Name: measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Den Tjekkiske Republiks tilskudsagentur (18-02699S), det institutionelle forskningsprojekt fra det tjekkiske videnskabsakademi (RVO 68378050) og MEYS CR-projektet NICR EXCELES (LX22NPO05102). CIISB, Instruct-CZ Centre of Instruct-ERIC EU-konsortium, finansieret af MEYS CR-infrastrukturprojekt LM2018127 og European Regional Development Fund-Project "UP CIISB" (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) støttede målingerne på CF Nanobiotechnology, CEITEC MU. Vi anerkender også Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Prag, Tjekkiet, støttet af MEYS (LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) og RVO: 68378050-KAV-NPUI, for deres støtte med mikroskopibilleddannelsen, der præsenteres heri.

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Den præsenterede protokol giver en trinvis reproducerbar metode til AFM-måling af normalt og fibrotisk muselevervæv. Koblet polarisationsmikroskopi giver høj rumlig præcision og muliggør visualisering af kollagenfibre på grund af deres birefringens. Endvidere gives en detaljeret beskrivelse af analysen af de opnåede kraftkurver. AFM stivhedsmåling kan udføres på celleniveau, hvilket gør det muligt at overvåge lokale ændringer i levervævets mekaniske egenskaber på grund af udvikling af fibrotisk sygdom. Leverfibrose er ikke en homogen proces, der påvirker hele organet. Tværtimod er områder med kollagenrig fibrotisk septa blandet med områder med lave eller ingen kollagenaflejringer. Stivhedsændringer er således specifikke for det lokale mikromiljø og påvirker kun celler lokalt i kontakt med områder, der er beskadiget af skade. Denne mikroskala af stivhed heterogenitet er også tydelig i detaljerne i AFM Youngs modulkort, hvor punkter med høj stivhed grænser op til områder med næsten normal stivhed. Denne variation viser, at selv kollagen arvævsområde ikke er mekanisk homogent og kræver, at AFM-måling karakteriseres på celleniveau (figur 4).
Den præsenterede protokol tillader målinger af leverstivhed ved AFM uafhængigt af leveropsamlingen, da hele leverloberne indlejret i OCT kan opbevares i en længere periode ved -80 ° C. Når vævet er sektioneret, anbefaler vi imidlertid at måle prøverne inden for ~ 2 uger, da vi har observeret en gradvis blødgøring af vævssektioner, der opbevares i længere perioder (figur 5).
AFM udstyret med polarisationsmikroskopi giver mulighed for præcist at lokalisere interesseområdet inden for leverlobulestrukturen. Det har dog også nogle begrænsninger, der skal overvejes, når resultaterne fortolkes. De stivhedsværdier, der blev opnået her, blev målt ved stuetemperatur. Vi antager, at temperaturens virkninger på blødt vævs mekaniske egenskaber vil være små; Dette kan dog være en af grundene til forskelle mellem de rapporterede in vivo-værdier af mekaniske egenskaber af levervæv og værdierne i denne undersøgelse.
Desuden tillader denne protokol AFM-analyse af levervæv i op til 3 timer, hvilket kræver mild fiksering af vævet. Den milde fiksering af vævssektioner såvel som fryse-optøningscyklussen vil sandsynligvis påvirke de absolutte værdier af Youngs modul. Således kan de rapporterede værdier af Youngs moduli afvige fra in vivo-værdier . Yderligere undersøgelser er nødvendige for at optimere protokollen til måling af absolutte værdier af Youngs modul fra leverafsnit, hvilket kan opnås ved en anden metode til fiksering af levervæv64.
Ikke desto mindre observerede vi stigende stivhed af kollagenrige områder i leveren hos mus behandlet medCCl 4 i 3 uger sammenlignet med 6 uger. Sådanne ændringer svarer til fibroseprogression under langvarig skade (figur 4) og viser, at relative forskelle kan undersøges mellem forskellige behandlinger ved hjælp af den præsenterede protokol. Dette er i overensstemmelse med observationerne fra Calò et al., der viste, at mildt faste leverafsnit viser lignende forskelle i stivhedsværdier mellem kollagenrige og kollagen-manglende områder som i frisk væv25.
