدة تزيد عن 3 ساعات من التحضير ، حيث قد يتبخر برنامج تلفزيوني متراكب على مدى فترات أطول. يمكن للقراء الرجوع إلى جدول استكشاف الأخطاء وإصلاحها (الجدول 3) لحل المشكلات التي تمت مواجهتها أثناء قياس AFM ، والتي تمت مناقشتها أيضا بإسهاب في Norman et al.46.
الجدول 3: دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%203v2.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>
يسمح البروتوكول المقدم بفحص AFM القابل للتكرار لأنسجة الكبد. لديه القدرة على الكشف عن معلومات حول تطور مرض الكبد الليفي وانحداره في نهاية المطاف على المستوى المجهري ويمكن أن يساهم في تطوير علاجات تستهدف مناطق الندبة الليفية التي تشكلت أثناء تطور مرض الكبد المزمن.

الكبد عضو حيوي للحفاظ على التوازن في الكائنات الحية 1,2. تمثل أمراض الكبد المزمنة ~ 2 مليون حالة وفاة في جميع أنحاء العالم سنويا3. تنشأ بشكل شائع مثل الالتهابات الفيروسية أو اضطرابات المناعة الذاتية أو متلازمات التمثيل الغذائي أو الأمراض المرتبطة بتعاطي الكحول ويرافقها تليف الكبد التدريجي. تثير إصابة الكبد استجابة التهابية ، مما يؤدي إلى تنشيط الخلايا التي ترسب مصفوفة خارج الخلية (ECM) في استجابة التئام الجروح. ومع ذلك ، في وجود إهانة مزمنة ، تشكل ECM الزائدة أنسجة ندبة لم يتم حلها داخل الكبد ، مما يؤدي إلى تطور تليف الكبد وتليف الكبد وسرطان الكبد ، وفي النهاية إلى فشل الكبد4.
تؤدي إصابة خلايا الكبد على الفور إلى زيادة تصلب الكبد 5,6. يؤثر هذا بشكل مباشر على وظيفة خلايا الكبد ، وينشط الخلايا النجمية الكبدية (HSCs) والخلايا الليفية البابية ، ويؤدي إلى تمايزها إلى الخلايا الليفية العضلية المودعة للكولاجين 7,8. يزيد ترسب ECM الليفي من تصلب الكبد ، مما يخلق حلقة تغذية مرتدة ذاتية التضخيم لتصلب الكبد وتنشيط الخلايا المنتجة للمصفوفة.
وبالتالي ، أصبح تصلب الكبد معلمة مهمة في تشخيص أمراض الكبد. يمكن اكتشاف التغير في خصائص الأنسجة الميكانيكية الحيوية في وقت أبكر من تشخيص التليف عن طريق التحليل النسيجي. لذلك ، تم تطوير تقنيات مختلفة لقياس تصلب الكبد في كل من التطبيقات البحثية والسريرية. في الإعدادات السريرية ، تم استخدام التصوير الإلستوجرافي العابر (TE) 9،10،11،12،13 والتصوير الإلستوجرافي بالرنين المغناطيسي (MRE)14،15،16،17،18 لتشخيص المراحل المبكرة من تلف الكبد بشكل غير جراحي من خلال فحص تصلب الكبد الإجمالي 19.
في TE ، يتم نشر الموجات فوق الصوتية ذات السعة الخفيفة والتردد المنخفض (50 هرتز) عبر الكبد ، ويتم قياس سرعتها ، والتي تستخدم بعد ذلك لحساب معامل مرونة الأنسجة13. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية ليست مفيدة للمرضى الذين يعانون من الاستسقاء أو السمنة أو انخفاض المساحات الوربية بسبب الانتقال غير السليم للموجات فوق الصوتية عبر الأنسجة المحيطة بالكبد9.
يعتمد التصوير بالرنين المغناطيسي على طريقة التصوير بالرنين المغناطيسي ويستخدم موجات قص ميكانيكية 20-200 هرتز لاستهداف الكبد. ثم يتم استخدام تسلسل تصوير بالرنين المغناطيسي محدد لتتبع الموجات داخل الأنسجة وحساب تصلب الأنسجة16. ترتبط قيم الصلابة المبلغ عنها باستخدام كل من تقنيات TE و MRE بشكل جيد مع درجة تليف الكبد التي تم الحصول عليها من خزعات عينات الكبد البشرية المصنفة باستخدام درجات METAVIR النسيجية20 (الجدول 1). كما تم تكييف TE و MRE لقياس تصلب الكبد في نماذج القوارض لأغراض البحث21،22،23. ومع ذلك ، نظرا لأن كلتا الطريقتين تستمدان قيم الصلابة من استجابة الأنسجة لموجات القص المنتشرة ، فقد لا تعكس القيم التي تم الحصول عليها الصلابة الميكانيكية المطلقة للنسيج.
