Name: measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:00:00
Duration: 10 min 10 s
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Ce travail a été soutenu par l’Agence subventionnaire de la République tchèque (18-02699S), le projet de recherche institutionnelle de l’Académie tchèque des sciences (RVO 68378050) et le projet MEYS CR EXCELES (LX22NPO05102). CIISB, Centre Instruct-CZ du consortium Instruct-ERIC EU, financé par le projet d’infrastructure MEYS CR LM2018127 et le Fonds européen de développement régional-projet « UP CIISB » (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) a soutenu financièrement les mesures au CF Nanobiotechnology, CEITEC MU. Nous remercions également l’installation centrale de microscopie optique, IMG CAS, Prague, République tchèque, soutenue par MEYS (LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) et RVO: 68378050-KAV-NPUI, pour leur soutien avec l’imagerie microscopique présentée ici.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Le protocole présenté fournit une méthode reproductible étape par étape pour la mesure AFM du tissu hépatique normal et fibrotique de souris. La microscopie à polarisation couplée offre une grande précision spatiale et permet de visualiser les fibres de collagène grâce à leur biréfringence. En outre, une description détaillée de l’analyse des courbes de force obtenues est fournie. La mesure de la rigidité AFM peut être effectuée au niveau cellulaire, ce qui permet de surveiller les changements locaux dans les propriétés mécaniques du tissu hépatique dus au développement d’une maladie fibrotique. La fibrose hépatique n’est pas un processus homogène affectant l’ensemble de l’organe. Au contraire, les zones de septa fibrotiques riches en collagène sont entrecoupées de zones de dépôts de collagène faibles ou nuls. Ainsi, les changements de rigidité sont spécifiques au microenvironnement local et n’affectent que les cellules localement en contact avec les zones endommagées par une blessure. Cette micro-échelle d’hétérogénéité de rigidité est également apparente dans les détails des cartes de module d’AFM Young, où les points de rigidité élevée bordent les zones de rigidité presque normale. Cette variation montre que même la zone du tissu cicatriciel de collagène n’est pas mécaniquement homogène et nécessite une mesure AFM pour être caractérisée au niveau cellulaire (Figure 4).
Le protocole présenté permet de mesurer la rigidité hépatique par AFM indépendamment de la collecte hépatique, car les lobes hépatiques entiers intégrés dans l’OCT peuvent être stockés pendant une période prolongée à -80 ° C. Cependant, une fois le tissu sectionné, nous recommandons de mesurer les échantillons dans un délai de ~2 semaines, car nous avons observé un ramollissement progressif des sections de tissu stockées pendant de plus longues périodes (Figure 5).
L’AFM équipé de la microscopie à polarisation permet de localiser avec précision la zone d’intérêt dans la structure du lobule hépatique. Cependant, il présente également certaines limites qui doivent être prises en compte lors de l’interprétation des résultats. Les valeurs de rigidité obtenues ici ont été mesurées à température ambiante. Nous supposons que les effets de la température sur les propriétés mécaniques des tissus mous seront faibles; Cependant, cela pourrait être l’une des raisons des différences entre les valeurs in vivo rapportées des propriétés mécaniques des tissus hépatiques et les valeurs de cette étude.
De plus, ce protocole permet l’analyse AFM du tissu hépatique jusqu’à 3 heures, ce qui nécessite une légère fixation du tissu. La légère fixation des sections de tissus, ainsi que le cycle gel-décongélation, affecteront très probablement les valeurs absolues du module de Young. Ainsi, les valeurs rapportées des modules de Young pourraient différer des valeurs in vivo . D’autres études sont nécessaires pour optimiser le protocole de mesure des valeurs absolues du module de Young à partir de coupes hépatiques, ce qui peut être réalisé par une méthode différente de fixation du tissu hépatique64.
Néanmoins, nous avons observé une rigidité croissante des zones riches en collagène dans le foie de souris traitées avec CCl4 pendant 3 semaines par rapport à 6 semaines. De tels changements correspondent à la progression de la fibrose lors d’une lésion prolongée (Figure 4) et montrent que les différences relatives peuvent être sondées entre les différents traitements en utilisant le protocole présenté. Ceci est en accord avec les observations de Calò et al., qui ont montré que les sections hépatiques légèrement fixées montrent des différences similaires dans les valeurs de rigidité entre les zones riches en collagène et les zones manquantes de collagène que dans les tissus frais25.