Vi brugte SD-qp-BioT-TL-10 cantilever (teoretisk fjederkonstant ~ 0,09 N / m) modificeret med en sfærisk spids på 5,7 μm diameter for at minimere mekanisk forstyrrelse af levervævet under målinger. En perle på 5,7 μm gjorde det muligt at foretage tilstrækkelig indrykning af prøven til at undersøge dens stivhed og samtidig bevare dens integritet. En perle med en mindre diameter kan efter flere optimeringer bruges til at opnå højere opløsning i stivhedskortene, men kan føre til yderligere overvurdering af Youngs modulværdier (for flere detaljer, se Crichton et al.65). Ved hjælp af det specificerede cantilever-perle ensemble var vi i stand til at karakterisere prøvestivhed i et bredt område, fra snesevis af enheder af Pa til ~ 100 kPa.
Sneddons model blev brugt til at udlede Youngs modul fra kraftkurver, da den tillader analyse af dybe fordybninger med kolloide sonder62. Sneddons model lider i modsætning til Hertz's model ikke af den begrænsning, at kontaktradius skal være meget mindre end kugleradius. Det antages endvidere, at prøvetykkelsen er flere gange større end indrykningsdybden 30,66. I denne undersøgelse var fordybningen ~ 2 μm med en perlestørrelse på 5,7 μm og en prøvetykkelse på 30 μm i kollagenrige områder; således var Sneddons model passende. Andre modeller63 i betragtning af vedhæftningskraften mellem spids og substrat kan bruges til forskellige typer væv.
Analyse i AtomicJ implementerer korrektioner for prøvernes endelige tykkelse for at minimere bidraget fra et substrat, mens Youngs modul62,67 udledes. I analysen af de opnåede kraftkurver brugte vi et enkelt Poissons forhold på 0,45, som tidligere er blevet anbefalet til bløddelsorganer24. Denne tilnærmelse har ingen signifikant effekt på beregnede værdier af Youngs modul, da ændringen i værdien af Poissons forhold fra 0,4 til 0,5 kun resulterer i et fald på 0,893x i Youngs modulværdier beregnet i henhold til Sneddons ligning. I betragtning af de multifoldige forskelle i Youngs modul mellem de forskellige varigheder afCCl 4-behandlinger er de fejl, der produceres ved at tilnærme Poissons forhold, kun marginale.
Vi brugte tilbagetrækningskurve til at beregne stivhedsværdier, da vi var interesserede i vævets elastiske respons på belastningen fra cantileveren snarere end i plastresponsen på indrykning68. På grund af det bløde vævs viskoelastiske respons kan passende tilbagetrækningskurver overvurdere Youngs modul, hvilket man bør huske på. Desuden har vi observeret, at dataanalyse med tilgangskurve giver lignende tendenser i stivhedsværdier mellem fibrotiske og kontrolområder, selvom de absolutte værdier er tilsvarende lavere (data ikke vist).
Mens vi optimerede protokollen, identificerede vi flere trin, der var kritiske for målingernes reproducerbarhed. For det første er det vigtigt at sikre, at perlen er omtrent i midten af den gennemskinnelige spids, mens den fastgøres til cantileveren. Dette forhindrer mulig mekanisk ubalance under indrykning. For det andet er det under leverfiksering med PFA nødvendigt nøje at følge tidsfristerne for optøning og fiksering. Ændring af tidspunktet for dette trin kan alvorligt påvirke de mekaniske egenskaber ved vævssektioner. For det tredje skal udkragningen kalibreres gentagne gange med kontinuerlig overvågning og input af samtidige temperaturværdier for at undgå, at artefakter forekommer i stivhedsværdier på grund af temperaturudsving. Endelig bør et enkelt leversnit ikke måles i mere end 3 timer fra præparatet, da overlejret PBS kan fordampe over længere perioder. Læsere kan henvise til fejlfindingstabellen (tabel 3) til løsning af problemer, der opstår under AFM-målingen, som også diskuteres udførligt i Norman et al.46.
Tabel 3: Fejlfindingsvejledning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%203v2.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Den præsenterede protokol giver mulighed for reproducerbar AFM-sondering af levervæv. Det har potentialet til at afsløre information om udvikling og eventuel regression af fibrotisk leversygdom på mikroskopisk niveau og kan bidrage til udviklingen af terapier rettet mod fibrotiske arregioner dannet under progressionen af kronisk leversygdom.

