Name: measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:00:00
Duration: 10 min 10 s
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这项工作得到了捷克共和国资助机构（18-02699S），捷克科学院机构研究项目（RVO 68378050）和MEYS CR项目NICR EXCELES（LX22NPO05102）的支持。CIISB，Instruct-CZ Centre of Instruct-ERIC EU consortium，由MEYS CR基础设施项目LM2018127和欧洲区域发展基金项目“UP CIISB”资助（No.CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974）为CF纳米生物技术CEITEC MU的测量提供了资金支持。我们还感谢由MEYS（LM2018129，CZ.02.1.01 / 0.0 / 0.0 / 18_046 / 0016045）和RVO：68378050-KAV-NPUI支持的光学显微镜核心设施，捷克共和国布拉格IMG CAS，感谢他们对本文提供的显微镜成像的支持。

作者没有利益冲突需要披露。

所提出的协议为正常和纤维化小鼠肝组织的AFM测量提供了一种逐步可重复的方法。耦合偏振显微镜提供高空间精度，并且由于其双折射而能够可视化胶原纤维。此外，还提供了对所获得的力曲线的分析的详细描述。AFM硬度测量可以在细胞水平上进行，这允许监测由于发展中的纤维化疾病而导致的肝组织机械性能的局部变化。肝纤维化不是影响整个器官的均质过程。相反，富含胶原蛋白的纤维化隔膜区域散布着胶原蛋白沉积量低或没有胶原蛋白沉积的区域。因此，硬度变化特定于局部微环境，并且仅影响与损伤损伤区域接触的局部细胞。这种刚度异质性的微观尺度在AFM Young模量图的细节中也很明显，其中高刚度点与几乎正常刚度的区域接壤。这种变化表明，即使是胶原蛋白疤痕组织区域也不是机械均匀的，需要在细胞水平上表征AFM测量（图4）。
所提出的协议允许通过AFM独立于肝脏收集测量肝脏硬度，因为嵌入OCT的整个肝叶可以在-80°C下长时间储存。 然而，一旦组织被切片，我们建议在~2周内测量样品，因为我们观察到储存更长时间的组织切片逐渐软化（图5）。
配备偏振显微镜的AFM可以精确定位肝小叶结构内感兴趣的区域。但是，它也有一些限制，在解释结果时需要考虑。此处获得的刚度值是在室温下测量的。我们假设温度对软组织的机械性能的影响很小;然而，这可能是肝组织机械性能的 体内 报告值与本研究中的值之间存在差异的原因之一。
此外，该协议允许对肝组织进行长达3小时的AFM分析，这需要对组织进行轻度固定。组织切片的轻度固定以及冻融循环很可能会影响杨氏模量的绝对值。因此，报告的杨氏模量值可能与 体内 值不同。需要进一步的研究来优化测量肝切片杨氏模量绝对值的方案，这可以通过不同的肝组织固定方法来实现64。
