Name: measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het Subsidiebureau van tsjechië (18-02699S), het institutioneel onderzoeksproject van de Tsjechische Academie van Wetenschappen (RVO 68378050) en meys CR-project NICR EXCELES (LX22NPO05102). CIISB, Instruct-CZ Centre of Instruct-ERIC EU consortium, gefinancierd door MEYS CR infrastructuurproject LM2018127 en European Regional Development Fund-Project "UP CIISB" (Nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) heeft de metingen bij de CF Nanobiotechnologie, CEITEC MU, financieel ondersteund. We erkennen ook de Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praag, Tsjechië, ondersteund door MEYS (LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) en RVO: 68378050-KAV-NPUI, voor hun ondersteuning bij de microscopiebeeldvorming die hierin wordt gepresenteerd.

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Het gepresenteerde protocol biedt een stapsgewijze reproduceerbare methode voor AFM-meting van normaal en fibrotisch leverweefsel van muizen. Gekoppelde polarisatiemicroscopie biedt een hoge ruimtelijke precisie en maakt visualisatie van collageenvezels mogelijk vanwege hun birefringence. Verder wordt een gedetailleerde beschrijving gegeven van de analyse van de verkregen krachtcurven. AFM-stijfheidsmeting kan op cellulair niveau worden uitgevoerd, waardoor lokale veranderingen in de mechanische eigenschappen van leverweefsel als gevolg van de ontwikkeling van fibrotische ziekten kunnen worden gecontroleerd. Leverfibrose is geen homogeen proces dat het hele orgaan beïnvloedt. Integendeel, gebieden van collageenrijke fibrotische septa worden afgewisseld met gebieden met lage of geen collageenafzettingen. Veranderingen in stijfheid zijn dus specifiek voor de lokale micro-omgeving en beïnvloeden alleen cellen lokaal in contact met gebieden die door letsel zijn beschadigd. Deze microschaal van stijfheid heterogeniteit is ook zichtbaar in de details van de moduluskaarten van AFM Young, waar punten van hoge stijfheid grenzen aan de gebieden met bijna normale stijfheid. Deze variatie laat zien dat zelfs het gebied van collageen littekenweefsel niet mechanisch homogeen is en vereist dat AFM-metingen op cellulair niveau worden gekarakteriseerd (figuur 4).
Het gepresenteerde protocol maakt het mogelijk om leverstijfheid door AFM onafhankelijk van de leververzameling te meten, omdat de hele leverkwabben ingebed in OCT gedurende een langere periode bij −80 °C kunnen worden bewaard. Zodra het weefsel echter is gesneden, raden we aan om de monsters binnen ~ 2 weken te meten, omdat we een geleidelijke verzachting van weefselsecties hebben waargenomen die gedurende langere tijd zijn opgeslagen (figuur 5).
De AFM uitgerust met polarisatiemicroscopie maakt het mogelijk om het interessegebied binnen de leverlobbenstructuur nauwkeurig te lokaliseren. Het heeft echter ook enkele beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden bij het interpreteren van de resultaten. De hier verkregen stijfheidswaarden werden gemeten bij kamertemperatuur. We gaan ervan uit dat de effecten van temperatuur op de mechanische eigenschappen van zacht weefsel klein zullen zijn; dit kan echter een van de redenen zijn voor verschillen tussen de gerapporteerde in vivo waarden van mechanische eigenschappen van leverweefsels en de waarden in deze studie.
Bovendien maakt dit protocol AFM-analyse van leverweefsel tot 3 uur mogelijk, wat een milde fixatie van het weefsel vereist. De milde fixatie van weefselsecties, evenals de vries-dooicyclus, zal hoogstwaarschijnlijk de absolute waarden van Young's modulus beïnvloeden. De gerapporteerde waarden van Young's moduli kunnen dus afwijken van in vivo waarden. Verdere studies zijn nodig om het protocol te optimaliseren voor het meten van absolute waarden van Young's modulus uit leversecties, wat kan worden bereikt door een andere methode voor fixatie van leverweefsel64.
Niettemin zagen we een toenemende stijfheid van collageenrijke gebieden in de levers van muizen die gedurende 3 weken met CCl4 werden behandeld in vergelijking met 6 weken. Dergelijke veranderingen komen overeen met fibroseprogressie tijdens langdurig letsel (figuur 4) en laten zien dat relatieve verschillen tussen verschillende behandelingen kunnen worden onderzocht met behulp van het gepresenteerde protocol. Dit is in overeenstemming met de observaties van Calò et al., die aantoonden dat mild gefixeerde leversecties vergelijkbare verschillen in stijfheidswaarden vertonen tussen collageenrijke en collageenarme gebieden als in vers weefsel25.