Leveren er et vigtigt organ til opretholdelse af homeostase i organismer 1,2. Kroniske leversygdomme tegner sig for ~ 2 millioner dødsfald på verdensplan årligt3. De stammer oftest som virusinfektioner, autoimmune lidelser, metaboliske syndromer eller alkoholmisbrugsrelaterede sygdomme og ledsages af progressiv leverfibrose. Leverskade fremkalder et inflammatorisk respons, hvilket fører til aktivering af celler, der deponerer ekstracellulær matrix (ECM) i et sårhelende respons. I nærvær af en kronisk fornærmelse danner overskydende ECM imidlertid uløst arvæv i leveren, hvilket fører til udvikling af leverfibrose, cirrose, leverkarcinom og i sidste ende til leversvigt4.
Hepatocytskade resulterer straks i øget leverstivhed 5,6. Dette påvirker direkte hepatocytfunktionen, aktiverer leverstellatceller (HSC'er) og portalfibroblaster og resulterer i deres transdifferentiering til kollagenaflejrende myofibroblaster 7,8. Aflejringen af fibrøst ECM øger leverstivheden yderligere, hvilket skaber en selvforstærkende feedback-loop af leverstivning og matrixproducerende celleaktivering.
Leverstivhed er således blevet en vigtig parameter i leversygdomsprognosen. Ændringen i biomekaniske vævsegenskaber kan påvises tidligere end fibrose kan diagnosticeres ved histologisk analyse. Derfor er der udviklet forskellige teknikker til måling af leverstivhed i både forskning og kliniske applikationer. I kliniske omgivelser er forbigående elastografi (TE) 9,10,11,12,13 og magnetisk resonanselastikografi (MRE)14,15,16,17,18 blevet anvendt til ikke-invasivt at diagnosticere tidlige stadier af leverskade ved at undersøge grov leverstivhed 19.
I TE formeres ultralydbølger med mild amplitude og lav frekvens (50 Hz) gennem leveren, og deres hastighed måles, som derefter bruges til at beregne vævselastisk modul13. Denne teknik er imidlertid ikke nyttig for patienter med ascites, fedme eller lavere interkostale rum på grund af ukorrekt transmission af ultralydbølgerne gennem vævene omkring leveren9.
MRE er baseret på magnetisk resonansbilleddannelsesmodalitet og bruger 20-200 Hz mekaniske forskydningsbølger til at målrette leveren. En specifik magnetisk resonansbilleddannelsessekvens bruges derefter til at spore bølgerne inde i vævet og til at beregne vævsstivheden16. Stivhedsværdier rapporteret med både TE- og MRE-teknikker korrelerer godt med graden af leverfibrose opnået fra biopsier af humane leverprøver rangeret ved hjælp af histologiske METAVIR-score20 (tabel 1). TE og MRE er også blevet tilpasset til måling af leverstivhed i gnavermodeller til forskningsformål21,22,23. Men da begge metoder udleder stivhedsværdierne fra vævets respons på de formerende forskydningsbølger, afspejler de opnåede værdier muligvis ikke vævets absolutte mekaniske stivhed.
Til en direkte mekanisk karakterisering af gnaverlever udviklede Barnes et al. et model-gel-vævsassay (MGT-assay), der involverede indlejring af levervæv i polyacrylamidgel 24. Denne gel komprimeres af en pulserende ensartet kraft, hvorfra Youngs modul kan beregnes. MGT-analysen viser en god sammenhæng med et indrykningsassay tilpasset både normale og fibrotiske lever24 (tabel 1).
Tabel 1: Leverstivhedsværdier på bulkniveau. TE og MRE sammenlignet med direkte ex vivo mekaniske målinger af leverelastikmoduler ved hjælp af indrykning og MGT-assays for lever fra forskellige kilder. Forholdet mellem E og G er givet ved E = 2G (1 + v), hvor v er Poissons forhold mellem prøven; F0 til F4 repræsenterer fibrosescoren i METAVIR-scoringssystemet, hvor F0 angiver lav eller ingen fibrose og F4-cirrhotiske lever. Forkortelser: TE = forbigående elastografi; MRE = magnetisk resonanselastikografi; MGT = model-gel-væv; E = elastisk (Youngs) modul; G = forskydningsmodul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%201v2.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
En af de største ulemper ved generiske leverstivhedsmålinger er, at de ikke giver celleopløsning af stivhed heterogenitet i leveren. Under progressionen af fibrose viser kollagenrige områder højere stivhed sammenlignet med det omgivende parenchyma25,26. Denne stivhedsgradient påvirker lokalt de residente celler og spiller en vigtig rolle i at drive HSC heterogenitet27. Således skal ændringer i lokale mekaniske egenskaber under udvikling af leversygdom karakteriseres på mikroskopisk niveau for bedre at forstå fibroseprogression.