Nous avons utilisé le porte-à-faux SD-qp-BioT-TL-10 (constante de ressort théorique ~0,09 N/m) modifié avec une pointe sphérique de 5,7 μm de diamètre pour minimiser la perturbation mécanique du tissu hépatique pendant les mesures. Un cordon de 5,7 μm a permis une indentation suffisante de l’échantillon pour sonder sa rigidité tout en préservant son intégrité. Un cordon avec un diamètre plus petit peut être utilisé, après plusieurs optimisations, pour obtenir une résolution plus élevée dans les cartes de rigidité, mais peut conduire à une surestimation supplémentaire des valeurs de module de Young (pour plus de détails, voir Crichton et al.65). En utilisant l’ensemble cantilever-billes spécifié, nous avons pu caractériser la rigidité de l’échantillon dans une large gamme, de dizaines d’unités de Pa à ~100 kPa.
Le modèle de Sneddon a été utilisé pour dériver le module de Young à partir de courbes de force, car il permet d’analyser des indentations profondes avec des sondes colloïdales62. Le modèle de Sneddon, contrairement au modèle de Hertz, ne souffre pas de la contrainte que le rayon de contact doit être beaucoup plus petit que le rayon de la sphère. Il suppose en outre que l’épaisseur de l’échantillon est plusieurs fois supérieure à la profondeur d’indentation30,66. Dans la présente étude, l’indentation était de ~2 μm avec une taille de bille de 5,7 μm et une épaisseur d’échantillon de 30 μm dans les zones riches en collagène; ainsi, le modèle de Sneddon était approprié. D’autres modèles63 considérant la force d’adhérence entre la pointe et le substrat peuvent être utilisés pour différents types de tissus.
L’analyse dans AtomicJ met en œuvre des corrections pour l’épaisseur finie des échantillons afin de minimiser la contribution d’un substrat tout en dérivant le module de Young62,67. Dans l’analyse des courbes de force obtenues, nous avons utilisé un seul rapport de Poisson de 0,45, qui a été précédemment recommandé pour les organes des tissus mous24. Cette approximation n’a pas d’effet significatif sur les valeurs calculées du module de Young, car le changement de la valeur du rapport de Poisson de 0,4 à 0,5 n’entraîne qu’une diminution de 0,893x des valeurs de module de Young calculées selon l’équation de Sneddon. Compte tenu des différences multiples dans le module de Young entre les différentes durées des traitements CCl4, les erreurs produites par l’approximation du rapport de Poisson ne sont que marginales.
Nous avons utilisé des courbes de retrait pour calculer les valeurs de rigidité, car nous nous sommes intéressés à la réponse élastique du tissu à la charge fournie par le porte-à-faux plutôt qu’à la réponse plastique à l’indentation68. En raison de la réponse viscoélastique des tissus mous, l’ajustement des courbes de retrait pourrait surestimer le module de Young, ce qui doit être gardé à l’esprit. En outre, nous avons observé que l’analyse des données avec des courbes d’approche donne des tendances similaires dans les valeurs de rigidité entre les zones fibrotiques et témoins, bien que les valeurs absolues soient proportionnellement plus faibles (données non présentées).
Tout en optimisant le protocole, nous avons identifié plusieurs étapes critiques pour la reproductibilité des mesures. Tout d’abord, il est important de s’assurer que la perle est approximativement au centre de la pointe translucide lors de la fixation au porte-à-faux. Cela évite un éventuel déséquilibre mécanique lors de l’indentation. Deuxièmement, lors de la fixation du foie avec PFA, il est nécessaire de suivre strictement les délais de décongélation et de fixation. Changer le moment de cette étape pourrait gravement affecter les propriétés mécaniques des sections de tissu. Troisièmement, le porte-à-faux doit être étalonné à plusieurs reprises avec une surveillance continue et la saisie de valeurs de température simultanées pour éviter que des artefacts ne se produisent dans les valeurs de rigidité en raison des fluctuations de température. Enfin, une seule section de foie ne doit pas être mesurée pendant plus de 3 heures à compter de la préparation, car le PBS superposé peut s’évaporer sur de plus longues périodes. Les lecteurs peuvent se référer au tableau de dépannage (tableau 3) pour résoudre les problèmes rencontrés lors de la mesure AFM, également discuté en détail dans Norman et al.46.
Tableau 3 : Guide de dépannage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%203v2.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Le protocole présenté permet un sondage AFM reproductible du tissu hépatique. Il a le potentiel de révéler des informations sur le développement et la régression éventuelle de la maladie hépatique fibrotique à un niveau microscopique et peut contribuer au développement de thérapies ciblant les régions cicatricielles fibrotiques formées au cours de la progression de la maladie hépatique chronique.

