Name: measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:00:00
Duration: 10 min 10 s
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Diese Arbeit wurde von der Förderagentur der Tschechischen Republik (18-02699S), dem institutionellen Forschungsprojekt der Tschechischen Akademie der Wissenschaften (RVO 68378050) und dem MEYS CR-Projekt NICR EXCELES (LX22NPO05102) unterstützt. CIISB, Instruct-CZ Centre of Instruct-ERIC EU consortium, finanziert durch MEYS CR Infrastrukturprojekt LM2018127 und European Regional Development Fund-Projekt "UP CIISB" (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) unterstützte finanziell die Messungen am CF Nanobiotechnology, CEITEC MU. Wir danken auch der Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Prag, Tschechische Republik, unterstützt von MEYS (LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) und RVO: 68378050-KAV-NPUI, für ihre Unterstützung bei der hier vorgestellten Mikroskopie-Bildgebung.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Das vorgestellte Protokoll bietet eine schrittweise reproduzierbare Methode zur AFM-Messung von normalem und fibrotischem Lebergewebe der Maus. Die gekoppelte Polarisationsmikroskopie bietet eine hohe räumliche Präzision und ermöglicht die Visualisierung von Kollagenfasern aufgrund ihrer Doppelbrechung. Ferner wird eine detaillierte Beschreibung der Analyse der erhaltenen Kraftkurven gegeben. Die AFM-Steifigkeitsmessung kann auf zellulärer Ebene durchgeführt werden, wodurch lokale Veränderungen der mechanischen Eigenschaften des Lebergewebes aufgrund sich entwickelnder fibrotischer Erkrankungen überwacht werden können. Leberfibrose ist kein homogener Prozess, der das gesamte Organ betrifft. Im Gegenteil, Bereiche kollagenreicher fibrotischer Septen sind mit Bereichen mit geringen oder keinen Kollagenablagerungen durchsetzt. Daher sind Steifigkeitsänderungen spezifisch für die lokale Mikroumgebung und betreffen nur Zellen, die lokal mit durch Verletzungen geschädigten Bereichen in Kontakt stehen. Diese Mikroskala der Steifigkeitsheterogenität zeigt sich auch in den Details der Modulkarten von AFM Young, wo Punkte mit hoher Steifigkeit die Bereiche mit fast normaler Steifigkeit begrenzen. Diese Variation zeigt, dass selbst der Bereich des Kollagennarbengewebes mechanisch nicht homogen ist und eine AFM-Messung auf zellulärer Ebene erfordert (Abbildung 4).
Das vorgestellte Protokoll ermöglicht die Messung der Lebersteifigkeit mittels AFM unabhängig von der Leberentnahme, da die gesamten in OCT eingebetteten Leberlappen über einen längeren Zeitraum bei −80 °C gelagert werden können. Sobald das Gewebe jedoch geschnitten ist, empfehlen wir, die Proben innerhalb von ~ 2 Wochen zu messen, da wir eine allmähliche Erweichung der Gewebeabschnitte beobachtet haben, die für längere Zeiträume gelagert wurden (Abbildung 5).
Das mit Polarisationsmikroskopie ausgestattete AFM ermöglicht es, den interessierenden Bereich innerhalb der Leberläppchenstruktur genau zu lokalisieren. Es hat jedoch auch einige Einschränkungen, die bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden müssen. Die hier ermittelten Steifigkeitswerte wurden bei Raumtemperatur gemessen. Wir gehen davon aus, dass die Auswirkungen der Temperatur auf die mechanischen Eigenschaften von Weichgewebe gering sein werden; Dies könnte jedoch einer der Gründe für Unterschiede zwischen den berichteten in vivo Werten der mechanischen Eigenschaften von Lebergewebe und den Werten in dieser Studie sein.
Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll die AFM-Analyse von Lebergewebe für bis zu 3 h, was eine leichte Fixierung des Gewebes erfordert. Die milde Fixierung von Gewebeschnitten sowie der Gefrier-Tau-Zyklus werden höchstwahrscheinlich die absoluten Werte des Elastizitätsmoduls beeinflussen. Daher können die berichteten Werte der Young-Module von den In-vivo-Werten abweichen. Weitere Studien sind erforderlich, um das Protokoll für die Messung der absoluten Werte des Elastizitätsmoduls aus Leberschnitten zu optimieren, was durch eine andere Methode zur Fixierung von Lebergewebe erreicht werden kann64.
Nichtsdestotrotz beobachteten wir eine zunehmende Steifigkeit kollagenreicher Bereiche in der Leber von Mäusen, die 3 Wochen lang mit CCl4 behandelt wurden, verglichen mit 6 Wochen. Solche Veränderungen entsprechen dem Fortschreiten der Fibrose bei längerer Verletzung (Abbildung 4) und zeigen, dass relative Unterschiede zwischen verschiedenen Behandlungen unter Verwendung des vorgestellten Protokolls untersucht werden können. Dies stimmt mit den Beobachtungen von Calò et al. überein, die zeigten, dass leicht fixierte Leberabschnitte ähnliche Unterschiede in den Steifigkeitswerten zwischen kollagenreichen und kollagenarmen Bereichen aufweisen wie in frischem Gewebe25.
Wir verwendeten den SD-qp-BioT-TL-10 Cantilever (theoretische Federkonstante ~0,09 N/m), modifiziert mit einer kugelförmigen Spitze von 5,7 μm Durchmesser, um den mechanischen Aufschluss des Lebergewebes während der Messungen zu minimieren. Eine 5,7-μm-Wulst ermöglichte eine ausreichende Vertiefung der Probe, um ihre Steifigkeit zu untersuchen und gleichzeitig ihre Integrität zu erhalten. Eine Perle mit einem kleineren Durchmesser kann nach mehreren Optimierungen verwendet werden, um eine höhere Auflösung in den Steifigkeitsabbildungen zu erzielen, könnte aber zu einer weiteren Überschätzung der Elastizitätsmodulwerte führen (für weitere Details siehe Crichton et al.65). Unter Verwendung des spezifizierten Cantilever-Bead-Ensembles konnten wir die Probensteifigkeit in einem breiten Bereich charakterisieren, von Dutzenden von Einheiten Pa bis ~100 kPa.
Sneddons Modell wurde verwendet, um den Elastizitätsmodul aus Kraftkurven abzuleiten, da es die Analyse tiefer Vertiefungen mit kolloidalen Sondenermöglicht 62. Sneddons Modell leidet im Gegensatz zu Hertz' Modell nicht unter der Einschränkung, dass der Kontaktradius viel kleiner sein muss als der Kugelradius. Sie geht ferner davon aus, dass die Probendicke um ein Vielfaches größer ist als die Eindringtiefe30,66. In der vorliegenden Studie betrug die Vertiefung ~2 μm mit einer Perlengröße von 5,7 μm und einer Probendicke von 30 μm in kollagenreichen Bereichen; daher war Sneddons Modell angemessen. Andere Modelle63 unter Berücksichtigung der Adhäsionskraft zwischen Spitze und Substrat können für verschiedene Arten von Geweben verwendet werden.
Die Analyse in AtomicJ implementiert Korrekturen für die endliche Dicke der Proben, um den Beitrag eines Substrats zu minimieren, während der Elastizitätsmodul62,67 abgeleitet wird. Bei der Analyse der erhaltenen Kraftkurven verwendeten wir ein einzelnes Poisson-Verhältnis von 0,45, das zuvor für Weichteilorgane empfohlen wurde24. Diese Näherung hat keinen signifikanten Einfluss auf die berechneten Werte des Elastizitätsmoduls, da die Änderung des Wertes des Poisson-Verhältnisses von 0,4 auf 0,5 nur zu einer 0,893-fachen Abnahme der nach der Sneddon-Gleichung berechneten Elastizitätsmodulwerte führt. Angesichts der vielfachen Unterschiede im Elastizitätsmodul zwischen den verschiedenen Dauern von CCl4-Behandlungen sind die Fehler, die durch die Annäherung an das Poisson-Verhältnis entstehen, nur marginal.