AFM gør det muligt at måle vævets mekaniske egenskaber med høj opløsning og høj kraftfølsomhed. AFM bruger spidsen af en cantilever til at indrykke overfladen af en prøve med kræfter så lave som flere piconewtons, hvilket inducerer en deformation på et mikroskopisk eller nanoskopisk niveau baseret på geometrien og størrelsen af den anvendte spids. Prøvens kraftrespons på den påførte stamme måles derefter som afbøjningen i udkragningen28. Kraftforskydningskurve indsamles fra udkragnings- og tilbagetrækningsmetoden af udkragningen, som kan udstyres med passende kontaktmekanikmodeller til evaluering af prøvens lokale stivhed29.
Ud over at måle stivheden af et givet område kan AFM også give topografiske oplysninger om specifikke træk i prøven, såsom strukturen af kollagenfibre30,31,32. Flere undersøgelser har beskrevet anvendelsen af AFM til at måle stivheden af forskellige sunde og syge væv, såsom hud 32,33, lunge 34,35, hjerne36, bryst37,38,39, brusk 40 eller hjerte41,42,43,44 fra både patient- og musemodelprøver. Desuden er AFM også blevet brugt in vitro til at bestemme stivheden af celler og ekstracellulære proteinstilladser45,46,47.
Målingen af de mekaniske egenskaber af biologiske prøver ved hjælp af AFM er ikke-triviel på grund af deres blødhed og skrøbelighed. Således har forskellige undersøgelser standardiseret forskellige forhold og indstillinger, som giver meget svingende værdier af Youngs moduli (gennemgået af Mckee et al.48). I lighed med andre bløde væv viser lever Youngs modulværdier ved forskellige kvaliteter af leverfibrose også omfattende variation (tabel 2). Forskellene i Youngs modulværdier stammer fra forskelle i AFM-driftsmåde, cantilever tip, prøveforberedelsesmetode, prøvetykkelse, indrykningsdybde og kræfter, levervævsmiljø under måling og analysemetode (tabel 2).
Tabel 2: Leverstivhedsværdier på celleniveau. Leverstivhedsværdier opnået ved hjælp af AFM beskriver leverens mekaniske egenskaber på celleniveau. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; E = elastisk (Youngs) modul; PFA = paraformaldehyd; PBS = fosfatbufferet saltvand. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%202v2.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Dette papir beskriver en protokol til reproducerbar måling af Youngs moduler af kollagenrige fibrotiske områder i levervæv af AFM med en præcis lokalisering tilvejebragt ved brug af polarisationsmikroskopi. Vi administrerede carbontetrachlorid (CCl 4) for at inducere kollagenaflejring på en centrilobulær måde49 i en musemodel, der pålideligt efterligner afgørende aspekter af human leverfibrose50. Polariserede mikroskopiske billeder muliggør visualisering af kollagen i leveren på grund af birefringensen af kollagenfibre51, hvilket muliggør nøjagtig positionering af cantileverspidsen over det ønskede interesseområde inden for leverlobulen52.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >AFM head</td>
			<td >Bruker</td>
			<td >JPK nanowizard 3</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cameras</td>
			<td >Andor</td>
			<td >Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >The Imagingsource&#160;</td>
			<td >S/N:12310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cantilever</td>
			<td >SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors</td>
			<td>S/N:73750F05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryotome</td>
			<td >Leica&#160;</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epoxy resin glue (Long working time )</td>
			<td >Bison epoxy universal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Melamine beads; diameter, 5.7 um</td>
			<td >Microparticles, GmbH</td>
			<td>MF-R-5.7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td>&#160;IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrophobic&#160; slide marker</td>
			<td >SuperHT</td>
			<td>PAP PEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td >JPK nanowizard&#160; v6.1.151</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >AtomicJ v2.3.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost slides</td>
			<td >Thermoscientific</td>
			<td>ref no. J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >System</td>
			<td >Ubuntu 14.04.5 LTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibration isolation control unit</td>
			<td >Tablestable</td>
			<td>AVI-200-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy

Matrix afstivning er blevet anerkendt som en af de vigtigste drivkræfter for progression af leverfibrose. Det har dybe virkninger på forskellige aspekter af celleadfærd såsom cellefunktion, differentiering og bevægelighed. Men da disse processer ikke er homogene i hele organet, er det blevet stadig vigtigere at forstå ændringer i vævets mekaniske egenskaber på cellulært niveau.