Le foie est un organe vital pour le maintien de l’homéostasie dans les organismes 1,2. Les maladies chroniques du foie représentent ~2 millions de décès dans le monde chaque année3. Ils proviennent le plus souvent d’infections virales, de troubles auto-immuns, de syndromes métaboliques ou de maladies liées à l’abus d’alcool et s’accompagnent d’une fibrose hépatique progressive. Les lésions hépatiques provoquent une réponse inflammatoire, ce qui conduit à l’activation des cellules déposant la matrice extracellulaire (ECM) dans une réponse de cicatrisation. Cependant, en présence d’une insulte chronique, l’excès d’ECM forme du tissu cicatriciel non résolu dans le foie, entraînant le développement d’une fibrose hépatique, d’une cirrhose, d’un carcinome hépatique et, finalement, d’une insuffisance hépatique4.
La lésion des hépatocytes entraîne immédiatement une augmentation de la rigidité hépatique 5,6. Cela affecte directement la fonction des hépatocytes, active les cellules stellaires hépatiques (CSH) et les fibroblastes portiques, et entraîne leur transdifférenciation en myofibroblastes déposant du collagène 7,8. Le dépôt d’ECM fibreux augmente encore la rigidité hépatique, créant une boucle de rétroaction auto-amplifiante de raidissement du foie et d’activation cellulaire productrice de matrice.
La rigidité hépatique est donc devenue un paramètre important dans le pronostic de la maladie du foie. Le changement dans les propriétés biomécaniques des tissus peut être détecté plus tôt que la fibrose peut être diagnostiquée par analyse histologique. Par conséquent, diverses techniques de mesure de la rigidité hépatique ont été développées à la fois dans la recherche et les applications cliniques. En milieu clinique, l’élastographie impulsionnelle (TE)9,10,11,12,13 et l’élastographie par résonance magnétique (EMR)14,15,16,17,18 ont été utilisées pour diagnostiquer de manière non invasive les premiers stades des lésions hépatiques en examinant la rigidité hépatique macroscopique 19.
Dans TE, des ondes ultrasonores d’amplitude légère et de basse fréquence (50 Hz) se propagent à travers le foie, et leur vitesse est mesurée, qui est ensuite utilisée pour calculer le module d’élasticitétissulaire 13. Cependant, cette technique n’est pas utile pour les patients souffrant d’ascite, d’obésité ou d’espaces intercostaux inférieurs en raison d’une mauvaise transmission des ondes ultrasonores à travers les tissus entourant le foie9.
L’EMR est basée sur la modalité d’imagerie par résonance magnétique et utilise des ondes de cisaillement mécaniques de 20 à 200 Hz pour cibler le foie. Une séquence spécifique d’imagerie par résonance magnétique est ensuite utilisée pour tracer les ondes à l’intérieur du tissu et calculer la rigidité tissulaire16. Les valeurs de rigidité rapportées avec les techniques TE et MRE sont bien corrélées avec le degré de fibrose hépatique obtenu à partir de biopsies d’échantillons de foie humain classés à l’aide des scores histologiques METAVIR20 (tableau 1). TE et MRE ont également été adaptés pour la mesure de la rigidité hépatique dans des modèles de rongeurs à des fins de recherche21,22,23. Cependant, comme les deux méthodes déduisent les valeurs de rigidité de la réponse du tissu aux ondes de cisaillement qui se propagent, les valeurs obtenues peuvent ne pas refléter la rigidité mécanique absolue du tissu.
Pour une caractérisation mécanique directe du foie des rongeurs, Barnes et coll. ont mis au point un essai modèle-gel-tissu (dosage MGT) impliquant l’incorporation de tissu hépatique dans du gel de polyacrylamide24. Ce gel est comprimé par une force uniforme pulsée à partir de laquelle le module de Young peut être calculé. Le test MGT montre une bonne corrélation avec un test d’indentation adapté aux foies normaux et fibrotiques24 (tableau 1).