من أجل توصيف ميكانيكي مباشر لكبد القوارض ، طور بارنز وآخرون مقايسة نموذجية للأنسجة الهلامية (مقايسة MGT) تتضمن تضمين أنسجة الكبد في هلام بولي أكريلاميد24. يتم ضغط هذا الجل بواسطة قوة موحدة نابضة يمكن من خلالها حساب معامل يونغ. يظهر اختبار MGT ارتباطا جيدا مع مقايسة المسافة البادئة المكيفة لكل من الكبد الطبيعي والليفي24 (الجدول 1).
الجدول 1: قيم تصلب الكبد على المستوى السائب. TE و MRE مقارنة بالقياسات الميكانيكية المباشرة خارج الجسم الحي لوحدات مرونة الكبد باستخدام المسافة البادئة ومقايسات MGT للكبد من مصادر مختلفة. يتم إعطاء العلاقة بين E و G بواسطة E = 2G (1 + v) ، حيث v هي نسبة بواسون للعينة ؛ تمثل F0 إلى F4 درجة التليف في نظام تسجيل METAVIR ، حيث يشير F0 إلى تليف منخفض أو معدوم وكبد تليف الكبد التليف الكبدي F4. الاختصارات: TE = التصوير الإلستوجرافي العابر ؛ MRE = التصوير الإلستوجرافي بالرنين المغناطيسي ؛ MGT = نموذج هلام الأنسجة. E = معامل المرونة (يونغ) ؛ G = معامل القص. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%201v2.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>
أحد العيوب الرئيسية لقياسات تصلب الكبد العامة هو أنها لا توفر دقة على المستوى الخلوي لعدم تجانس تصلب الكبد. أثناء تطور التليف ، تظهر المناطق الغنية بالكولاجين صلابة أعلى مقارنة بالحمة المحيطة25,26. يؤثر تدرج الصلابة هذا محليا على الخلايا المقيمة ويلعب دورا مهما في دفع عدم تجانس HSC27. وبالتالي ، يجب تمييز التغييرات في الخواص الميكانيكية المحلية أثناء تطور أمراض الكبد على المستوى المجهري لفهم تطور التليف بشكل أفضل.
يسمح AFM بقياس الخواص الميكانيكية للأنسجة بدقة عالية وحساسية عالية للقوة. يستخدم AFM طرف الكابولي لوضع مسافة بادئة لسطح العينة بقوى منخفضة تصل إلى عدة بيكونيوتون ، مما يؤدي إلى تشوه على المستوى المجهري أو النانوي بناء على هندسة وحجم الطرف المستخدم. ثم يتم قياس استجابة قوة العينة للإجهاد المطبق على أنه الانحراف في الكابولي28. يتم جمع منحنيات إزاحة القوة من نهج وتراجع الكابولي ، والتي يمكن تزويدها بنماذج ميكانيكا التلامس المناسبة لتقييم الصلابة المحلية للعينة29.
بالإضافة إلى قياس صلابة منطقة معينة ، يمكن ل AFM أيضا توفير معلومات طبوغرافية حول ميزات محددة في العينة ، مثل بنية ألياف الكولاجين30،31،32. وصفت دراسات متعددة تطبيق AFM لقياس صلابة الأنسجة السليمة والمريضة المختلفة ، مثل الجلد 32،33 ، الرئة 34،35 ، الدماغ 36 ، الثدييات37،38،39 ، الغضروف 40 ، أو القلب 41،42،43،44 من عينات نموذج المريض والفأر. علاوة على ذلك ، تم استخدام AFM أيضا في المختبر لتحديد صلابة الخلايا وسقالات البروتين خارج الخلية45،46،47.