For at kunne overvåge afstivningen af kollagenrige områder i leverloberne præsenterer dette papir en protokol til måling af levervævselastiske moduler med høj rumlig præcision ved atomkraftmikroskopi (AFM). AFM er en følsom metode med potentiale til at karakterisere lokale mekaniske egenskaber, beregnet som Youngs (også kaldet elastiske) modul. AFM kombineret med polarisationsmikroskopi kan bruges til specifikt at lokalisere områderne med fibroseudvikling baseret på birefringensen af kollagenfibre i væv. Ved hjælp af den præsenterede protokol karakteriserede vi stivheden af kollagenrige områder fra fibrotiske muselever og tilsvarende områder i leveren hos kontrolmus.
En fremtrædende stigning i stivheden af kollagenpositive områder blev observeret med fibroseudvikling. Den præsenterede protokol giver mulighed for en meget reproducerbar metode til AFM-måling på grund af brugen af mildt fikseret levervæv, der kan bruges til at fremme forståelsen af sygdomsinitierede ændringer i lokale vævsmekaniske egenskaber og deres virkning på nabocellernes skæbne.

Mildt faste, 30 μm tykke leversektioner opnået fra kontrolmus og fra mus med mild eller fremskreden fibrose (induceret ved injektion afCCl 4 i henholdsvis 3 uger eller 6 uger49) blev undersøgt med AFM som beskrevet i denne protokol. Kollagenfibre tæt på centrale vener blev valgt til måling af stivhedskort. Områder tæt på de centrale vener, som svarer til de områder, hvor kollagenfibre i CCl4-behandlede dyr normalt dannes, blev analyseret i kontrollever (figur 4A). Fordelingen af Youngs moduli var reproducerbar på tværs af forskellige kontrollever og kollagenrige områder inden for en enkelt leversektion (figur 4B: venstre violinplot).
I CCl 4-behandlede dyr viste stivhedskort svarende til de pericentrale områder af kollagenaflejringer signifikant højere værdier af Youngs moduli sammenlignet med tilsvarende områder i kontrolmus (figur 4B: 1,9 kPa vs. 2,6 kPa median Youngs modulværdier for kontrol vs. 3 ugers CCl 4-behandlet mus; p = 0,07; 1,9 kPa vs. 5,1 kPa median Youngs modulværdier for kontrol vs. 6 uger CCl 4 -behandlet mus; p = 0,02). Desuden var der en signifikant stigning i værdierne af Youngs moduli med længere CCl 4-behandling (figur 4B; 2,6 kPa vs. 5,1 kPa median Youngs modulværdier for 3 uger vs. 6 ugers CCl4-behandlet mus; p = 0,04). Dette viser en gradvis afstivning af kollagenaflejringer med fibroseprogression, og at AFM-målinger afspejler fibrogenesen.