We gebruikten de SD-qp-BioT-TL-10 cantilever (theoretische veerconstante ~0,09 N/m) gemodificeerd met een bolvormige punt met een diameter van 5,7 μm om mechanische verstoring van het leverweefsel tijdens metingen te minimaliseren. Een kraal van 5,7 μm maakte voldoende inkeping van het monster mogelijk om de stijfheid te onderzoeken met behoud van de integriteit. Een kraal met een kleinere diameter kan na verschillende optimalisaties worden gebruikt voor het verkrijgen van een hogere resolutie in de stijfheidskaarten, maar kan leiden tot verdere overschatting van de moduluswaarden van de Young (voor meer details, zie Crichton et al.65). Met behulp van het gespecificeerde cantilever-kralenensemble konden we de monsterstijfheid karakteriseren in een breed bereik, van tientallen eenheden Pa tot ~ 100 kPa.
Het model van Sneddon werd gebruikt om Young's modulus af te leiden uit krachtcurves, omdat het analyse van diepe inkepingen met colloïdale sondesmogelijk maakt 62. Het model van Sneddon lijdt, in tegenstelling tot het model van Hertz, niet onder de beperking dat de contactradius veel kleiner moet zijn dan de bolstraal. Verder wordt ervan uitgegaan dat de dikte van het monster meerdere malen groter is dan de inkepingsdiepte30,66. In deze studie was de inkeping ~2 μm met een kraalgrootte van 5,7 μm en een monsterdikte van 30 μm in collageenrijke gebieden; het model van Sneddon was dus toepasselijk. Andere modellen63 gezien de hechtingskracht tussen punt en substraat kunnen worden gebruikt voor verschillende soorten weefsels.
Analyse in AtomicJ implementeert correcties voor de eindige dikte van de monsters om de bijdrage van een substraat te minimaliseren terwijl young's modulus62,67 wordt afgeleid. Bij de analyse van de verkregen krachtcurven gebruikten we een enkele Poisson-verhouding van 0,45, die eerder is aanbevolen voor wekedelenorganen24. Deze benadering heeft geen significant effect op de berekende waarden van Young's modulus, aangezien de verandering in de waarde van Poisson's ratio van 0,4 tot 0,5 slechts resulteert in een 0,893x afname van Young's moduluswaarden berekend volgens de Sneddon's vergelijking. Gezien de meervoudige verschillen in Young's modulus tussen de verschillende duur van CCl4-behandelingen, zijn de fouten die worden geproduceerd door het benaderen van de verhouding van Poisson slechts marginaal.
We gebruikten trekcurven om stijfheidswaarden te berekenen, omdat we geïnteresseerd waren in de elastische reactie van het weefsel op de belasting die door de cantilever wordt geleverd in plaats van in de plastic reactie op inkeping68. Vanwege de visco-elastische respons van het zachte weefsel kunnen passende terugtrekkingscurven de modulus van Young overschatten, waarmee rekening moet worden gehouden. Bovendien hebben we waargenomen dat data-analyse met naderingscurves vergelijkbare trends in stijfheidswaarden tussen fibrotische en controlegebieden oplevert, hoewel de absolute waarden dienovereenkomstig lager zijn (gegevens niet weergegeven).
Tijdens het optimaliseren van het protocol hebben we verschillende stappen geïdentificeerd die cruciaal zijn voor de reproduceerbaarheid van de metingen. Ten eerste is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de kraal zich ongeveer in het midden van de doorschijnende punt bevindt terwijl deze aan de uitkraging wordt bevestigd. Dit voorkomt mogelijke mechanische onbalans tijdens inkepingen. Ten tweede, tijdens leverfixatie met PFA, is het noodzakelijk om de tijdslimieten voor ontdooien en fixatie strikt te volgen. Het veranderen van de timing van deze stap kan de mechanische eigenschappen van weefselsecties ernstig beïnvloeden. Ten derde moet de cantilever herhaaldelijk worden gekalibreerd met continue bewaking en invoer van gelijktijdige temperatuurwaarden om te voorkomen dat artefacten optreden in stijfheidswaarden als gevolg van temperatuurschommelingen. Ten slotte mag een enkele leversectie niet langer dan 3 uur na bereiding worden gemeten, omdat overlayd PBS over langere perioden kan verdampen. Lezers kunnen de tabel voor probleemoplossing (tabel 3) raadplegen voor het oplossen van problemen die zich voordoen tijdens de AFM-meting, die ook uitgebreid wordt besproken in Norman et al.46.
Tabel 3: Handleiding voor probleemoplossing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%203v2.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Het gepresenteerde protocol maakt reproduceerbaar AFM-onderzoek van leverweefsel mogelijk. Het heeft het potentieel om informatie te onthullen over de ontwikkeling en uiteindelijke regressie van fibrotische leverziekte op microscopisch niveau en kan bijdragen aan de ontwikkeling van therapieën gericht op fibrotische littekengebieden gevormd tijdens de progressie van chronische leverziekte.