尽管如此，我们观察到用CCl 4 治疗3周的小鼠肝脏中富含胶原蛋白的区域的硬度增加，而不是6周。这些变化对应于长期损伤期间的纤维化进展（图4），并表明可以使用所提出的方案探测不同治疗之间的相对差异。这与Calò等人的观察结果一致，他们表明，轻度固定的肝脏切片在富含胶原蛋白和缺乏胶原蛋白的区域之间的硬度值上显示出与新鲜组织相似的硬度值差异25。
我们使用SD-qp-BioT-TL-10悬臂（理论弹簧常数~0.09 N / m）进行了修改，该悬臂用直径为5.7μm的球形尖端进行了修改，以最大程度地减少测量过程中肝组织的机械破坏。5.7 μm的磁珠能够充分压痕样品，以探测其刚度，同时保持其完整性。经过多次优化后，可以使用直径较小的磁珠在刚度图中获得更高的分辨率，但可能导致进一步高估杨氏模量值（有关更多详细信息，请参阅Crichton等人65）。使用指定的悬臂珠集成，我们能够在从数十单位Pa到~100 kPa的宽范围内表征样品刚度。
Sneddon的模型用于从力曲线推导出杨氏模量，因为它允许使用胶体探针62分析深压痕。与赫兹的模型不同，斯内登的模型不受接触半径必须远小于球体半径的约束。它进一步假设样品厚度比压痕深度30，66大几倍。在本研究中，在富含胶原蛋白的区域，压痕为~2μm，磁珠尺寸为5.7μm，样品厚度为30μm;因此，斯内登的模型是合适的。考虑尖端和基材之间的粘附力的其它型号63 可用于不同类型的组织。
AtomicJ 中的分析实现了对样品有限厚度的校正，以最大限度地减少基底的贡献，同时推导出杨氏模量62，67。在分析获得的力曲线时，我们使用了0.45的单个泊松比，该比以前已被推荐用于软组织器官24。这种近似对杨氏模量的计算值没有显著影响，因为泊松比值从 0.4 到 0.5 的变化只会导致根据 Sneddon 方程计算的杨氏模量值减少 0.893 倍。鉴于CCl 4 处理不同持续时间之间杨氏模量的多倍差异，近似泊松比产生的误差只是微不足道的。
我们使用退缩曲线来计算刚度值，因为我们感兴趣的是组织对悬臂提供的载荷的弹性响应，而不是对压痕68的塑性响应。由于软组织的粘弹性响应，拟合撤回曲线可能会高估杨氏模量，应牢记这一点。此外，我们观察到，使用接近曲线进行数据分析时，纤维化区域和控制区域之间的刚度值趋势相似，尽管绝对值相应较低（数据未显示）。
在优化方案时，我们确定了对测量可重复性至关重要的几个步骤。首先，重要的是要确保珠子在连接到悬臂时大约位于半透明尖端的中心。这可以防止压痕过程中可能的机械不平衡。其次，用PFA固定肝脏时，要严格遵循解冻和固定的时间限制。改变此步骤的时间可能会严重影响组织切片的机械性能。第三，悬臂必须通过连续监测和输入并发温度值进行反复校准，以避免由于温度波动而导致刚度值出现任何伪影。最后，从制备开始测量单个肝切片的时间不应超过3小时，因为覆盖的PBS可能会在更长的时间内蒸发。读者可以参考故障排除表（表3）来解决AFM测量过程中遇到的问题，Norman等人46也详细讨论了这个问题。
表 3：故障排除指南。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%203v2.xlsx" target="_blank">请按此下载此表格。</a>
所提出的方案允许对肝组织进行可重复的AFM探测。它有可能在微观水平上揭示有关纤维化肝病发展和最终消退的信息，并有助于开发针对慢性肝病进展期间形成的纤维化疤痕区域的疗法。