For at evaluere effekten af langvarig opbevaring af OCT-indlejrede leverafsnit på kollagenfibrenes mekaniske egenskaber målte vi stivheden af kollagenfibre i sektioner af CCl4-behandlede mus, som blev opbevaret ved -80 ° C i 2 uger eller 3 måneder på diaset efter skæring (figur 5). AFM-målinger viste signifikant lavere værdier af Youngs moduli i kollagenrige områder for sektioner opbevaret i 3 måneder sammenlignet med dem, der blev opnået fra sektioner målt inden for 2 uger efter prøvesektionering (figur 5; 4,7 kPa vs. 3,6 kPa median Youngs modulværdier i 2 uger vs. 3 måneders opbevaring; p < 0,001). Det er således vigtigt at måle levervævets mekaniske egenskaber kort efter, at sektionerne er fremstillet ud fra de OCT-indlejrede leverlober.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig04.jpg"> Figur 4: AFM-målinger afslører progressiv afstivning af kollagenrige områder, der korrelerer med langvarigCCl 4-behandling. (A) Leverafsnit fra kontrolmus og mus behandlet medCCl 4 i 3 uger eller 6 uger blev brugt til at måle de mekaniske egenskaber i kollagenrige områder. De boksede områder af leverafsnittene, der vises på de polariserede mikroskopibilleder (til venstre), er kollagenrige scanningsområder (eller tilsvarende områder i kontrolleveren) valgt til AFM-målinger (30 μm x 100 μm, 10 pixels x 36 pixels). Youngs modulkort med farveskalaer svarende til disse boksområder er vist til højre, inklusive histogrammer af Youngs modulværdier fra disse kort; indsatte spredningsdiagrammer viser værdier >10 kPa for hver betingelse. Afstivningen af leveren visualiseres som et gradvist højregående skift i histogrammefordelingen og en højere frekvens af punkter i det indsatte spredningsplot. Skalabjælke = 20 μm. (B) Violindiagrammer viser fordelingen af elastiske moduler fra tre områder målt for hver tilstand (venstre) og opsummerede elastiske moduliværdier fra alle tre kort (højre). Violinplots viser medianen (rød linje), 25. percentil og 75. percentil (sorte linjer); Prikker repræsenterer middelværdierne for individuelle kort fra område 1-3. De præsenterede p-værdier blev beregnet ved hjælp af en elevs t-test udført på midler. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; CCl 4 = tetrachlormethan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig05.jpg"> Figur 5: Udvidet opbevaring af leverafsnit fører til et fald i stivhed af kollagenrige områder. Leverafsnit (fremstillet af mus behandlet medCCl 4 i 2 uger) opbevaret ved -80 °C i 2 uger eller 3 måneder blev brugt til at måle Youngs modul. Polariserede mikroskopibilleder (til venstre) med kasser, der angiver de kollagenrige områder, der bruges til AFM-måling (30 μm x 100 μm, 10 pixels x 36 pixels). Tilsvarende Youngs modulkort med farveskalaer (til højre). Histogrammer viser Youngs modulværdier indsamlet fra 4-6 områder i hver prøve; indsatte punktgrafer viser værdier >10 kPa for hver betingelse. Skala bar = 20 μm. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; CCl 4 = tetrachlormethan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Supplerende figur S1: Metode til ændring af cantileveren med en melaminharpiks mikroperle. (A) Tegnet skematisk illustrerer fastgørelsen af en sfærisk perle til spidsen af udkraanden. For en trinvis beskrivelse, se afsnit 2, del 1, Fastgørelse af en 5,7 μm perle til AFM cantilever tip. (B) Mikroskopibillede af en sfærisk 5,7 μm perle fastgjort til udkragningsspidsen vist fra toppen (venstre) og siden (højre). Skala søjler = 20 μm. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; RT = stuetemperatur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%201.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende figur S2: Dataanalyse i AtomicJ. (A) Rækkefølgen af trin, der skal følges for at åbne stivhedskort i AtomicJ. Et enkelt venstreklik på proceskraftkurverne og kortene (x) åbner behandlingsassistenten. Filer kan indlæses i behandlingsassistenten ved at klikke på tilføj (y) og vælge de ønskede filer. Klik på næste (z) for at gå videre til næste trin. (B) Parametre til kurvetilpasning, passende kontaktmekanikmodel og AFM-indstillinger, der anvendes under måling. Trin 1-11 henviser til tilsvarende underpunkter, der er beskrevet i protokoltrin 3, afsnit 5, Dataanalyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary_fig_2.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende figur S3: Oversigt over analyserede data i AtomicJ. Forhåndsvisningen af analyserede data viser stivhedskort (øverste venstre vindue), kraftkurver (øverste højre vindue) og rådata (nederste vindue). Forkortelse: AFM = atomkraftmikroskopi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%203.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy at JoVE.com

Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

Vi præsenterer en protokol til måling af de elastiske moduler af kollagenrige områder i normal og syg lever ved hjælp af atomkraftmikroskopi. Samtidig brug af polarisationsmikroskopi giver høj rumlig præcision til lokalisering af kollagenrige områder i leverafsnittene.