De lever is een vitaal orgaan voor het handhaven van homeostase in organismen 1,2. Chronische leverziekten zijn goed voor ~ 2 miljoen sterfgevallen wereldwijd per jaar3. Ze ontstaan meestal als virale infecties, auto-immuunziekten, metabool syndroom of aan alcoholmisbruik gerelateerde ziekten en gaan gepaard met progressieve leverfibrose. Leverbeschadiging lokt een ontstekingsreactie uit, wat leidt tot de activering van cellen die extracellulaire matrix (ECM) afzetten in een wondgenezende reactie. In de aanwezigheid van een chronische belediging vormt overtollige ECM echter onopgelost littekenweefsel in de lever, wat leidt tot de ontwikkeling van leverfibrose, cirrose, levercarcinoom en uiteindelijk tot leverfalen4.
Hepatocytenletsel resulteert onmiddellijk in verhoogde leverstijfheid 5,6. Dit heeft direct invloed op de hepatocytenfunctie, activeert hepatische stellaatcellen (HSC's) en portale fibroblasten en resulteert in hun transdifferentiatie naar collageen-afzettende myofibroblasten 7,8. De afzetting van vezelige ECM verhoogt de leverstijfheid verder, waardoor een zelfversterkende feedbacklus van leververstijving en matrixproducerende celactivering ontstaat.
Leverstijfheid is dus een belangrijke parameter geworden in de prognose van leverziekten. De verandering in biomechanische weefseleigenschappen kan eerder worden gedetecteerd dan fibrose kan worden gediagnosticeerd door histologische analyse. Daarom zijn er verschillende technieken voor leverstijfheidsmeting ontwikkeld in zowel onderzoek als klinische toepassingen. In klinische settings zijn transiënte elastografie (TE)9,10,11,12,13 en magnetische resonantie-elastografie (MRE)14,15,16,17,18 gebruikt om niet-invasief vroege stadia van leverschade te diagnosticeren door grove leverstijfheid te onderzoeken 19.
In TE worden ultrasone golven van milde amplitude en lage frequentie (50 Hz) door de lever verspreid en wordt hun snelheid gemeten, die vervolgens wordt gebruikt om weefselelastische modulus13 te berekenen. Deze techniek is echter niet nuttig voor patiënten met ascites, obesitas of lagere intercostale ruimtes als gevolg van onjuiste overdracht van de ultrasone golven door de weefsels rond de lever9.
MRE is gebaseerd op magnetische resonantie beeldvormingsmodaliteit en maakt gebruik van 20-200 Hz mechanische schuifgolven om zich op de lever te richten. Een specifieke magnetische resonantie beeldvormingssequentie wordt vervolgens gebruikt om de golven in het weefsel te traceren en de weefselstijfheid te berekenen16. Stijfheidswaarden gerapporteerd met zowel TE- als MRE-technieken correleren goed met de mate van leverfibrose verkregen uit biopsieën van menselijke levermonsters gerangschikt met behulp van histologische METAVIR-scores20 (tabel 1). TE en MRE zijn ook aangepast voor het meten van leverstijfheid in knaagdiermodellen voor onderzoeksdoeleinden 21,22,23. Aangezien beide methoden echter de stijfheidswaarden afleiden uit de reactie van het weefsel op de zich voortplantende schuifgolven, weerspiegelen de verkregen waarden mogelijk niet de absolute mechanische stijfheid van het weefsel.
Voor een directe mechanische karakterisering van knaagdierlevers ontwikkelden Barnes et al. een model-gel-weefseltest (MGT-assay) waarbij leverweefsel wordt ingebed in polyacrylamidegel24. Deze gel wordt samengeperst door een gepulseerde uniforme kracht waaruit young's modulus kan worden berekend. De MGT-test toont een goede correlatie met een indentatietest die is aangepast voor zowel normale als fibrotische levers24 (tabel 1).
Tabel 1: Leverstijfheidswaarden op bulkniveau. TE en MRE vergeleken met directe ex vivo mechanische metingen van leverelastische moduli met behulp van inkepingen en MGT-assays voor levers uit verschillende bronnen. De relatie tussen E en G wordt gegeven door E = 2G (1 + v), waarbij v de Poisson-verhouding van het monster is; F0 tot F4 vertegenwoordigen de fibrosescore in het METAVIR-scoresysteem, waarbij F0 lage of geen fibrose en F4-cirrotische levers aanduidt. Afkortingen: TE = transiënte elastografie; MRE = magnetische resonantie-elastografie; MGT = model-gel-weefsel; E = elastische (Young's) modulus; G = afschuifmodulus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%201v2.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Een van de belangrijkste nadelen van generieke leverstijfheidsmetingen is dat ze geen resolutie op cellulair niveau van stijfheid heterogeniteit in de lever bieden. Tijdens de progressie van fibrose vertonen collageenrijke gebieden een hogere stijfheid in vergelijking met het omringende parenchym25,26. Deze stijfheidsgradiënt beïnvloedt lokaal de residente cellen en speelt een belangrijke rol bij het aansturen van HSC-heterogeniteit27. Veranderingen in lokale mechanische eigenschappen tijdens de ontwikkeling van leverziekten moeten dus op microscopisch niveau worden gekarakteriseerd om de progressie van fibrose beter te begrijpen.