Tableau 1 : Valeurs de rigidité hépatique au niveau de l’agrégation. TE et MRE comparés à des mesures mécaniques ex vivo directes des modules élastiques hépatiques utilisant des tests d’indentation et de MGT pour les foies provenant de différentes sources. La relation entre E et G est donnée par E = 2G (1 + v), où v est le rapport de Poisson de l’échantillon; F0 à F4 représentent le score de fibrose dans le système de notation METAVIR, F0 indiquant une fibrose faible ou nulle et F4 des foies cirrhotiques. Abréviations : TE = élastographie impulsionnelle; EMR = élastographie par résonance magnétique; MGT = modèle-gel-tissu; E = module d’élasticité (de Young); G = module de cisaillement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%201v2.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
L’un des principaux inconvénients des mesures génériques de rigidité hépatique est qu’elles ne fournissent pas de résolution au niveau cellulaire de l’hétérogénéité de la rigidité dans le foie. Au cours de la progression de la fibrose, les zones riches en collagène montrent une rigidité plus élevée par rapport au parenchyme environnant25,26. Ce gradient de rigidité influence localement les cellules résidentes et joue un rôle important dans l’hétérogénéité des CSH27. Ainsi, les changements dans les propriétés mécaniques locales au cours du développement de la maladie hépatique doivent être caractérisés au niveau microscopique pour mieux comprendre la progression de la fibrose.
L’AFM permet de mesurer les propriétés mécaniques des tissus avec une haute résolution et une sensibilité élevée à la force. AFM utilise la pointe d’un porte-à-faux pour indenter la surface d’un échantillon avec des forces aussi faibles que plusieurs piconewtons, induisant une déformation à un niveau microscopique ou nanoscopique basée sur la géométrie et la taille de la pointe utilisée. La réponse de force de l’échantillon à la déformation appliquée est ensuite mesurée comme la déviation dans le porte-à-faux28. Les courbes force-déplacement sont collectées à partir de l’approche et de la rétraction du porte-à-faux, qui peut être équipé de modèles de mécanique de contact appropriés pour évaluer la rigidité locale de l’échantillon29.
En plus de mesurer la rigidité d’une zone donnée, AFM peut également fournir des informations topographiques sur des caractéristiques spécifiques de l’échantillon, telles que la structure des fibres de collagène30,31,32. De nombreuses études ont décrit l’application de l’AFM pour mesurer la rigidité de divers tissus sains et malades, tels que la peau 32,33, le poumon 34,35, le cerveau36, le sein37,38,39, le cartilage 40 ou le cœur41,42,43,44 à partir d’échantillons de modèles de patients et de souris. En outre, AFM a également été utilisé in vitro pour déterminer la rigidité des cellules et des échafaudages de protéines extracellulaires45,46,47.
La mesure des propriétés mécaniques des échantillons biologiques à l’aide de l’AFM n’est pas triviale en raison de leur douceur et de leur fragilité. Ainsi, diverses études ont normalisé différentes conditions et paramètres, ce qui donne des valeurs très fluctuantes des modules de Young (examiné par Mckee et al.48). Comme pour d’autres tissus mous, les valeurs de module de Young hépatique à différents degrés de fibrose hépatique présentent également des variations importantes (tableau 2). Les différences dans les valeurs de module de Young proviennent de différences dans le mode de fonctionnement de l’AFM, la pointe en porte-à-faux, la méthode de préparation de l’échantillon, l’épaisseur de l’échantillon, la profondeur et les forces d’indentation, l’environnement du tissu hépatique pendant la mesure et la méthode d’analyse (tableau 2).
Tableau 2 : Valeurs de rigidité hépatique au niveau cellulaire. Les valeurs de rigidité hépatique obtenues à l’aide de l’AFM décrivent les propriétés mécaniques du foie au niveau cellulaire. Abréviations : AFM = microscopie à force atomique; E = module d’élasticité (de Young); PFA = paraformaldéhyde; PBS = solution saline tamponnée au phosphate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%202v2.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Cet article décrit un protocole pour la mesure reproductible des modules de Young des zones fibrotiques riches en collagène dans le tissu hépatique par AFM avec une localisation précise fournie par l’utilisation de la microscopie à polarisation. Nous avons administré du tétrachlorure de carbone (CCl4) pour induire le dépôt de collagène de manière centrilobulaire49 dans un modèle murin, imitant de manière fiable des aspects cruciaux de la fibrose hépatique humaine50. Les images microscopiques polarisées permettent de visualiser le collagène dans le foie en raison de la biréfringence des fibres de collagène51, ce qui permet un positionnement précis de la pointe en porte-à-faux sur la zone d’intérêt souhaitée dans le lobule hépatique52.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >AFM head</td>
			<td >Bruker</td>
			<td >JPK nanowizard 3</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cameras</td>
			<td >Andor</td>
			<td >Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >The Imagingsource&#160;</td>
			<td >S/N:12310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cantilever</td>
			<td >SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors</td>
			<td>S/N:73750F05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryotome</td>
			<td >Leica&#160;</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epoxy resin glue (Long working time )</td>
			<td >Bison epoxy universal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Melamine beads; diameter, 5.7 um</td>
			<td >Microparticles, GmbH</td>
			<td>MF-R-5.7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td>&#160;IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrophobic&#160; slide marker</td>
			<td >SuperHT</td>
			<td>PAP PEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td >JPK nanowizard&#160; v6.1.151</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >AtomicJ v2.3.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost slides</td>
			<td >Thermoscientific</td>
			<td>ref no. J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >System</td>
			<td >Ubuntu 14.04.5 LTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibration isolation control unit</td>
			<td >Tablestable</td>
			<td>AVI-200-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy

Le raidissement de la matrice a été reconnu comme l’un des principaux moteurs de la progression de la fibrose hépatique. Il a des effets profonds sur divers aspects du comportement cellulaire tels que la fonction, la différenciation et la motilité cellulaires. Cependant, comme ces processus ne sont pas homogènes dans l’ensemble de l’organe, il est devenu de plus en plus important de comprendre les changements dans les propriétés mécaniques des tissus au niveau cellulaire.