قياس الخواص الميكانيكية للعينات البيولوجية باستخدام AFM غير تافه بسبب نعومتها وهشاشتها. وهكذا ، قامت دراسات مختلفة بتوحيد الظروف والإعدادات المختلفة ، والتي تسفر عن قيم متقلبة على نطاق واسع لوحدات يونغ (تمت مراجعتها بواسطة Mckee et al.48). على غرار الأنسجة الرخوة الأخرى ، تظهر قيم معامل الكبد يونغ عند درجات مختلفة من تليف الكبد أيضا تباينا كبيرا (الجدول 2). تنشأ الاختلافات في قيم معامل يونغ من الاختلافات في طريقة تشغيل AFM ، وطرف الكابولي ، وطريقة تحضير العينة ، وسمك العينة ، وعمق المسافة البادئة والقوى ، وبيئة أنسجة الكبد أثناء القياس ، وطريقة التحليل (الجدول 2).
الجدول 2: قيم تصلب الكبد على المستوى الخلوي. تصف قيم تصلب الكبد التي تم الحصول عليها باستخدام AFM الخواص الميكانيكية للكبد على المستوى الخلوي. الاختصارات: AFM = مجهر القوة الذرية ؛ E = معامل المرونة (يونغ) ؛ PFA = بارافورمالدهيد ؛ PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%202v2.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>
تصف هذه الورقة بروتوكولا للقياس القابل للتكرار لوحدات يونغ للمناطق الليفية الغنية بالكولاجين في أنسجة الكبد بواسطة AFM مع توطين دقيق يوفره استخدام الفحص المجهري للاستقطاب. قمنا بإعطاء رابع كلوريد الكربون (CCl4) للحث على ترسب الكولاجين بطريقة فصية مركزية49 في نموذج فأر ، يحاكي بشكل موثوق الجوانب الحاسمة لتليف الكبد البشري50. تتيح الصور المجهرية المستقطبة تصور الكولاجين في الكبد بسبب انكسار ألياف الكولاجين51 ، مما يسمح بتحديد المواقع الدقيقة لطرف الكابولي فوق منطقة الاهتمام المرغوبة داخل الفصيص الكبدي52.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >AFM head</td>
			<td >Bruker</td>
			<td >JPK nanowizard 3</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cameras</td>
			<td >Andor</td>
			<td >Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >The Imagingsource&#160;</td>
			<td >S/N:12310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cantilever</td>
			<td >SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors</td>
			<td>S/N:73750F05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryotome</td>
			<td >Leica&#160;</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epoxy resin glue (Long working time )</td>
			<td >Bison epoxy universal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Melamine beads; diameter, 5.7 um</td>
			<td >Microparticles, GmbH</td>
			<td>MF-R-5.7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td>&#160;IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrophobic&#160; slide marker</td>
			<td >SuperHT</td>
			<td>PAP PEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td >JPK nanowizard&#160; v6.1.151</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >AtomicJ v2.3.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost slides</td>
			<td >Thermoscientific</td>
			<td>ref no. J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >System</td>
			<td >Ubuntu 14.04.5 LTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibration isolation control unit</td>
			<td >Tablestable</td>
			<td>AVI-200-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy

تم التعرف على تصلب المصفوفة كأحد الدوافع الرئيسية لتطور تليف الكبد. له تأثيرات عميقة على جوانب مختلفة من سلوك الخلية مثل وظيفة الخلية والتمايز والحركة. ومع ذلك ، نظرا لأن هذه العمليات ليست متجانسة في جميع أنحاء العضو بأكمله ، فقد أصبح من المهم بشكل متزايد فهم التغيرات في الخواص الميكانيكية للأنسجة على المستوى الخلوي.
لتكون قادرا على مراقبة تصلب المناطق الغنية بالكولاجين داخل فصوص الكبد ، تقدم هذه الورقة بروتوكولا لقياس وحدات مرونة أنسجة الكبد بدقة مكانية عالية بواسطة مجهر القوة الذرية (AFM). AFM هي طريقة حساسة مع إمكانية توصيف الخواص الميكانيكية المحلية ، محسوبة على أنها معامل يونغ (يشار إليه أيضا باسم المرن). يمكن استخدام AFM إلى جانب الفحص المجهري للاستقطاب لتحديد مناطق تطور التليف على وجه التحديد بناء على انكسار ألياف الكولاجين في الأنسجة. باستخدام البروتوكول المقدم ، قمنا بتمييز صلابة المناطق الغنية بالكولاجين من كبد الفئران الليفية والمناطق المقابلة في كبد الفئران الضابطة.
لوحظت زيادة ملحوظة في صلابة المناطق الإيجابية للكولاجين مع تطور التليف. يسمح البروتوكول المقدم بطريقة قابلة للتكرار بدرجة كبيرة لقياس AFM ، بسبب استخدام أنسجة الكبد الثابتة بشكل معتدل ، والتي يمكن استخدامها لزيادة فهم التغيرات التي يسببها المرض في الخواص الميكانيكية للأنسجة المحلية وتأثيرها على مصير الخلايا المجاورة.