Måling af leverstivhed ved hjælp af atomkraftmikroskopi kombineret med polarisationsmikroskopi

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

Vores protokol skelner mellem kollagenrige og kollagenmangelområder i leverafsnittene. Det kan således bruges til at studere fibrogeneseprocesserne i de større detaljer. Den største fordel ved teknikken ligger i brugen af polariserende mikroskopi til at lokalisere kollagenrige områder i leverafsnittene.Vores protokoller kan give stor indsigt i udviklingen af leverfibrose, og det kan også vedtages for andre bløde væv såsom lunger efter visse optimeringer. Til at begynde med skal du fjerne de frosne leverafsnit fra minus 80 grader Celsius og optø dem ved stuetemperatur i to minutter. Fix sektionerne med iskold 4% paraformaldehyd i PBS i 10 minutter ved fire grader Celsius, efterfulgt af vask fem gange med PBS.Efter den sidste vask tørres den overskydende PBS omkring leversektionen ved hjælp af væv, og marker en grænse på cirka to gange fire centimeter omkring leversektionen med en hydrofob markørpen. Dæk prøven med PBS, indlæs derefter prøven på AFM-stadiet, og dæk den med AFM-hovedet. I atomkraftmikroskopien eller AFM-softwaren skal du gå til opsætningsfanen og markere et kryds på autosave for automatisk at gemme alle filer.Angiv derefter filnavnet og mappen til lagring af målefilerne ved at gå til fanen Opsætning og klikke på at gemme indstillinger. Gå ind på vævsoverfladen med AFM-udkragningen ved at tænde laseren og klikke på indflyvningstasten. Når tilgangen er afsluttet, skal du trække cantileverspidsen tilbage ved at klikke på tilbagetrækningstasten en gang, hvilket trækker cantileveren tilbage til den øverste ende af piezo-området.Hvis det er nødvendigt, skal du justere detektoren ved hjælp af knapper på AFM-hovedet. Sluk for laseren. Tippet er nu i fokus for målet.Overlejr derefter mikroskopets optiske felt med AFM-målekort ved at klikke på fanen Tilbehør og vælge direkte overlejring optisk kalibrering. I det efterfølgende vindue skal du klikke på næste for at tage en række billeder af cantileveren, der scanner et bestemt område. Klik på næste igen for at gå til det næste vindue.På det første billede skal du klikke på midten af spidsen af cantilever manuelt for at skildre tippositionen i softwaren. Cirklen, der viser spidspositionen, kan manipuleres i størrelse ved at angive dens radius for at øge nøjagtigheden. Klik på kalibrer for automatisk at registrere udkragningsspidsen i alle billeder.Bekræft nøjagtigheden af tipdetektion ved at gennemgå billederne. Klik på næste, og afslut derefter for at afslutte den optiske overlejring. Flyt derefter scenen for at placere et kollagenrigt område inde i den grønne boks, der er synlig på fanen Datafremviser, ved hjælp af det polariserede billede.Vælg det kollagenrige område ved at definere området under gitterfanen og derefter oprette et rektangel på fanen Datafremviser ved hjælp af et langt tryk på venstre museknap inde i den angivne grønne boks. Klik på bekræft nyt scanningsområde for at indstille det valgte område som et måleområde. Indstil parametrene for feedback-sløjfen.Sæt jeg gevinst ved 50 hertz og P gevinst ved 0,001. Indstil derefter sætpunktet til en nano Newton. Vælg den relative sætpunktsværdi i henhold til de studerede materialers mekaniske egenskaber og udkragningsmaskinens stivhed.Angiv en retfærdig basislinje, så den passer korrekt til kraftkurverne. Vælg derefter længden af udkragningsbevægelsen i Z-aksen i henhold til prøvens overfladetopografi. Indstil Z-bevægelse til konstant varighed.Indstil forlængelsestiden til et sekund med udvidelses- og tilbagetrækningsforsinkelser som nul. Indstil prøvehastigheden til 5.000 hertz. Marker et kryds foran Z lukket kredsløb for automatisk at justere afstanden mellem prøven og udkragningsspidsen under målinger.Frakobl derefter den motoriserede scenekontrol ved at fravælge aktiveringsknappen. Tænd for laseren, og gå til prøven med udkragningen. Klik på start scanning for at indsamle kraftafstandskurver.Analyser