肝脏是维持生物体内平衡的重要器官1，2。慢性肝病每年占全球~200万人死亡3。它们最常见的起源是病毒感染、自身免疫性疾病、代谢综合征或酒精滥用相关疾病，并伴有进行性肝纤维化。肝损伤引起炎症反应，导致沉积细胞外基质（ECM）的细胞在伤口愈合反应中激活。然而，在存在慢性损伤的情况下，过量的ECM会在肝脏内形成未解决的瘢痕组织，导致肝纤维化，肝硬化，肝癌的发展，并最终导致肝衰竭4。
肝细胞损伤立即导致肝硬度增加5，6。这直接影响肝细胞功能，激活肝星状细胞（HSC）和门脉成纤维细胞，并导致它们转分化为胶原沉积的肌成纤维细胞7，8。纤维ECM的沉积进一步增加了肝脏硬度，创造了肝脏硬化和基质产生细胞活化的自我放大反馈回路。
因此，肝硬度已成为肝病预后的重要参数。生物力学组织特性的变化可以在通过组织学分析诊断纤维化之前检测到。因此，在研究和临床应用中已经开发了各种肝硬度测量技术。在临床环境中，瞬时弹性成像（TE）9，10，11，12，13和磁共振弹性成像（MRE）14，15，16，17，18已被用于通过检查肝脏粗硬度来非侵入性诊断肝损伤的早期阶段19。
在TE中，温和振幅和低频（50Hz）的超声波通过肝脏传播，并测量其速度，然后用于计算组织弹性模量13。然而，由于超声波通过肝脏周围组织传输不当，该技术对腹水、肥胖或肋间隙下的患者没有用9.
MRE基于磁共振成像模式，使用20-200 Hz机械横波靶向肝脏。然后使用特定的磁共振成像序列来追踪组织内部的波并计算组织硬度16。TE和MRE技术报告的硬度值与使用组织学METAVIR评分20排名的人肝样本活检获得的肝纤维化程度密切相关（表1）。TE和MRE也已用于测量啮齿动物模型中的肝脏硬度，用于研究目的21，22，23。然而，由于这两种方法都从组织对传播横波的响应中得出刚度值，因此获得的值可能无法反映组织的绝对机械刚度。
为了对啮齿动物肝脏进行直接机械表征，Barnes等人开发了一种模型-凝胶-组织测定（MGT测定），涉及将肝组织包埋在聚丙烯酰胺凝胶24中。该凝胶被脉冲均匀力压缩，从中可以计算杨氏模量。MGT测定与适用于正常肝和纤维化肝脏的压痕测定具有良好的相关性24 （表1）。
表1：体积水平的肝脏硬度值。 TE 和 MRE 与使用压痕和 MGT 测定对不同来源的肝脏进行肝脏弹性模量的直接离体机械测量进行比较。E 和 G 之间的关系由 E = 2G （1 + v） 给出，其中 v 是样品的泊松比;F0 到 F4 代表 METAVIR 评分系统中的纤维化评分，F0 表示低纤维化或无纤维化和 F4 肝硬化。缩写：TE = 瞬态弹性成像;MRE = 磁共振弹性成像;MGT = 模型凝胶组织;E = 弹性（杨氏）模量;G = 剪切模量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%201v2.xlsx" target="_blank">请按此下载此表格。</a>
一般肝硬度测量的主要缺点之一是它们不能提供肝脏硬度异质性的细胞级分辨率。在纤维化的进展过程中，与周围的实质25，26相比，富含胶原蛋白的区域显示出更高的刚性。这种刚度梯度局部影响常驻细胞，并在驱动HSC异质性中起重要作用27。因此，需要在微观水平上表征肝病发展过程中局部机械性能的变化，以更好地了解纤维化进展。
AFM允许以高分辨率和高力灵敏度测量组织的机械性能。AFM使用悬臂的尖端以低至几皮顿的力压进样品表面，根据所用尖端的几何形状和尺寸在微观或纳米水平上诱导变形。然后测量样品对施加应变的力响应，作为悬臂28中的偏转。从悬臂的接近和缩回中收集力-位移曲线，可以与适当的接触力学模型配合以评估样品的局部刚度29。
除了测量给定区域的刚度外，AFM还可以提供有关样品中特定特征的形貌信息，例如胶原纤维的结构30，31，32。多项研究描述了AFM的应用，以测量各种健康和患病组织的硬度，例如皮肤32，33，肺34，35，脑36，乳腺37，38，39，软骨40或心脏41，42，43，44来自患者和小鼠模型样本。此外，AFM还用于体外测定细胞和细胞外蛋白质支架的硬度45，46，47。
使用AFM测量生物样品的机械性能非常重要，因为它们的柔软性和易碎性。因此，各种研究标准化了不同的条件和设置，这些条件和设置产生了广泛波动的杨氏模量值（由Mckee等人审查48）。与其他软组织类似，不同等级肝纤维化的肝杨氏模量值也显示出广泛的变化（表2）。杨氏模量值的差异源于AFM操作模式，悬臂尖端，样品制备方法，样品厚度，压痕深度和力，测量过程中的肝组织环境以及分析方法的差异（表2）。