Wir verwendeten Rückzugskurven, um Steifigkeitswerte zu berechnen, da wir eher an der elastischen Reaktion des Gewebes auf die Belastung durch den Ausleger als an der plastischen Reaktion auf den Eindruck68 interessiert waren. Aufgrund der viskoelastischen Reaktion des Weichgewebes können passende Rückzugskurven den Elastizitätsmodul überschätzen, was berücksichtigt werden sollte. Darüber hinaus haben wir beobachtet, dass die Datenanalyse mit Annäherungskurven ähnliche Trends bei den Steifigkeitswerten zwischen fibrotischen und Kontrollbereichen ergibt, obwohl die absoluten Werte entsprechend niedriger sind (Daten nicht gezeigt).
Bei der Optimierung des Protokolls identifizierten wir mehrere Schritte, die für die Reproduzierbarkeit der Messungen entscheidend sind. Zunächst ist es wichtig sicherzustellen, dass sich die Perle bei der Befestigung am Ausleger ungefähr in der Mitte der durchscheinenden Spitze befindet. Dies verhindert eine mögliche mechanische Unwucht beim Eindringen. Zweitens ist es während der Leberfixierung mit PFA notwendig, die Zeitgrenzen für das Auftauen und die Fixierung strikt einzuhalten. Eine Änderung des Zeitpunkts dieses Schritts kann die mechanischen Eigenschaften von Gewebeschnitten stark beeinträchtigen. Drittens muss der Ausleger wiederholt mit kontinuierlicher Überwachung und Eingabe gleichzeitiger Temperaturwerte kalibriert werden, um Artefakte in den Steifigkeitswerten aufgrund von Temperaturschwankungen zu vermeiden. Schließlich sollte ein einzelner Leberabschnitt nicht länger als 3 h nach der Präparation gemessen werden, da überlagertes PBS über längere Zeiträume verdunsten kann. Die Leser können sich auf die Tabelle zur Fehlerbehebung (Tabelle 3) beziehen, um Probleme zu lösen, die während der AFM-Messung aufgetreten sind und auch ausführlich in Norman et al.46 diskutiert werden.
Tabelle 3: Anleitung zur Fehlerbehebung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%203v2.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Das vorgestellte Protokoll ermöglicht eine reproduzierbare AFM-Sondierung von Lebergewebe. Es hat das Potenzial, Informationen über die Entwicklung und eventuelle Rückbildung fibrotischer Lebererkrankungen auf mikroskopischer Ebene zu liefern und kann zur Entwicklung von Therapien beitragen, die auf fibrotische Narbenregionen abzielen, die während des Fortschreitens einer chronischen Lebererkrankung gebildet werden.

Die Leber ist ein lebenswichtiges Organ für die Aufrechterhaltung der Homöostase in Organismen 1,2. Chronische Lebererkrankungen machen jährlich ~ 2 Millionen Todesfälle weltweit aus3. Sie entstehen am häufigsten als Virusinfektionen, Autoimmunerkrankungen, metabolische Syndrome oder alkoholbedingte Erkrankungen und werden von fortschreitender Leberfibrose begleitet. Eine Leberschädigung löst eine Entzündungsreaktion aus, die zur Aktivierung von Zellen führt, die extrazelluläre Matrix (ECM) in einer Wundheilungsreaktion ablagern. Bei einer chronischen Beleidigung bildet jedoch eine überschüssige EZM ungelöstes Narbengewebe in der Leber, was zur Entwicklung von Leberfibrose, Leberzirrhose, Leberkarzinom und schließlich zu Leberversagen führt4.