de erhvervede data ved hjælp af open source-softwaren AtomicJ. Indlæs kraftkurverne i programmet ved at klikke på ikonet proceskraftkurver og kort. Tilføj derefter kortene i behandlingsassistenten, der skal analyseres, ved at klikke på knappen Tilføj.Når kortene er indlæst, skal du klikke på næste. Angiv behandlingsindstillingerne i det næste vindue. Hvis du automatisk vil estimere kontaktpunktet mellem prøven og udkragningen ved hjælp af et sæt passende kurveparametre, skal du bruge kontaktpunktets automatiske estimering.Bestem kontaktpunktet mellem udkragningen og prøven ved hjælp af den klassiske fokuserede gittermetode. Vælg estimeringsmetoden som den modeluafhængige metode for at give den bedste bestemmelse af kontaktpunktet baseret på kvaliteten af de målte kraftkurver, som skal bestemmes empirisk under optimeringen af dataanalysen. Tilpas kraftindrykningskurven ved hjælp af en klassisk model som klassisk L to til modelpasning.Indstil modellens pasform til tilbagetrækningskurven. Indstil Poissons forhold til 0,45 som anbefalet til blødt væv som leveren. Indstil kurvens pasform ved hjælp af en baselinegrad på tre og en kontaktgrad på en.Ændre graden af polynomisk pasform baseret på skalaen af afvigelser af kurverne fra modellen. Vælg den model, der bruges til at passe til tilbagetrækningskurverne som Sneddon-modellen. Udfyld radius af den sfæriske spids til 2,9 mikrometer.Indlæs fjederkonstanten og invOLS fra datafilerne ved at aktivere indlæsning, og klik derefter på udfør. Efter dataanalyse skal du gennemgå kraftkurverne. Udeluk kraftkurverne, hvor udkragningen nærmede sig overfladen af leversektionen forkert.Disse kurver har høj støj og afvigende former. Herefter kan dataene kopieres eller eksporteres. I denne undersøgelse blev mildt faste leverafsnit opnået fra kontrolmus og mus med mild og avanceret fibrose induceret ved injektion af carbontetrachlorid undersøgt med AFM.Områder tæt på de centrale vener svarende til de områder, hvor kollagenfibre i carbontetrachloridmus normalt dannes, blev analyseret i kontrollever. Fordelingen af Youngs moduli var reproducerbar på tværs af forskellige regioner i kontrollever og kollagenrige områder inden for en enkelt leversektion. I carbontetrachloridbehandlede mus viste stivhedskort svarende til de pericentrale områder af kollagenaflejringer signifikant højere værdier af Youngs moduli sammenlignet med tilsvarende områder i kontrolmus.Desuden var der en betydelig stigning i værdierne af Youngs moduli med længere behandling. Effekten af langvarig opbevaring af leverafsnit på kollagenfibrenes mekaniske egenskaber blev også vurderet. AFM-målinger viste signifikant lavere værdier af Youngs moduli i kollagenrige områder for sektioner opbevaret i tre måneder sammenlignet med dem, der blev opnået inden for to uger.Tidspunktet for fiksering af leversektion bestemmer i høj grad leversektionens mekaniske egenskaber. Vi anbefaler, at tidsintervaller, der er angivet i protokollen, skal følges nøje. Efter visse optimeringer i protokollen kan den givne metode anvendes til ethvert blødt væv, der viser signifikant kollagenaflejring, som kan påvises ved polariserende mikroskopi.Den givne teknik giver forskerne en samlet og bekvem protokol til at studere levermekanisme på tværs af sund og sygdom.

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Prøve forberedelse til single virion Atomic Force mikroskopi og superopløsning fluorescens Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klonale Sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og progenitorceller Præget af Fem fluorescerende proteiner ved hjælp af konfokal og multiphoton mikroskopi

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Måling stivheden af<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mus Aortas Brug Atomic force mikroskopi

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Påvisning af ligand-aktiverede G-protein-koblede receptorer Internalisering af konfokal mikroskopi

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...