表2：细胞水平的肝硬度值。 使用AFM获得的肝脏硬度值描述了肝脏在细胞水平上的机械性能。缩写：AFM = 原子力显微镜;E = 弹性（杨氏）模量;PFA = 多聚甲醛;PBS = 磷酸盐缓冲盐水。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%202v2.xlsx" target="_blank">请按此下载此表格。</a>
本文描述了一种通过AFM可重复测量肝组织中富含胶原蛋白的纤维化区域的杨氏模量的方案，并通过使用偏振显微镜提供精确的定位。我们在小鼠模型中施用四氯化碳（CCl4）以小叶中心方式诱导胶原蛋白沉积49 ，可靠地模拟人肝纤维化的关键方面50。由于胶原纤维51的双折射，偏振显微镜图像能够可视化肝脏中的胶原蛋白，这允许悬臂尖端精确定位在肝小叶52内所需的感兴趣区域上。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >AFM head</td>
			<td >Bruker</td>
			<td >JPK nanowizard 3</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cameras</td>
			<td >Andor</td>
			<td >Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >The Imagingsource&#160;</td>
			<td >S/N:12310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cantilever</td>
			<td >SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors</td>
			<td>S/N:73750F05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryotome</td>
			<td >Leica&#160;</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epoxy resin glue (Long working time )</td>
			<td >Bison epoxy universal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Melamine beads; diameter, 5.7 um</td>
			<td >Microparticles, GmbH</td>
			<td>MF-R-5.7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td>&#160;IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrophobic&#160; slide marker</td>
			<td >SuperHT</td>
			<td>PAP PEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td >JPK nanowizard&#160; v6.1.151</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >AtomicJ v2.3.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost slides</td>
			<td >Thermoscientific</td>
			<td>ref no. J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >System</td>
			<td >Ubuntu 14.04.5 LTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibration isolation control unit</td>
			<td >Tablestable</td>
			<td>AVI-200-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy

基质僵硬被认为是肝纤维化进展的关键驱动因素之一。它对细胞行为的各个方面都有深远的影响，如细胞功能、分化和运动。然而，由于这些过程在整个器官中并不均匀，因此了解组织在细胞水平上的机械性能变化变得越来越重要。
为了能够监测肝叶内富含胶原蛋白的区域的变硬，本文提出了一种通过原子力显微镜（AFM）以高空间精度测量肝组织弹性模量的协议。AFM是一种灵敏的方法，有可能表征局部机械性能，计算为杨氏（也称为弹性）模量。AFM与偏振显微镜相结合，可用于根据组织中胶原纤维的双折射特异性定位纤维化发展区域。使用提出的方案，我们表征了纤维化小鼠肝脏富含胶原蛋白的区域的硬度以及对照小鼠肝脏中相应区域的硬度。
随着纤维化的发展，观察到胶原蛋白阳性区域的硬度显着增加。由于使用了轻度固定的肝组织，所提出的协议允许高度可重复的AFM测量方法，该方法可用于进一步了解疾病引发的局部组织机械性能变化及其对邻近细胞命运的影响。

如本协议所述，用AFM探测从对照小鼠和轻度或晚期纤维化小鼠（分别通过注射CCl 4 诱导3周或6周，分别为49）获得的轻度固定，30μm厚的肝脏切片。选择靠近中央静脉的胶原纤维进行刚度图的测量。在对照肝脏中分析靠近中央静脉的区域，对应于CCl 4处理动物中通常形成胶原纤维的区域（图4A）。杨氏模量的分布在单个肝切片内的不同对照肝脏和富含胶原蛋白的区域是可重复的（图4B：左小提琴图）。
在CCl 4处理的动物中，与对照小鼠的等效面积相比，对应于胶原蛋白沉积物中心周围区域的硬度图显示杨氏模量值显着更高（图4B：对照组的1.9 kPa vs. 2.6 kPa杨氏模量中位数值与3周CCl 4处理小鼠相比;p = 0.07;对照组的杨氏模量值中位数为1.9 kPa vs. 5.1 kPa 与6周CCl4-处理过的小鼠;p = 0.02）。此外，使用较长的CCl 4处理，杨氏模量值显着增加（图4B;3周与6周CCl4处理小鼠的杨氏模量值中位数为2.6 kPa与5.1 kPa;p = 0.04）。这表明随着纤维化的进展，胶原蛋白沉积物逐渐变硬，并且AFM测量反映了纤维化。
为了评估长时间储存OCT包埋的肝脏切片对胶原纤维机械性能的影响，我们测量了CCl 4处理小鼠切片中胶原纤维的硬度，切割后在载玻片上在-80°C下储存2周或3个月（图5）。AFM 测量显示，与在样品切片后 2 周内测量的切片相比，储存 3 个月的切片在富含胶原蛋白区域的杨氏模量值显着降低（图 5;4.7 kPa 与 3.6 kPa 杨氏模量中位数值相比，2 周与 3 个月存储;p < 0.001）。因此，重要的是在从OCT嵌入的肝叶制备切片后不久测量肝组织的机械性能。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig04.jpg"> 图 4：AFM 测量显示富含胶原蛋白的区域逐渐变硬，与延长的 CCl4 治疗相关。 （A）对照小鼠和用CCl 4处理3周或6周的小鼠的肝脏切片用于测量富含胶原蛋白的区域的机械性能。偏振显微镜图像（左）中显示的肝脏切片的框框区域是用于AFM测量（30μm x 100μm，10像素x 36像素）选择的富含胶原蛋白的扫描区域（或对照肝脏中的相应区域）。右侧显示了杨氏模量图，其色阶对应于这些框形区域，包括这些图中杨氏模量值的直方图;插图散点图显示每个条件的值 >10 kPa。肝脏的僵硬被可视化为直方图分布的逐渐右移和插图散点图中点的频率更高。比例尺 = 20 μm。 （B） 小提琴图显示了针对每种条件测量的三个区域的弹性模量分布（左），并汇总了所有三个地图的弹性模量值（右）。小提琴图显示中位数（红线）、第 25 个百分位数和第 75个百分位数（黑线）;点表示区域 1-3 中各个地图的平均值。所呈现的 p 值是使用对均值执行的学生 t 检验计算的。缩写：AFM = 原子力显微镜;CCl 4 = 四氯化碳。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig05.jpg"> 图5：延长肝脏切片的储存导致富含胶原蛋白的区域的硬度降低。 肝切片（由用CCl 4 处理2周的小鼠制备）在-80°C下储存2周或3个月用于测量杨氏模量。偏振显微镜图像（左），带有指示用于AFM测量的富含胶原蛋白的区域（30 μm x 100 μm，10像素x 36像素）的框。带有色标的相应杨氏模量图（右）。直方图显示从每个样本的 4-6 个区域收集的杨氏模量值;插图散点图显示每个条件的值 >10 kPa。比例尺 = 20 μm。缩写：AFM = 原子力显微镜;CCl 4 = 四氯化碳。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
补充图S1：用三聚氰胺树脂微珠修饰悬臂的方法。 （A）绘制的示意图说明了球形珠子与悬臂尖端的连接。有关逐步说明，请参阅第 2 节，第 1 部分，将 5.7 μm 磁珠连接到 AFM 悬臂尖端。（B） 从顶部（左）和侧视图（右）显示连接到悬臂尖端的球形 5.7 μm 磁珠的显微镜图像。比例尺 = 20 μm。缩写：AFM = 原子力显微镜;RT = 室温。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%201.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充图S2：AtomicJ中的数据分析。 （A） 在 AtomicJ 中打开刚度图要遵循的步骤顺序。在加工力曲线和贴图（x）上单击鼠标左键即可打开加工助手。可以通过单击添加 （y） 并选择所需的文件将文件加载到处理助手。单击下一步 （z） 继续下一步。（B） 曲线拟合参数、适当的接触力学模型和测量期间使用的 AFM 设置。步骤 1-11 是指协议步骤 3 第 5 节“数据分析”中详述的相应子点。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary_fig_2.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充图S3：AtomicJ中分析数据的概述。 分析数据的预览显示刚度图（左上窗口）、力曲线（右上窗口）和原始数据（下窗口）。缩写：AFM = 原子力显微镜。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%203.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>