Pour pouvoir surveiller le raidissement des zones riches en collagène dans les lobes du foie, cet article présente un protocole de mesure des modules élastiques des tissus hépatiques avec une grande précision spatiale par microscopie à force atomique (AFM). L’AFM est une méthode sensible ayant le potentiel de caractériser les propriétés mécaniques locales, calculées comme le module de Young (également appelé module élastique). L’AFM couplée à la microscopie à polarisation peut être utilisée pour localiser spécifiquement les zones de développement de la fibrose en fonction de la biréfringence des fibres de collagène dans les tissus. En utilisant le protocole présenté, nous avons caractérisé la rigidité des zones riches en collagène des foies de souris fibrotiques et des zones correspondantes dans les foies des souris témoins.
Une augmentation importante de la rigidité des zones positives au collagène a été observée avec le développement de la fibrose. Le protocole présenté permet une méthode hautement reproductible de mesure de l’AFM, en raison de l’utilisation de tissu hépatique légèrement fixé, qui peut être utilisée pour approfondir la compréhension des changements initiés par la maladie dans les propriétés mécaniques des tissus locaux et de leur effet sur le devenir des cellules voisines.

Des coupes hépatiques légèrement fixées de 30 μm d’épaisseur obtenues chez des souris témoins et des souris présentant une fibrose légère ou avancée (induite par injection de CCl4 pendant 3 semaines ou 6 semaines, respectivement49) ont été sondées avec AFM comme décrit dans ce protocole. Des fibres de collagène proches des veines centrales ont été sélectionnées pour la mesure des cartes de rigidité. Les zones proches des veines centrales, qui correspondent aux zones où se forment habituellement les fibres de collagène chez les animaux traités au CCl4, ont été analysées dans les foies témoins (Figure 4A). La distribution des modules de Young était reproductible sur différents foies témoins et zones riches en collagène au sein d’une seule section hépatique (Figure 4B : tracé du violon gauche).
Chez les animaux traités au CCl 4, les cartes de rigidité correspondant aux zones péricentrales des dépôts de collagène ont montré des valeurs significativement plus élevées des modules de Young par rapport aux zones équivalentes chez les souris témoins (Figure 4B : 1,9 kPa contre 2,6 kPa médiane Valeurs du module de Young pour le contrôle vs souris traitée CCl 4 à 3 semaines ; p = 0,07 ; 1,9 kPa vs 5,1 kPa médiane Valeurs du module de Young pour le contrôle vs 6 semaines CCl4 -souris traitée; p = 0,02). De plus, il y avait une augmentation significative des valeurs des modules de Young avec un traitement CCl 4 plus long (Figure 4B; 2,6 kPa contre 5,1 kPa valeurs médianes du module de Young pour une souris traitée à 3 semaines par rapport à une souris CCl4 à 6 semaines; p = 0,04). Cela montre un raidissement progressif des dépôts de collagène avec la progression de la fibrose et que les mesures AFM reflètent la fibrogenèse.