Eine Hepatozytenverletzung führt sofort zu einer erhöhten Lebersteifigkeit 5,6. Dies wirkt sich direkt auf die Hepatozytenfunktion aus, aktiviert hepatische Sternzellen (HSZ) und portale Fibroblasten und führt zu deren Transdifferenzierung zu kollagenablagernden Myofibroblasten 7,8. Die Ablagerung von fibröser ECM erhöht die Lebersteifigkeit weiter und erzeugt eine selbstverstärkende Rückkopplungsschleife aus Leberversteifung und matrixproduzierender Zellaktivierung.
Die Lebersteifigkeit ist somit zu einem wichtigen Parameter für die Prognose von Lebererkrankungen geworden. Die Veränderung der biomechanischen Gewebeeigenschaften kann früher erkannt werden, als Fibrose durch histologische Analyse diagnostiziert werden kann. Daher wurden verschiedene Techniken zur Messung der Lebersteifigkeit sowohl in der Forschung als auch in der klinischen Anwendung entwickelt. In klinischen Umgebungen wurden transiente Elastographie (TE) 9,10,11,12,13 und Magnetresonanz-Elastographie (MRE)14,15,16,17,18 eingesetzt, um frühe Stadien von Leberschäden durch Untersuchung der groben Lebersteifigkeit nicht-invasiv zu diagnostizieren 19.
Bei TE werden Ultraschallwellen mit leichter Amplitude und niedriger Frequenz (50 Hz) durch die Leber verbreitet und ihre Geschwindigkeit gemessen, die dann zur Berechnung des Gewebeelastizitätsmoduls13 verwendet wird. Diese Technik ist jedoch nicht nützlich für Patienten mit Aszites, Fettleibigkeit oder niedrigeren Interkostalräumen aufgrund einer unsachgemäßen Übertragung der Ultraschallwellen durch das die Leber umgebende Gewebe9.
MRE basiert auf der Magnetresonanztomographie und verwendet mechanische Scherwellen von 20-200 Hz, um die Leber anzugreifen. Eine spezifische Magnetresonanztomographie-Sequenz wird dann verwendet, um die Wellen im Gewebe zu verfolgen und die Gewebesteifigkeit zu berechnen16. Die Steifigkeitswerte, die sowohl mit TE- als auch mit MRE-Techniken berichtet wurden, korrelieren gut mit dem Grad der Leberfibrose, der aus Biopsien menschlicher Leberproben gewonnen wurde, die anhand histologischer METAVIR-Scores20 eingestuft wurden (Tabelle 1). TE und MRE wurden auch für die Messung der Lebersteifigkeit in Nagetiermodellen für Forschungszwecke angepasst21,22,23. Da beide Methoden jedoch die Steifigkeitswerte aus der Reaktion des Gewebes auf die sich ausbreitenden Scherwellen ableiten, spiegeln die erhaltenen Werte möglicherweise nicht die absolute mechanische Steifigkeit des Gewebes wider.
Für eine direkte mechanische Charakterisierung von Nagetierlebern entwickelten Barnes et al. einen Modell-Gel-Gewebe-Assay (MGT-Assay), bei dem Lebergewebe in Polyacrylamidgel24 eingebettet wird. Dieses Gel wird durch eine gepulste gleichmäßige Kraft komprimiert, aus der der Elastizitätsmodul berechnet werden kann. Der MGT-Assay zeigt eine gute Korrelation mit einem Indentationsassay, der sowohl für normale als auch für fibrotische Lebern angepasst ist24 (Tabelle 1).