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Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

我们提出了一种使用原子力显微镜测量正常和患病肝脏中富含胶原蛋白的区域的弹性模量的方案。同时使用偏振显微镜为定位肝脏切片中富含胶原蛋白的区域提供了高空间精度。

使用原子力显微镜结合偏振显微镜测量肝硬度

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

我们的协议提供了肝脏部分富含胶原蛋白和缺乏胶原蛋白的区域之间的区别。因此，它可以用来更详细地研究纤维化的过程。该技术的主要优点在于使用偏振显微镜来定位肝脏切片中富含胶原蛋白的区域。我们的方案可以为肝纤维化的发展提供深刻的见解，并且在某些优化后也可以用于其他软组织，例如肺。首先，从零下80摄氏度下取出冷冻的肝脏切片，并在室温下解冻两分钟。在 PBS 中用冰冷的 4% 多聚甲醛固定切片 10 分钟，在 4 摄氏度下，然后用 PBS 洗涤五次。最后一次洗涤后，用纸巾擦拭肝切片周围多余的PBS，并用疏水记号笔在肝切片周围标记约两乘四厘米的边界。用PBS覆盖样品，然后将样品加载到AFM载物台上，并用AFM头覆盖。在原子力显微镜或AFM软件中，转到设置选项卡并在自动保存时标记勾号以自动保存所有文件。然后，通过转到设置选项卡并单击保存设置来指定用于保存测量文件的文件名和目录。通过打开激光并单击接近键，使用 AFM 悬臂接近组织表面。接近完成后，通过单击缩回键一次缩回悬臂尖端，这会将悬臂缩回压电范围的顶端。如果需要，使用AFM头上的旋钮重新对齐探测器。关闭激光。提示现在是目标的焦点。接下来，通过单击附件选项卡并选择直接叠加光学校准，将显微镜的光学场与AFM测量图叠加。在随后的窗口中，单击下一步以拍摄悬臂扫描特定区域的一系列图像。再次单击下一步转到下一个窗口。在第一个图像中，手动单击悬臂尖端的中心以描绘软件中的尖端位置。描述尖端位置的圆可以通过指示其半径来操纵其大小以提高精度。单击校准以自动检测所有图像中的悬臂尖端位置。通过浏览图像确认尖端检测的准确性。单击“下一步”，然后单击“完成”以完成光学覆盖。接下来，使用偏振图像移动载物台以将富含胶原蛋白的区域放置在绿色框中，在数据查看器选项卡中可见。通过在网格选项卡下定义区域来选择富含胶原蛋白的区域，然后在指定的绿色框中长按鼠标左键在数据查看器选项卡上创建一个矩形。单击确认新扫描区域，将所选区域设置为测量区域。设置反馈循环的参数。将 I 增益设置为 50 赫兹，将 P 增益设置为 0.001。然后将设定点设置为一纳米牛顿。根据所研究材料的机械性能和悬臂刚度选择相对设定点值。指定刚好基线以正确拟合力曲线。然后根据样品的表面形貌在Z轴上选择悬臂运动的长度。将 Z 移动设置为恒定持续时间。将延长时间设置为 1 秒，拉伸和收回延迟为零。将采样率设置为 5， 000 赫兹。在 Z 闭环前面标记一个刻度，以在测量过程中自动调整样品和悬臂尖端之间的距离。然后通过取消选择接合按钮来脱离电动载物台控制。打开激光并用悬臂接近样品。单击开始扫描以收集力距离曲线。使用开源软件AtomicJ分析采集的数据。通过单击过程力曲线和映射图标，将力曲线加载到程序中。然后在处理助手中，通过单击添加按钮添加要分析的地图。加载地图后，单击下一步。在下一个窗口中指定处理设置。要使用一组拟合曲线参数自动估计样品和悬臂之间的接触点，请使用接触点的自动估计。通过经典的聚焦网格方法确定悬臂和样品之间的接触点。选择估计方法作为模型独立方法，根据实测力曲线的质量对接触点进行最佳确定，需要在数据分析优化时凭经验确定。使用经典模型拟合力压痕曲线，作为经典 L 二进行模型拟合。将模型拟合到提款曲线。将泊松比设置为 0.45，建议用于肝脏等软组织。使用基线度 3 和接触度 1 设置曲线的拟合。根据曲线与模型的偏差尺度更改多项式拟合度。选择用于拟合提款曲线的模型作为 Sneddon 模型。将球形尖端的半径填充到 2.9 微米。通过启用读入从数据文件加载弹簧常量和 invOLS，然后单击完成。数据分析后，通过力曲线。排除悬臂错误地接近肝切片表面的力曲线。这些曲线具有高噪声和异常形状。在此之后，可以复制或导出数据。在本研究中，用AFM探测从对照小鼠和注射四氯化碳诱导的轻度和晚期纤维化的小鼠获得的轻度固定肝切片。在对照肝脏中分析与四氯化碳小鼠中胶原纤维通常形成的区域相对应的中央静脉附近的区域。杨氏模量的分布在单个肝脏切片的对照肝脏和富含胶原蛋白的区域的不同区域是可重复的。在四氯化碳处理的小鼠中，与对照小鼠的等效区域相比，对应于胶原蛋白沉积物中心周围区域的硬度图显示杨氏模量值显着更高。此外，随着处理时间的延长，杨氏模量值显著增加。还评估了长期储存肝切片对胶原纤维机械性能的影响。AFM测量显示，与两周内获得的切片相比，储存三个月的切片富含胶原蛋白区域的杨氏模量值显着降低。肝切片的固定时间在很大程度上决定了肝脏切片的力学性能。我们建议必须严格遵守协议中规定的时间间隔。在方案中进行某些优化后，给定的方法可用于任何显示显着胶原沉积的软组织，这可以通过偏振显微镜检测到。给定的技术为研究人员提供了一个统一而方便的方案来研究肝脏在健康和疾病中的机制。

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Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

模仿人类小分子RNA的LightSwitch萤光素酶检测系统使用3&#39;UTR记者构造的microRNA识别目标在贴壁细胞

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

单病毒原子力显微镜和超分辨率荧光成像的样品制备

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

测量的刚度<em&gt;离体</em&gt;鼠标主动脉用原子力显微镜

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

配体激活的G蛋白偶联受体内在化的检测通过共聚焦显微镜

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...