Pour évaluer l’effet du stockage prolongé de coupes hépatiques intégrées dans les OCT sur les propriétés mécaniques des fibres de collagène, nous avons mesuré la rigidité des fibres de collagène dans des sections de souris traitées au CCl4, qui ont été stockées à -80 °C pendant 2 semaines ou 3 mois sur la lame après la coupe (Figure 5). Les mesures de l’AFM ont montré des valeurs significativement plus faibles des modules de Young dans les zones riches en collagène pour les sections stockées pendant 3 mois par rapport à celles obtenues à partir de sections mesurées dans les 2 semaines suivant la sectionnement de l’échantillon (Figure 5; 4,7 kPa contre 3,6 kPa valeurs médianes du module de Young pendant 2 semaines contre 3 mois de stockage; p < 0,001). Ainsi, il est important de mesurer les propriétés mécaniques du tissu hépatique peu de temps après la préparation des sections à partir des lobes hépatiques intégrés dans les OCT.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig04.jpg"> Figure 4 : Les mesures de l’AFM révèlent un raidissement progressif des zones riches en collagène en corrélation avec un traitement prolongé par CCl4. (A) Des coupes de foie de souris témoins et de souris traitées avec CCl4 pendant 3 semaines ou 6 semaines ont été utilisées pour mesurer les propriétés mécaniques des zones riches en collagène. Les zones en boîte des sections hépatiques montrées dans les images de microscopie polarisée (à gauche) sont des zones de balayage riches en collagène (ou des régions correspondantes dans le foie témoin) sélectionnées pour les mesures AFM (30 μm x 100 μm, 10 pixels x 36 pixels). Les cartes de module de Young avec des échelles de couleurs correspondant à ces zones encadrées sont affichées à droite, y compris les histogrammes des valeurs de module de Young à partir de ces cartes; Les nuages de points en médaillon indiquent des valeurs >10 kPa pour chaque condition. Le raidissement du foie est visualisé comme un déplacement progressif vers la droite de la distribution de l’histogramme et une fréquence plus élevée de points dans le nuage de points en médaillon. Barre d’échelle = 20 μm. (B) Les diagrammes de violon montrent la distribution des modules élastiques de trois zones mesurées pour chaque condition (à gauche) et les valeurs résumées des modules élastiques des trois cartes (à droite). Les tracés de violon montrent la médiane (ligne rouge), le 25e percentile et le 75e percentile (lignes noires); Les points représentent les valeurs moyennes des cartes individuelles des zones 1 à 3. Les valeurs p présentées ont été calculées à l’aide d’un test t de Student effectué sur des moyennes. Abréviations : AFM = microscopie à force atomique; CCl4 = tétrachlorure de carbone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig05.jpg"> Figure 5: Le stockage prolongé des sections de foie entraîne une diminution de la rigidité des zones riches en collagène. Des coupes de foie (préparées à partir de souris traitées avec CCl4 pendant 2 semaines) stockées à -80 °C pendant 2 semaines ou 3 mois ont été utilisées pour mesurer le module de Young. Images de microscopie polarisée (à gauche) avec des cases indiquant les zones riches en collagène utilisées pour la mesure AFM (30 μm x 100 μm, 10 pixels x 36 pixels). Cartes de module de Young correspondantes avec des échelles de couleurs (à droite). Les histogrammes montrent les valeurs de module de Young recueillies dans 4 à 6 zones de chaque échantillon; Les graphiques de dispersion en médaillon montrent des valeurs >10 kPa pour chaque condition. Barre d’échelle = 20 μm. Abréviations : AFM = microscopie à force atomique; CCl4 = tétrachlorure de carbone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire S1 : Procédé de modification du porte-à-faux avec une microbille de résine mélamine. (A) Le schéma dessiné illustre la fixation d’une perle sphérique à l’extrémité du porte-à-faux. Pour une description par étapes, voir Section 2, Partie 1, Fixation d’un cordon de 5,7 μm à la pointe en porte-à-faux AFM. (B) Image microscopique d’une bille sphérique de 5,7 μm fixée à la pointe du porte-à-faux montrée de haut (gauche) et latérale (droite). Barres d’échelle = 20 μm. Abréviations : AFM = microscopie à force atomique; RT = température ambiante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%201.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire S2 : Analyse des données dans AtomicJ. (A) La séquence des étapes à suivre pour l’ouverture des cartes de rigidité dans AtomicJ. Un simple clic gauche sur les courbes de force de processus et les cartes (x) ouvre l’assistant de traitement. Les fichiers peuvent être chargés dans l’assistant de traitement en cliquant sur ajouter (y) et en sélectionnant les fichiers requis. Cliquez sur suivant (z) pour passer à l’étape suivante. (B) Paramètres pour l’ajustement de la courbe, modèle de mécanique de contact approprié et réglages AFM utilisés pendant la mesure. Les étapes 1 à 11 renvoient aux sous-points correspondants détaillés à l’étape 3 du protocole, section 5, Analyse des données. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary_fig_2.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire S3 : Aperçu des données analysées dans AtomicJ. L’aperçu des données analysées affiche des cartes de rigidité (fenêtre supérieure gauche), des courbes de force (fenêtre supérieure droite) et des données brutes (fenêtre inférieure). Abréviation : AFM = microscopie à force atomique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%203.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

Nous présentons un protocole pour mesurer les modules élastiques des zones riches en collagène dans le foie normal et malade en utilisant la microscopie à force atomique. L’utilisation simultanée de la microscopie à polarisation fournit une grande précision spatiale pour localiser les zones riches en collagène dans les sections du foie.