AFM maakt het mogelijk om de mechanische eigenschappen van weefsel te meten met een hoge resolutie en hoge krachtgevoeligheid. AFM gebruikt de punt van een cantilever om het oppervlak van een monster in te laten inspringen met krachten zo laag als verschillende piconewtons, waardoor een vervorming op microscopisch of nanoscopisch niveau wordt geïnduceerd op basis van de geometrie en grootte van de gebruikte tip. De krachtrespons van het monster op de toegepaste stam wordt vervolgens gemeten als de doorbuiging in de cantilever28. Krachtverplaatsingscurven worden verzameld uit de nadering en terugtrekking van de cantilever, die kan worden uitgerust met geschikte contactmechanicamodellen om de lokale stijfheid van het monster te evalueren29.
Naast het meten van de stijfheid van een bepaald gebied, kan AFM ook topografische informatie geven over specifieke kenmerken in het monster, zoals de structuur van collageenvezels 30,31,32. Meerdere studies hebben de toepassing van AFM beschreven om de stijfheid van verschillende gezonde en zieke weefsels te meten, zoals huid 32,33, long34,35, hersenen36, borst 37,38,39, kraakbeen 40 of hart 41,42,43,44 uit zowel patiënt- als muismodelmonsters. Verder is AFM ook in vitro gebruikt om de stijfheid van cellen en extracellulaire eiwitsteigers te bepalen 45,46,47.
De meting van de mechanische eigenschappen van biologische monsters met AFM is niet triviaal vanwege hun zachtheid en kwetsbaarheid. Verschillende studies hebben dus verschillende omstandigheden en instellingen gestandaardiseerd, die sterk fluctuerende waarden van Young's moduli opleveren (beoordeeld door Mckee et al.48). Net als andere zachte weefsels vertonen de moduluswaarden van lever Young bij verschillende gradaties leverfibrose ook uitgebreide variatie (tabel 2). De verschillen in de moduluswaarden van Young komen voort uit verschillen in de werkingswijze van de AFM, de uitkragingstip, de monstervoorbereidingsmethode, de dikte van het monster, de inkepingsdiepte en -krachten, de omgeving van leverweefsel tijdens de meting en de analysemethode (tabel 2).
Tabel 2: Leverstijfheidswaarden op cellulair niveau. Leverstijfheidswaarden verkregen met behulp van AFM beschrijven de mechanische eigenschappen van de lever op cellulair niveau. Afkortingen: AFM = atomic force microscopy; E = elastische (Young's) modulus; PFA = paraformaldehyde; PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%202v2.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Dit artikel beschrijft een protocol voor de reproduceerbare meting van Young's moduli van collageenrijke fibrotische gebieden in leverweefsel door AFM met een nauwkeurige lokalisatie door het gebruik van polarisatiemicroscopie. We dienden koolstoftetrachloride (CCl4) toe om collageenafzetting op een centrilobulaire manier te induceren49 in een muismodel, waarbij op betrouwbare wijze cruciale aspecten van menselijke leverfibrose werden nagebootst50. Gepolariseerde microscopische beelden maken de visualisatie van collageen in de lever mogelijk vanwege de birefringence van collageenvezels51, die een nauwkeurige positionering van de cantilevertip over het gewenste interessegebied binnen de leverlob mogelijk maakt52.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >AFM head</td>
			<td >Bruker</td>
			<td >JPK nanowizard 3</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cameras</td>
			<td >Andor</td>
			<td >Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >The Imagingsource&#160;</td>
			<td >S/N:12310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cantilever</td>
			<td >SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors</td>
			<td>S/N:73750F05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryotome</td>
			<td >Leica&#160;</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epoxy resin glue (Long working time )</td>
			<td >Bison epoxy universal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Melamine beads; diameter, 5.7 um</td>
			<td >Microparticles, GmbH</td>
			<td>MF-R-5.7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td>&#160;IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrophobic&#160; slide marker</td>
			<td >SuperHT</td>
			<td>PAP PEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td >JPK nanowizard&#160; v6.1.151</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >AtomicJ v2.3.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost slides</td>
			<td >Thermoscientific</td>
			<td>ref no. J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >System</td>
			<td >Ubuntu 14.04.5 LTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibration isolation control unit</td>
			<td >Tablestable</td>
			<td>AVI-200-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy

Matrixversteviging is erkend als een van de belangrijkste oorzaken van de progressie van leverfibrose. Het heeft diepgaande effecten op verschillende aspecten van celgedrag, zoals celfunctie, differentiatie en beweeglijkheid. Omdat deze processen echter niet homogeen zijn in het hele orgaan, is het steeds belangrijker geworden om veranderingen in de mechanische eigenschappen van weefsels op cellulair niveau te begrijpen.
Om de verstijving van collageenrijke gebieden in de leverkwabben te kunnen volgen, presenteert dit artikel een protocol voor het meten van leverweefselelastische moduli met hoge ruimtelijke precisie door atoomkrachtmicroscopie (AFM). AFM is een gevoelige methode met het potentieel om lokale mechanische eigenschappen te karakteriseren, berekend als Young's (ook wel elastische) modulus genoemd. AFM in combinatie met polarisatiemicroscopie kan worden gebruikt om specifiek de gebieden van fibrose-ontwikkeling te lokaliseren op basis van de birefringence van collageenvezels in weefsels. Met behulp van het gepresenteerde protocol hebben we de stijfheid van collageenrijke gebieden van fibrotische muizenlevers en overeenkomstige gebieden in de levers van controlemuizen gekarakteriseerd.
Een prominente toename van de stijfheid van collageenpositieve gebieden werd waargenomen bij de ontwikkeling van fibrose. Het gepresenteerde protocol maakt een zeer reproduceerbare methode van AFM-meting mogelijk, vanwege het gebruik van mild vast leverweefsel, dat kan worden gebruikt om het begrip van door ziekte geïnitieerde veranderingen in lokale weefselmechanische eigenschappen en hun effect op het lot van naburige cellen te bevorderen.