Tabelle 1: Lebersteifigkeitswerte auf der Schüttebene. TE und MRE im Vergleich zu direkten ex vivo mechanischen Messungen von Leber-Elastizitätsmodulen unter Verwendung von Indentations- und MGT-Assays für Lebern aus verschiedenen Quellen. Die Beziehung zwischen E und G ist gegeben durch E = 2G (1 + v), wobei v das Poisson-Verhältnis der Probe ist; F0 bis F4 stellen den Fibrose-Score im METAVIR-Scoring-System dar, wobei F0 eine niedrige oder keine Fibrose und F4-Lebern mit Zirrhotie bezeichnet. Abkürzungen: TE = transiente Elastographie; MRE = Magnetresonanz-Elastographie; MGT = Modell-Gel-Gewebe; E = Elastizitätsmodul (Elastizitätsmodul); G = Schubmodul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%201v2.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Einer der Hauptnachteile generischer Lebersteifigkeitsmessungen besteht darin, dass sie keine Auflösung der Steifigkeitsheterogenität in der Leber auf zellulärer Ebene bieten. Während des Fortschreitens der Fibrose zeigen kollagenreiche Bereiche eine höhere Steifigkeit im Vergleich zum umgebenden Parenchym25,26. Dieser Steifigkeitsgradient beeinflusst lokal die residenten Zellen und spielt eine wichtige Rolle bei der Förderung der HSC-Heterogenität27. Daher müssen Veränderungen der lokalen mechanischen Eigenschaften während der Entwicklung von Lebererkrankungen auf mikroskopischer Ebene charakterisiert werden, um das Fortschreiten der Fibrose besser zu verstehen.
AFM ermöglicht es, die mechanischen Eigenschaften von Gewebe mit hoher Auflösung und hoher Kraftempfindlichkeit zu messen. AFM verwendet die Spitze eines Cantilevers, um die Oberfläche einer Probe mit Kräften von nur mehreren Pikonewton einzudrücken, wodurch eine Verformung auf mikroskopischer oder nanoskopischer Ebene basierend auf der Geometrie und Größe der verwendeten Spitze induziert wird. Die Kraftantwort der Probe auf die angelegte Dehnung wird dann als Durchbiegung im Ausleger28 gemessen. Kraft-Weg-Kurven werden aus dem Annähern und Zurückziehen des Auslegers gesammelt, der mit geeigneten kontaktmechanischen Modellen ausgestattet werden kann, um die lokale Steifigkeit der Probe29 zu bewerten.
Neben der Messung der Steifigkeit eines bestimmten Bereichs kann AFM auch topographische Informationen über spezifische Merkmale in der Probe liefern, wie z.B. die Struktur der Kollagenfasern30,31,32. Mehrere Studien haben die Anwendung von AFM zur Messung der Steifigkeit verschiedener gesunder und kranker Gewebe beschrieben, wie Haut 32,33, Lunge 34,35, Gehirn36, Brust 37,38,39, Knorpel 40 oder Herz 41,42,43,44 aus Patienten- und Mausmodellproben. Darüber hinaus wurde AFM auch in vitro verwendet, um die Steifigkeit von Zellen und extrazellulären Proteingerüstenzu bestimmen 45,46,47.
Die Messung der mechanischen Eigenschaften biologischer Proben mit AFM ist aufgrund ihrer Weichheit und Zerbrechlichkeit nicht trivial. So haben verschiedene Studien unterschiedliche Bedingungen und Einstellungen standardisiert, die stark schwankende Werte der Young-Moduli ergeben (überprüft von Mckee et al.48). Ähnlich wie bei anderen Weichteilen zeigen auch die Leber-Elastizitäts-Elastizitätswerte bei verschiedenen Graden der Leberfibrose starke Schwankungen (Tabelle 2). Die Unterschiede in den Elastizitätsmodulwerten ergeben sich aus Unterschieden in der Art des AFM-Betriebs, der Cantilever-Spitze, der Probenvorbereitungsmethode, der Probendicke, der Eindringtiefe und -kräfte, der Lebergewebeumgebung während der Messung und der Analysemethode (Tabelle 2).