Mesure de la rigidité hépatique par microscopie à force atomique couplée à la microscopie à polarisation

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

Notre protocole établit une distinction entre les zones riches en collagène et les zones manquantes de collagène dans les sections du foie. Il peut ainsi être utilisé pour étudier les processus de fibrogenèse dans les moindres détails. Le principal avantage de la technique réside dans l’utilisation de la microscopie polarisante pour localiser les zones riches en collagène dans les sections du foie.Nos protocoles peuvent fournir un excellent aperçu du développement de la fibrose hépatique, et ils peuvent également être adoptés pour d’autres tissus mous tels que les poumons après certaines optimisations. Pour commencer, retirez les sections de foie congelées à moins 80 degrés Celsius et décongelez-les à température ambiante pendant deux minutes. Fixez les sections avec du paraformaldéhyde glacé à 4% dans du PBS pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, puis lavez cinq fois avec du PBS.Après le dernier lavage, essuyez l’excès de PBS autour de la section du foie à l’aide de tissu et marquez une limite d’environ deux centimètres sur quatre autour de la section du foie avec un stylo marqueur hydrophobe. Couvrez l’échantillon avec du PBS, puis chargez l’échantillon sur la scène AFM et couvrez-le avec la tête AFM. Dans le logiciel de microscopie à force atomique ou AFM, accédez à l’onglet Configuration et cochez l’enregistrement automatique pour enregistrer automatiquement tous les fichiers.Spécifiez ensuite le nom du fichier et le répertoire pour enregistrer les fichiers de mesure en allant dans l’onglet de configuration et en cliquant sur enregistrer les paramètres. Approchez la surface du tissu avec le porte-à-faux AFM en allumant le laser et en cliquant sur la touche d’approche. Une fois l’approche terminée, retirez la pointe du porte-à-faux en cliquant une fois sur la touche de rétraction, ce qui rétracte le porte-à-faux à l’extrémité supérieure de la plage piézoélectrique.Si nécessaire, réalignez le détecteur à l’aide des boutons de la tête AFM. Éteignez le laser. La pointe est maintenant au centre de l’objectif.Ensuite, superposez le champ optique du microscope avec les cartes de mesure AFM en cliquant sur l’onglet accessoires et en sélectionnant l’étalonnage optique par superposition directe. Dans la fenêtre suivante, cliquez sur Suivant pour prendre une série d’images du porte-à-faux scannant une zone spécifique. Cliquez à nouveau sur Suivant pour passer à la fenêtre suivante.Dans la première image, cliquez manuellement sur le centre de la pointe du porte-à-faux pour représenter la position de la pointe dans le logiciel. Le cercle représentant la position de la pointe peut être manipulé en taille en indiquant son rayon pour augmenter la précision. Cliquez sur Calibrer pour détecter automatiquement la position de la pointe en porte-à-faux dans toutes les images.Confirmez l’exactitude de la détection des pointes en parcourant les images. Cliquez sur Suivant, puis sur Terminer pour terminer la superposition optique. Ensuite, déplacez la scène pour positionner une zone riche en collagène à l’intérieur de la boîte verte, visible dans l’onglet de la visionneuse de données, à l’aide de l’image polarisée.Sélectionnez la zone riche en collagène en définissant la zone sous l’onglet grille, puis créez un rectangle sur l’onglet de la visionneuse de données en appuyant longuement sur le bouton gauche de la souris dans la zone verte spécifiée. Cliquez sur confirmer la nouvelle région de numérisation pour définir la zone sélectionnée comme zone de mesure. Définissez les paramètres de la boucle de rétroaction.Set I gagne à 50 hertz et P gain à 0,001. Ensuite, définissez le point de consigne à un nano Newton. Sélectionnez la valeur de consigne relative en fonction des propriétés mécaniques des matériaux étudiés et de la rigidité du porte-à-faux.Spécifiez une ligne de base juste pour ajuster correctement les courbes de force. Sélectionnez ensuite la longueur du mouvement en porte-à-faux sur l’axe Z en fonction de la topographie de surface de l’échantillon. Réglez le mouvement Z sur une durée constante.Définissez le temps d’extension sur une seconde avec les délais d’extension et de rétractation à zéro. Réglez la fréquence d’échantillonnage à 5 000 hertz. Marquez une