تم فحص أقسام الكبد الثابتة بشكل معتدل ، والتي يبلغ سمكها 30 ميكرومتر والتي تم الحصول عليها من الفئران الضابطة ومن الفئران المصابة بالتليف الخفيف أو المتقدم (الناجم عن حقن CCl4 لمدة 3 أسابيع أو 6 أسابيع ، على التوالي49) باستخدام AFM كما هو موضح في هذا البروتوكول. تم اختيار ألياف الكولاجين القريبة من الأوردة المركزية لقياس خرائط الصلابة. تم تحليل المناطق القريبة من الأوردة المركزية ، والتي تتوافق مع المناطق التي تتشكل فيها ألياف الكولاجين في الحيوانات المعالجة ب CCl 4 عادة ، في الكبد الضابط (الشكل 4 أ). كان توزيع وحدات يونغ قابلا للتكرار عبر كبد التحكم المختلفة والمناطق الغنية بالكولاجين داخل قسم كبد واحد (الشكل 4 ب: مخطط الكمان الأيسر).
في الحيوانات المعالجة ب CCl 4 ، أظهرت خرائط الصلابة المقابلة للمناطق المحيطة بالمركز لرواسب الكولاجين قيما أعلى بكثير لمعامل يونغ مقارنة بالمناطق المكافئة في الفئران الضابطة (الشكل 4B: 1.9 كيلو باسكال مقابل 2.6 كيلو باسكال قيم معامل يونغ للتحكم مقابل 3 أسابيع CCl 4 فأر معالج ؛ p = 0.07 ؛ 1.9 كيلو باسكال مقابل 5.1 كيلو باسكال قيم معامل يونغ للتحكم مقابل 6 أسابيع CCl 4 -الفأر المعالج. ع = 0.02). علاوة على ذلك ، كانت هناك زيادة كبيرة في قيم معامل يونغ مع معالجة CCl 4 أطول (الشكل 4B ؛ 2.6 كيلو باسكال مقابل 5.1 كيلو باسكال متوسط قيم معامل يونغ لمدة 3 أسابيع مقابل 6 أسابيع CCl4 فأر معالج ؛ p = 0.04). هذا يدل على تصلب تدريجي لرواسب الكولاجين مع تطور التليف وأن قياسات AFM تعكس تكوين الليف.
لتقييم تأثير التخزين المطول لأقسام الكبد المضمنة في OCT على الخواص الميكانيكية لألياف الكولاجين ، قمنا بقياس صلابة ألياف الكولاجين في أقسام الفئران المعالجة ب CCl4 ، والتي تم تخزينها عند -80 درجة مئوية لمدة 2 أسابيع أو 3 أشهر على الشريحة بعد القطع (الشكل 5). أظهرت قياسات AFM قيما أقل بكثير لمعامل يونغ في المناطق الغنية بالكولاجين للأقسام المخزنة لمدة 3 أشهر مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها من المقاطع المقاسة في غضون أسبوعين من تقسيم العينة (الشكل 5 ؛ 4.7 كيلو باسكال مقابل 3.6 كيلو باسكال متوسط قيم معامل يونغ لمدة أسبوعين مقابل 3 أشهر تخزين ؛ ص < 0.001). وبالتالي ، من المهم قياس الخواص الميكانيكية لأنسجة الكبد بعد وقت قصير من تحضير الأقسام من فصوص الكبد المدمجة في OCT.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig04.jpg"> الشكل 4: تكشف قياسات AFM عن تصلب تدريجي للمناطق الغنية بالكولاجين المرتبط بعلاج CCl4 لفترات طويلة. (أ) تم استخدام أقسام الكبد من الفئران الضابطة والفئران المعالجة ب CCl4 لمدة 3 أسابيع أو 6 أسابيع لقياس الخواص الميكانيكية للمناطق الغنية بالكولاجين. المناطق المحاصرة لأقسام الكبد الموضحة في صور الفحص المجهري المستقطب (يسار) هي مناطق مسح غنية بالكولاجين (أو مناطق مقابلة في الكبد الضابط) تم اختيارها لقياسات AFM (30 ميكرومتر × 100 ميكرومتر ، 10 بكسل × 36 بكسل). تظهر خرائط معامل يونغ ذات المقاييس اللونية المقابلة لهذه المناطق المربعة على اليمين ، بما في ذلك الرسوم البيانية لقيم معامل يونغ من هذه الخرائط ؛ تظهر مخططات التشتت المضمنة قيما >10 كيلوباسكال لكل شرط. يتم تصور تصلب الكبد على أنه تحول تدريجي نحو اليمين في توزيع الرسم البياني وتكرار أعلى للنقاط في مخطط التشتت الداخلي. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (ب) تظهر مخططات الكمان توزيع الوحدات المرنة من ثلاث مناطق تم قياسها لكل حالة (يسار) وتلخيص قيم الوحدات المرنة من جميع الخرائط الثلاث (يمين). تظهر مخططات الكمان الوسيط (الخط الأحمر) والنسبةالمئوية 25 والنسبة المئوية 75 (الخطوط السوداء) ؛ تمثل النقاط القيم المتوسطة للخرائط الفردية من المناطق 1-3. تم حساب قيم p المقدمة باستخدام اختبار t للطالب الذي تم إجراؤه على الوسائل. الاختصارات: AFM = مجهر القوة الذرية ؛ جL4 = رابع كلوريد الكربون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig04large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig05.jpg"> الشكل 5: يؤدي التخزين الممتد لأقسام الكبد إلى انخفاض في صلابة المناطق الغنية بالكولاجين. تم استخدام أقسام الكبد (المحضرة من الفئران المعالجة ب CCl4 لمدة أسبوعين) المخزنة عند -80 درجة مئوية لمدة أسبوعين أو 3 أشهر لقياس معامل يونغ. صور مجهرية مستقطبة (يسار) مع مربعات تشير إلى المناطق الغنية بالكولاجين المستخدمة لقياس AFM (30 ميكرومتر × 100 ميكرومتر ، 10 بكسل × 36 بكسل). خرائط معامل يونغ المقابلة مع مقاييس الألوان (يمين). تظهر الرسوم البيانية قيم معامل يونغ التي تم جمعها من 4-6 مناطق في كل عينة. تظهر الرسوم البيانية المبعثرة المضمنة قيما >10 كيلوباسكال لكل شرط. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: AFM = مجهر القوة الذرية ؛ جL4 = رابع كلوريد الكربون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig05large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
الشكل التكميلي S1: طريقة لتعديل الكابولي باستخدام حبة صغيرة من راتنج الميلامين. (أ) يوضح الرسم التخطيطي ارتباط حبة كروية بطرف الكابولي. للحصول على وصف تدريجي ، انظر القسم 2 ، الجزء 1 ، مرفق حبة 5.7 ميكرومتر بطرف ناتئ AFM. (ب) صورة مجهرية لخرزة كروية طولها 5.7 ميكرومتر متصلة بطرف الكابولي الموضح من الأعلى (يسار) والمنظر الجانبي (يمين). قضبان المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: AFM = مجهر القوة الذرية ؛ RT = درجة حرارة الغرفة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%201.pdf" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الشكل التكميلي S2: تحليل البيانات في AtomicJ. (أ) تسلسل الخطوات الواجب اتباعها لفتح خرائط الصلابة في AtomicJ. بنقرة واحدة بزر الماوس الأيسر على منحنيات قوة العملية والخرائط (x) تفتح مساعد المعالجة. يمكن تحميل الملفات إلى مساعد المعالجة بالنقر فوق إضافة (y) وتحديد الملفات المطلوبة. انقر فوق التالي (z) للمتابعة إلى الخطوة التالية. (ب) معلمات تركيب المنحنى ، ونموذج ميكانيكا الاتصال المناسب ، وإعدادات AFM المستخدمة أثناء القياس. تشير الخطوات من 1 إلى 11 إلى النقاط الفرعية المقابلة المفصلة في البروتوكول الخطوة 3 ، القسم 5 ، تحليل البيانات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary_fig_2.pdf" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الشكل التكميلي S3: مخطط البيانات التي تم تحليلها في AtomicJ. تظهر معاينة البيانات التي تم تحليلها خرائط الصلابة (النافذة العلوية اليسرى) ومنحنيات القوة (النافذة اليمنى العليا) والبيانات الأولية (النافذة السفلية). اختصار: AFM = مجهر القوة الذرية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%203.pdf" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy at JoVE.com

Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

نقدم بروتوكولا لقياس الوحدات المرنة للمناطق الغنية بالكولاجين في الكبد الطبيعي والمريض باستخدام مجهر القوة الذرية. يوفر الاستخدام المتزامن لمجهر الاستقطاب دقة مكانية عالية لتوطين المناطق الغنية بالكولاجين في أقسام الكبد.

قياس تصلب الكبد باستخدام مجهر القوة الذرية إلى جانب مجهر الاستقطاب

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

يوفر بروتوكولنا تمييزا بين المناطق الغنية بالكولاجين والكولاجين التي تفتقر إلى أقسام الكبد. وبالتالي يمكن استخدامه لدراسة عمليات تكوين الألياف في تفاصيل أكبر. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في استخدام الفحص المجهري المستقطب لتحديد المناطق الغنية بالكولاجين في أقسام الكبد.يمكن أن توفر بروتوكولاتنا نظرة ثاقبة لتطور تليف الكبد ، ويمكن أيضا اعتمادها للأنسجة الرخوة الأخرى مثل الرئتين بعد تحسينات معينة. للبدء ، قم بإزالة أقسام الكبد المجمدة من 80 درجة مئوية تحت الصفر ، وقم بإذابتها في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. ثبت المقاطع بالثلج البارد 4٪ بارافورمالدهيد في PBS لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، تليها الغسيل خمس مرات باستخدام PBS.بعد الغسيل الأخير ، امسح PBS الزائد حول قسم الكبد باستخدام الأنسجة ، وحدد حدا يبلغ حوالي سنتيمترين في أربعة سنتيمترات حول قسم الكبد بقلم علامة كاره للماء. قم بتغطية العينة باستخدام PBS ، ثم قم بتحميل العينة على مرحلة AFM ، وقم بتغطيتها برأس AFM. في مجهر القوة الذرية أو برنامج AFM ، انتقل إلى علامة تبويب الإعداد وحدد علامة على الحفظ التلقائي لحفظ جميع الملفات تلقائيا.ثم حدد اسم الملف والدليل لحفظ ملفات القياس بالانتقال إلى علامة تبويب الإعداد والنقر فوق حفظ الإعدادات. اقترب من سطح الأنسجة باستخدام الكابولي AFM عن طريق تشغيل الليزر والنقر على مفتاح الاقتراب. بعد اكتمال النهج ، اسحب طرف الكابولي بالنقر فوق مفتاح التراجع مرة واحدة ، والذي يسحب الكابولي إلى الطرف العلوي من نطاق بيزو.إذا لزم الأمر ، أعد محاذاة الكاشف باستخدام مقابض على رأس AFM. أطفئ الليزر. النصيحة هي الآن في بؤرة الهدف.بعد ذلك ، قم بتراكب المجال البصري للمجهر باستخدام خرائط قياس AFM بالنقر فوق علامة التبويب الملحقات وتحديد المعايرة البصرية المتراكبة المباشرة. في النافذة التالية ، انقر فوق التالي لالتقاط سلسلة من الصور للناتئ الذي يقوم بمسح منطقة معينة. انقر فوق التالي مرة أخرى للانتقال إلى النافذة التالية.في الصورة الأولى ، انقر فوق وسط طرف الكابولي يدويا لتصوير موضع الطرف في البرنامج. يمكن التلاعب بحجم الدائرة التي تصور موضع الطرف من خلال الإشارة إلى نصف قطرها لزيادة الدقة. انقر فوق معايرة لاكتشاف موضع طرف الكابولي في جميع الصور تلقائيا.تأكد من دقة اكتشاف التلميح من خلال تصفح الصور. انقر فوق التالي، ثم قم بإنهاء لإنهاء التراكب البصري. بعد ذلك ، حرك المسرح لوضع منطقة غنية بالكولاجين داخل المربع الأخضر ، مرئية في علامة تبويب عارض البيانات ، باستخدام الصورة المستقطبة.حدد المنطقة الغنية بالكولاجين عن طريق تحديد المنطقة الموجودة أسفل علامة تبويب الشبكة ، ثم إنشاء مستطيل في علامة تبويب عارض البيانات باستخدام الضغط لفترة طويلة على زر الماوس الأيسر داخل المربع الأخضر المحدد. انقر فوق تأكيد منطقة المسح الجديدة لتعيين المنطقة المحددة كمنطقة قياس. اضبط معلمات حلقة الملاحظات.تعيين I كسب عند 50 هرتز وكسب P عند 0.001. ثم اضبط نقطة الضبط على نانو نيوتن واحد. حدد قيمة نقطة الضبط النسبية وفقا للخواص الميكانيكية للمواد المدروسة وصلابة الكابولي.حدد خط أساس عادل ليلائم منحنيات القوة بشكل صحيح. ثم حدد طول حركة الكابولي في المحور Z وفقا لتضاريس سطح العينة. اضبط حركة Z على مدة ثابتة.اضبط وقت التمديد على ثانية واحدة مع تأخير التمديد والتراجع على أنه صفر. تعيين معدل العينة في 5،000 هيرتز. ضع علامة أمام الحلقة المغلقة Z لضبط المسافة بين العينة وطرف الكابولي تلقائيا أثناء القياسات.ثم قم بفك تعشيق التحكم الآلي في المرحلة عن طريق إلغاء تحديد زر التعشيق. قم بتشغيل الليزر واقترب من العينة باستخدام الكابولي. انقر فوق بدء المسح لجمع منحنيات مسافة القوة.تحليل البيانات المكتسبة باستخدام برنامج AtomicJ مفتوح المصدر. قم بتحميل منحنيات القوة في البرنامج بالنقر فوق منحنيات قوة العملية وأيقونة الخرائط. ثم في مساعد المعالجة ، أضف الخرائط المراد تحليلها بالنقر فوق زر الإضافة.