Licht gefixeerde, 30 μm dikke leversecties verkregen van controlemuizen en muizen met milde of gevorderde fibrose (geïnduceerd door injectie van CCl4 gedurende respectievelijk 3 weken of 6 weken,49) werden onderzocht met AFM zoals beschreven in dit protocol. Collageenvezels dicht bij centrale aderen werden geselecteerd voor het meten van stijfheidskaarten. Gebieden dicht bij de centrale aderen, die overeenkomen met de gebieden waar collageenvezels in met CCl4 behandelde dieren zich gewoonlijk vormen, werden geanalyseerd in controlelevers (figuur 4A). De verdeling van Young's moduli was reproduceerbaar over verschillende controlelevers en collageenrijke gebieden binnen een enkele leversectie (figuur 4B: linker vioolplot).
Bij met CCl4 behandelde dieren vertoonden stijfheidskaarten die overeenkomen met de pericentrale gebieden van collageenafzettingen significant hogere waarden van Young's moduli in vergelijking met equivalente gebieden in controlemuizen (figuur 4B: 1,9 kPa vs. 2,6 kPa mediaan Young's moduluswaarden voor controle versus 3 weken CCl4-behandelde muis; p = 0,07; 1,9 kPa vs. 5,1 kPa mediaan Young's moduluswaarden voor controle versus 6 weken CCl4 -behandelde muis; p = 0,02). Bovendien was er een significante toename van de waarden van Young's moduli bij langere CCl4-behandeling (figuur 4B; 2,6 kPa vs. 5,1 kPa mediaan Young's moduluswaarden gedurende 3 weken vs. 6 weken CCl4-behandelde muis; p = 0,04). Dit toont een geleidelijke verstijving van collageenafzettingen met fibroseprogressie en dat AFM-metingen de fibrogenese weerspiegelen.
Om het effect van langdurige opslag van OCT-ingebedde leversecties op de mechanische eigenschappen van collageenvezels te evalueren, hebben we de stijfheid van collageenvezels gemeten in secties van met CCl4 behandelde muizen, die gedurende 2 weken of 3 maanden na het snijden bij −80 °C op de dia werden bewaard (figuur 5). AFM-metingen toonden significant lagere waarden van Young's moduli in collageenrijke gebieden voor secties die gedurende 3 maanden werden bewaard in vergelijking met die verkregen uit secties gemeten binnen 2 weken na monstersectie (figuur 5; 4,7 kPa vs. 3,6 kPa mediaan Young's moduluswaarden gedurende 2 weken versus 3 maanden opslag; p < 0,001). Het is dus belangrijk om de mechanische eigenschappen van het leverweefsel te meten kort nadat de secties zijn bereid uit de OCT-ingebedde leverlobben.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig04.jpg"> Figuur 4: AFM-metingen onthullen progressieve verstijving van collageenrijke gebieden die correleren met langdurige CCl4-behandeling . (A) Leversecties van controlemuizen en muizen behandeld met CCl4 gedurende 3 weken of 6 weken werden gebruikt om de mechanische eigenschappen van collageenrijke gebieden te meten. De ingepakte gebieden van leversecties die worden weergegeven in de gepolariseerde microscopiebeelden (links) zijn collageenrijke scangebieden (of overeenkomstige gebieden in de controlelever) die zijn geselecteerd voor AFM-metingen (30 μm x 100 μm, 10 pixels x 36 pixels). De moduluskaarten van de Young met kleurschalen die overeenkomen met deze boxed areas worden aan de rechterkant weergegeven, inclusief histogrammen van Young's moduluswaarden uit deze kaarten; inzetverstrooiingsdiagrammen tonen waarden > 10 kPa voor elke voorwaarde. De verstijving van de lever wordt gevisualiseerd als een geleidelijke verschuiving naar rechts in de histogramverdeling en een hogere frequentie van punten in de inzetverstrooiingsplot. Schaalbalk = 20 μm. (B) Vioolplots tonen de verdeling van elastische moduli uit drie gebieden gemeten voor elke toestand (links) en samengevatte elastische moduli-waarden uit alle drie de kaarten (rechts). Vioolplots tonen de mediaan (rode lijn),25e percentiel en 75e percentiel (zwarte lijnen); stippen vertegenwoordigen de gemiddelde waarden van individuele kaarten uit gebieden 1-3. De gepresenteerde p-waarden werden berekend met behulp van een Student's t-test uitgevoerd op middelen. Afkortingen: AFM = atomic force microscopy; CCl4 = tetrachloorkoolstof. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig05.jpg"> Figuur 5: Langdurige opslag van leversecties leidt tot een afname van de stijfheid van collageenrijke gebieden. Leversecties (bereid uit muizen behandeld met CCl4 gedurende 2 weken) bewaard bij −80 °C gedurende 2 weken of 3 maanden werden gebruikt om de modulus van Young te meten. Gepolariseerde microscopiebeelden (links) met vakken die de collageenrijke gebieden aangeven die worden gebruikt voor AFM-metingen (30 μm x 100 μm, 10 pixels x 36 pixels). Corresponderende Young's modulus kaarten met kleurenschalen (rechts). Histogrammen tonen young's moduluswaarden verzameld uit 4-6 gebieden in elk monster; inzetverstrooiingsgrafieken tonen waarden >10 kPa voor elke voorwaarde. Schaalbalk = 20 μm. Afkortingen: AFM = atomic force microscopy; CCl4 = tetrachloorkoolstof. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende figuur S1: Methode voor het wijzigen van de cantilever met een melaminehars microkraal. (A) Getekend schema illustreert de bevestiging van een bolvormige kraal aan de punt van de cantilever. Voor een stapsgewijze beschrijving, zie Sectie 2, Deel 1, Bevestiging van een kraal van 5,7 μm aan afm-sledepunt. (B) Microscopiebeeld van een bolvormige kraal van 5,7 μm die is bevestigd aan de vrijdragende punt die van boven (links) en lateraal zicht (rechts) wordt weergegeven. Schaalstaven = 20 μm. Afkortingen: AFM = atomic force microscopy; RT = kamertemperatuur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%201.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur S2: Gegevensanalyse in AtomicJ. (A) De volgorde van stappen die moeten worden gevolgd voor het openen van stijfheidskaarten in AtomicJ. Een enkele linkerklik op de proceskrachtcurven en -kaarten (x) opent de verwerkingsassistent. Bestanden kunnen naar de verwerkingsassistent worden geladen door op toevoegen (y) te klikken en de vereiste bestanden te selecteren. Klik op volgende (z) om door te gaan naar de volgende stap. (B) Parameters voor het passen van curven, het geschikte model van de contactmechanica en de AFM-instellingen die tijdens de meting worden gebruikt. Stap 1-11 verwijst naar overeenkomstige subpunten die worden beschreven in protocolstap 3, sectie 5, Gegevensanalyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary_fig_2.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur S3: Overzicht van geanalyseerde gegevens in AtomicJ. Het voorbeeld van geanalyseerde gegevens toont stijfheidskaarten (venster linksboven), krachtcurven (venster rechtsboven) en onbewerkte gegevens (onderste venster). Afkorting: AFM = atomic force microscopy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%203.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy at JoVE.com

Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

We presenteren een protocol om de elastische moduli van collageenrijke gebieden in normale en zieke lever te meten met behulp van atoomkrachtmicroscopie. Het gelijktijdige gebruik van polarisatiemicroscopie biedt een hoge ruimtelijke precisie voor het lokaliseren van collageenrijke gebieden in de leversecties.

Meting van leverstijfheid met behulp van atomic force microscopie in combinatie met polarisatiemicroscopie

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

Ons protocol biedt een onderscheid tussen collageenrijke en collageenarme gebieden in de leversecties. Het kan dus worden gebruikt om de processen van fibrogenese in de grotere details te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van de techniek ligt in het gebruik van polariserende microscopie om collageenrijke gebieden in de leversecties te lokaliseren.Onze protocollen kunnen veel inzicht geven in de ontwikkeling van leverfibrose, en het kan ook worden toegepast voor andere zachte weefsels zoals longen na bepaalde optimalisaties. Verwijder om te beginnen de bevroren leversecties van min 80 graden Celsius en ontdooi ze bij kamertemperatuur gedurende twee minuten. Bevestig de secties met ijskoude 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, gevolgd door vijf keer wassen met PBS.Veeg na de laatste wasbeurt de overtollige PBS rond het levergedeelte met behulp van weefsel en markeer een grens van ongeveer twee bij vier centimeter rond het levergedeelte met een hydrofobe markerpen. Bedek het monster met PBS, laad het monster vervolgens op het AFM-stadium en bedek het met de AFM-kop. Ga in de atomic force microscopie- of AFM-software naar het tabblad Instellingen en markeer een vinkje bij automatisch opslaan om alle bestanden automatisch op te slaan.Geef vervolgens de bestandsnaam en map op voor het opslaan van de meetbestanden door naar het tabblad Instellingen te gaan en op instellingen opslaan te klikken. Benader het weefseloppervlak met de AFM-cantilever door de laser in te schakelen en op de naderingstoets te klikken. Nadat de nadering is voltooid, trekt u de uitkragingstip in door eenmaal op de intreksleutel te klikken, waardoor de uitkraging naar de bovenkant van het piëzo-bereik wordt ingetrokken.Lijn indien nodig de detector opnieuw uit met behulp van knoppen op de AFM-kop. Schakel de laser uit. De tip staat nu centraal in de doelstelling.Leg vervolgens het optische veld van de microscoop met AFM-meetkaarten door op het tabblad accessoires te klikken en directe optische kalibratie van overlays te selecteren. Klik in het volgende venster op Volgende om een reeks afbeeldingen te maken van de cantilever die een specifiek gebied scant. Klik nogmaals op Volgende om naar het volgende venster te gaan.Klik in de eerste afbeelding handmatig op het midden van de punt van de cantilever om de tippositie in de software weer te geven. De cirkel die de tippositie weergeeft, kan in grootte worden gemanipuleerd door de straal aan te geven om de nauwkeurigheid te vergroten. Klik op kalibreren om de vrijdragende tippositie in alle afbeeldingen automatisch te detecteren.Bevestig de nauwkeurigheid van tipdetectie door de afbeeldingen door te nemen. Klik op Volgende en voltooi om de optische overlay te voltooien. Verplaats vervolgens het werkgebied om een collageenrijk gebied in het groene vak te plaatsen, zichtbaar op het tabblad Gegevensviewer, met behulp van de gepolariseerde afbeelding.Selecteer het collageenrijke gebied door het gebied onder het rastertabblad te definiëren en vervolgens een rechthoek te maken op het tabblad gegevensviewer met een lange druk op de linkermuisknop in het opgegeven groene vak. Klik op nieuw scangebied bevestigen om het geselecteerde gebied in te stellen als meetgebied. Stel de parameters van de feedbacklus in.Set I winst op 50 hertz en P winst op 0,001. Stel vervolgens het instelpunt in op één nano Newton. Selecteer de relatieve instelpuntwaarde op basis van de mechanische eigenschappen van de bestudeerde materialen en de stijfheid van de cantilever.Geef een basislijn op die goed past bij de krachtcurven. Selecteer vervolgens de lengte van de cantileverbeweging in de Z-as op basis van de oppervlaktetopografie van het monster. Stel Z-beweging in op constante duur.Stel de verlengingstijd in op één seconde met verlengings- en intrekkingsvertragingen als nul. Stel de samplefrequentie in op 5.000 hertz. Markeer een vinkje voor de gesloten Z-lus om de afstand tussen het monster en de vrijdragende punt tijdens de metingen automatisch aan te passen.Schakel vervolgens de gemotoriseerde faseregeling uit door de knop Inschakelen te deselecteren. Schakel de laser in en benader het monster met de cantilever. Klik op scan starten om de krachtafstandscurven te verzamelen.Analyseer de verkregen gegevens met behulp van de open source software AtomicJ. Laad de krachtcurves in het programma door op het pictogram