coche devant la boucle fermée Z pour ajuster automatiquement la distance entre l’échantillon et la pointe en porte-à-faux pendant les mesures.Débrayez ensuite la commande de scène motorisée en désélectionnant le bouton d’engagement. Allumez le laser et approchez l’échantillon avec le porte-à-faux. Cliquez sur démarrer l’analyse pour collecter les courbes de distance de force.Analysez les données acquises à l’aide du logiciel open source AtomicJ. Chargez les courbes de force dans le programme en cliquant sur l’icône des courbes de force de processus et des cartes. Puis dans l’assistant de traitement, ajoutez les cartes à analyser en cliquant sur le bouton ajouter.Une fois les cartes chargées, cliquez sur Suivant. Spécifiez les paramètres de traitement dans la fenêtre suivante. Pour estimer automatiquement le point de contact entre l’échantillon et le porte-à-faux à l’aide d’un ensemble de paramètres de courbe d’ajustement, utilisez l’estimation automatique du point de contact.Déterminer le point de contact entre le porte-à-faux et l’échantillon par la méthode classique de la grille focalisée. Sélectionnez la méthode d’estimation comme méthode indépendante du modèle pour obtenir la meilleure détermination du point de contact en fonction de la qualité des courbes de force mesurées, qui doit être déterminée empiriquement lors de l’optimisation de l’analyse des données. Ajustez la courbe d’indentation de force en utilisant un modèle classique comme L deux classique pour l’ajustement du modèle.Définissez l’ajustement du modèle à la courbe de retrait. Réglez le ratio de Poisson à 0,45 comme recommandé pour les tissus mous tels que le foie. Réglez l’ajustement de la courbe en utilisant un degré de base de trois et un degré de contact de un.Modifiez le degré d’ajustement du polynôme en fonction de l’échelle des écarts des courbes par rapport au modèle. Sélectionnez le modèle utilisé pour ajuster les courbes de retrait comme modèle de Sneddon. Remplissez le rayon de la pointe sphérique à 2,9 micromètres.Chargez la constante de ressort et invOLS à partir des fichiers de données en activant la lecture, puis cliquez sur terminer. Après l’analyse des données, parcourez les courbes de force. Exclure les courbes de force où le porte-à-faux s’est approché de manière incorrecte de la surface de la section du foie.Ces courbes ont un bruit élevé et des formes aberrantes. Après cela, les données peuvent être copiées ou exportées. Dans cette étude, des coupes hépatiques légèrement fixées obtenues à partir de souris témoins et de souris atteintes de fibrose légère et avancée induite par l’injection de tétrachlorure de carbone ont été sondées avec AFM.Les zones proches des veines centrales correspondant aux zones où les fibres de collagène chez les souris tétrachlorure de carbone se forment habituellement ont été analysées dans les foies témoins. La distribution des modules de Young était reproductible dans différentes régions dans les foies témoins et les zones riches en collagène au sein d’une seule section hépatique. Chez les souris traitées au tétrachlorure de carbone, les cartes de rigidité correspondant aux zones péricentrales des dépôts de collagène ont montré des valeurs significativement plus élevées des modules de Young par rapport aux zones équivalentes chez les souris témoins.De plus, il y avait une augmentation significative des valeurs des modules de Young avec un traitement plus long. L’effet du stockage prolongé de sections de foie sur les propriétés mécaniques des fibres de collagène a également été évalué. Les mesures AFM ont montré des valeurs significativement plus faibles des modules de Young dans les zones riches en collagène pour les sections stockées pendant trois mois, par rapport à celles obtenues dans les deux semaines.Le moment de la fixation de la section du foie détermine grandement les propriétés mécaniques de la section du foie. Nous recommandons que les intervalles chronométrés indiqués dans le protocole soient strictement suivis. Après certaines optimisations dans le protocole, la méthode donnée peut être utilisée pour tous les tissus mous présentant un dépôt de collagène significatif, détectable par microscopie polarisante.La technique donnée fournit aux chercheurs un protocole unifié et pratique pour étudier le mécanisme du foie à travers la santé et la maladie.

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