بعد تحميل الخرائط ، انقر فوق التالي. حدد إعدادات المعالجة في النافذة التالية. لتقدير نقطة الاتصال بين العينة والكابولي تلقائيا باستخدام مجموعة من معلمات منحنى التركيب ، استخدم التقدير التلقائي لنقطة الاتصال.حدد نقطة الاتصال بين الكابولي والعينة بطريقة الشبكة المركزة الكلاسيكية. حدد طريقة التقدير كطريقة مستقلة للنموذج لتحقيق أفضل تحديد لنقطة الاتصال بناء على جودة منحنيات القوة المقاسة ، والتي يجب تحديدها تجريبيا أثناء تحسين تحليل البيانات. قم بتركيب منحنى المسافة البادئة للقوة باستخدام نموذج كلاسيكي مثل L Two الكلاسيكي لملاءمة النموذج.اضبط ملاءمة النموذج على منحنى السحب. اضبط نسبة بواسون على 0.45 على النحو الموصى به للأنسجة الرخوة مثل الكبد. اضبط ملاءمة المنحنى باستخدام درجة خط الأساس ثلاثة ودرجة التلامس الواحدة واحدة.قم بتغيير درجة الملاءمة متعددة الحدود بناء على مقياس انحرافات المنحنيات عن النموذج. حدد النموذج المستخدم لتناسب منحنيات السحب كنموذج Sneddon. املأ نصف قطر الطرف الكروي حتى ٢٫٩ ميكرومتر.قم بتحميل ثابت الربيع و invOLS من ملفات البيانات عن طريق تمكين القراءة ، ثم انقر فوق إنهاء. بعد تحليل البيانات ، انتقل من خلال منحنيات القوة. استبعد منحنيات القوة حيث اقترب الكابولي من سطح قسم الكبد بشكل غير صحيح.هذه المنحنيات لها ضوضاء عالية وأشكال شاذة. بعد ذلك ، يمكن نسخ البيانات أو تصديرها. في هذه الدراسة ، تم فحص أقسام الكبد الثابتة بشكل معتدل التي تم الحصول عليها من الفئران الضابطة والفئران المصابة بالتليف الخفيف والمتقدم الناجم عن حقن رابع كلوريد الكربون باستخدام AFM.تم تحليل المناطق القريبة من الأوردة المركزية المقابلة للمناطق التي تتشكل فيها ألياف الكولاجين في فئران رابع كلوريد الكربون عادة في الكبد الضابط. كان توزيع وحدات يونغ قابلا للتكرار عبر مناطق مختلفة في مناطق التحكم في الكبد والمناطق الغنية بالكولاجين داخل قسم كبد واحد. في الفئران المعالجة برابع كلوريد الكربون ، أظهرت خرائط الصلابة المقابلة للمناطق المحيطة بالمركز لرواسب الكولاجين قيما أعلى بكثير من وحدات يونغ مقارنة بالمناطق المكافئة في الفئران الضابطة.علاوة على ذلك ، كانت هناك زيادة كبيرة في قيم وحدات يونغ مع علاج أطول. كما تم تقييم تأثير التخزين المطول لأقسام الكبد على الخواص الميكانيكية لألياف الكولاجين. أظهرت قياسات AFM قيما أقل بكثير من وحدات يونغ في المناطق الغنية بالكولاجين للأقسام المخزنة لمدة ثلاثة أشهر ، مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها في غضون أسبوعين.يحدد وقت تثبيت قسم الكبد بشكل كبير الخواص الميكانيكية لقسم الكبد. نوصي بالفواصل الزمنية المنصوص عليها في البروتوكول يجب اتباعها بدقة. بعد بعض التحسينات في البروتوكول ، يمكن استخدام الطريقة المحددة لأي أنسجة رخوة تظهر ترسبا كبيرا للكولاجين ، والذي يمكن اكتشافه عن طريق الفحص المجهري المستقطب.توفر التقنية المعطاة للباحثين بروتوكولا موحدا ومريحا لدراسة آلية الكبد عبر الصحة والمرض.

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

متصور الكهربائي زنزانة مع مضان المجهري

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

يعيش استجابة الخلية لتحفيز الميكانيكية المتكاملة التي درستها فرقة الميكروسكوب الضوئي والذرية

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

الكمي في الجسم الحي من التفاعلات بروتين G مستقبلات اقترن به الطيفي ثنائي الفوتون الميكروسكوب

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

الجزئي الميكانيكية توصيف أنسجة الرئة باستخدام القوة الذرية الميكروسكوب

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

تحديد الأهداف من microRNAs الإنسان مع نظام الفحص LightSwitch Luciferase به مراسل 3&#39;UTR - a يبني وmicroRNA مقلد في خلايا منتسب

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

إعداد عينة للفحص المجهري للقوة الذرية Virion واحد والتصوير الفلوري فائقة الدقة

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

في الجسم الحي تتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تميزت خمسة البروتينات الفلورية باستخدام الميكروسكوب متحد البؤر وMultiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

قياس صلابة من<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; ماوس Aortas باستخدام مجهر القوة الذرية

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

الكشف عن تنشيط يجند G-إلى جانب البروتين مستقبلات التطبع التي كتبها متحد البؤر المجهري

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...