proceskrachtcurven en kaarten te klikken. Voeg vervolgens in de verwerkingsassistent de kaarten toe die moeten worden geanalyseerd door op de knop Toevoegen te klikken.Nadat de kaarten zijn geladen, klikt u op volgende. Geef de verwerkingsinstellingen op in het volgende venster. Om het contactpunt tussen het monster en de cantilever automatisch te schatten met behulp van een reeks passende curveparameters, gebruikt u de automatische schatting van het contactpunt.Bepaal het contactpunt tussen de cantilever en het monster met behulp van de klassieke gerichte rastermethode. Selecteer de schattingsmethode als de modelonafhankelijke methode om de beste bepaling van het contactpunt te verkrijgen op basis van de kwaliteit van de gemeten krachtcurven, die empirisch moet worden bepaald tijdens de optimalisatie van gegevensanalyse. Pas de krachtinspringingscurve aan met behulp van een klassiek model als klassiek L twee voor modelfit.Stel de pasvorm van het model in op de opnamecurve. Stel de verhouding van Poisson in op 0,45 zoals aanbevolen voor zachte weefsels zoals de lever. Stel de pasvorm van de curve in met behulp van een basislijngraad van drie en een contactgraad van één.Wijzig de mate van polynomiale fit op basis van de schaal van afwijkingen van de curven van het model. Selecteer het model dat wordt gebruikt om in de onttrekkingscurven te passen als het Sneddon-model. Vul de straal van de bolvormige punt in tot 2,9 micrometer.Laad de veerconstante en invOLS uit de gegevensbestanden door inlezen in te schakelen en klik vervolgens op voltooien. Na data-analyse doorloop je de krachtcurves. Sluit de krachtcurven uit waarbij de cantilever het oppervlak van het levergedeelte verkeerd benaderde.Deze rondingen hebben een hoge ruis en afwijkende vormen. Hierna kunnen de gegevens worden gekopieerd of geëxporteerd. In deze studie werden mild gefixeerde leversecties verkregen van de controlemuizen en muizen met milde en gevorderde fibrose geïnduceerd door de injectie van koolstoftetrachloride onderzocht met AFM.Gebieden dicht bij de centrale aderen die overeenkomen met de gebieden waar collageenvezels in koolstoftetrachloridemuizen zich meestal vormen, werden geanalyseerd in controlelevers. De verdeling van Young's moduli was reproduceerbaar over verschillende regio's in controlelevers en collageenrijke gebieden binnen een enkele leversectie. Bij met koolstoftetrachloride behandelde muizen vertoonden stijfheidskaarten die overeenkomen met de pericentrale gebieden van collageenafzettingen significant hogere waarden van Young's moduli in vergelijking met equivalente gebieden in controlemuizen.Bovendien was er een significante toename van de waarden van Young's moduli bij een langere behandeling. Het effect van langdurige opslag van leversecties op de mechanische eigenschappen van collageenvezels werd ook beoordeeld. AFM-metingen toonden significant lagere waarden van Young's moduli in collageenrijke gebieden voor secties die drie maanden werden bewaard, vergeleken met die verkregen binnen twee weken.De tijd van fixatie van de leversectie bepaalt in grote mate de mechanische eigenschappen van de leversectie. We raden aan om de getimede intervallen die in het protocol worden vermeld, strikt te volgen. Na bepaalde optimalisaties in het protocol kan de gegeven methode worden gebruikt voor zachte weefsels met significante collageenafzetting, die detecteerbaar is door polariserende microscopie.De gegeven techniek biedt de onderzoekers een uniform en handig protocol om het mechanisme van lever te bestuderen voor gezond en ziek.

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse Imaging van mitose Na siRNA transfectie

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cel Electrofusion gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

Live-cel respons op mechanische stimulatie onderzocht door Integrated Optical en Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Kwantificering van G-eiwit gekoppelde receptor interacties met behulp van spectraal Opgelost Twee-foton microscopie

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Micro-mechanische karakterisatie van Lung weefsel met behulp van Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

Het identificeren van doelen van Human microRNA&#39;s met de LightSwitch Luciferase Assay System met behulp van 3&#39;UTR-reporter constructen en een microRNA Mimic in hechtende cellen

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Monstervoorbereiding voor single virion atomic force microscopie en superresolutie fluorescentie beeldvorming

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Meten van de stijfheid van<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorta&#39;s met behulp van Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Detectie van ligand-geactiveerde G-proteïne gekoppelde receptor internalisatie door confocale microscopie

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...