Tabelle 2: Lebersteifigkeitswerte auf zellulärer Ebene. Lebersteifigkeitswerte, die mit AFM erhalten wurden, beschreiben die mechanischen Eigenschaften der Leber auf zellulärer Ebene. Abkürzungen: AFM = Rasterkraftmikroskopie; E = Elastizitätsmodul (Elastizitätsmodul); PFA = Paraformaldehyd; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%202v2.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die reproduzierbare Messung von Young-Moduli von kollagenreichen fibrotischen Bereichen im Lebergewebe mittels AFM mit einer präzisen Lokalisation, die durch den Einsatz von Polarisationsmikroskopie bereitgestellt wird. Wir verabreichten Tetrachlorkohlenstoff (CCl4), um die Kollagenablagerung in zentrilobulärer Weise49 in einem Mausmodell zu induzieren, wobei entscheidende Aspekte der menschlichen Leberfibrose zuverlässig nachgeahmtwurden 50. Polarisierte mikroskopische Bilder ermöglichen die Visualisierung von Kollagen in der Leber aufgrund der Doppelbrechung der Kollagenfasern51, was eine genaue Positionierung der Cantileverspitze über dem gewünschten Interessenbereich innerhalb des Leberläppchens52 ermöglicht.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >AFM head</td>
			<td >Bruker</td>
			<td >JPK nanowizard 3</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cameras</td>
			<td >Andor</td>
			<td >Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >The Imagingsource&#160;</td>
			<td >S/N:12310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cantilever</td>
			<td >SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors</td>
			<td>S/N:73750F05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryotome</td>
			<td >Leica&#160;</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epoxy resin glue (Long working time )</td>
			<td >Bison epoxy universal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Melamine beads; diameter, 5.7 um</td>
			<td >Microparticles, GmbH</td>
			<td>MF-R-5.7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td>&#160;IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrophobic&#160; slide marker</td>
			<td >SuperHT</td>
			<td>PAP PEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td >JPK nanowizard&#160; v6.1.151</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >AtomicJ v2.3.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost slides</td>
			<td >Thermoscientific</td>
			<td>ref no. J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >System</td>
			<td >Ubuntu 14.04.5 LTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibration isolation control unit</td>
			<td >Tablestable</td>
			<td>AVI-200-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy

Die Matrixversteifung wurde als einer der Haupttreiber für das Fortschreiten der Leberfibrose erkannt. Es hat tiefgreifende Auswirkungen auf verschiedene Aspekte des Zellverhaltens wie Zellfunktion, Differenzierung und Motilität. Da diese Prozesse jedoch nicht im gesamten Organ homogen sind, ist es immer wichtiger geworden, Veränderungen der mechanischen Eigenschaften von Geweben auf zellulärer Ebene zu verstehen.
Um die Versteifung kollagenreicher Bereiche innerhalb der Leberlappen überwachen zu können, stellt diese Arbeit ein Protokoll zur Messung von Lebergewebe-Elastizitätsmodulen mit hoher räumlicher Präzision mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) vor. AFM ist eine empfindliche Methode mit dem Potenzial, lokale mechanische Eigenschaften zu charakterisieren, berechnet als Elastizitätsmodul (auch als Elastizitätsmodul bezeichnet). AFM in Verbindung mit Polarisationsmikroskopie kann verwendet werden, um die Bereiche der Fibroseentwicklung basierend auf der Doppelbrechung von Kollagenfasern in Geweben spezifisch zu lokalisieren. Unter Verwendung des vorgestellten Protokolls charakterisierten wir die Steifigkeit von kollagenreichen Bereichen aus fibrotischen Mauslebern und entsprechenden Bereichen in der Leber von Kontrollmäusen.
Eine deutliche Zunahme der Steifigkeit von kollagenpositiven Bereichen wurde bei der Entwicklung von Fibrose beobachtet. Das vorgestellte Protokoll ermöglicht eine hochreproduzierbare Methode der AFM-Messung aufgrund der Verwendung von leicht fixiertem Lebergewebe, die verwendet werden kann, um das Verständnis von krankheitsbedingten Veränderungen der lokalen Gewebeeigenschaften und deren Auswirkungen auf das Schicksal benachbarter Zellen zu fördern.

Leicht fixierte, 30 μm dicke Leberschnitte von Kontrollmäusen und von Mäusen mit leichter oder fortgeschrittener Fibrose (induziert durch Injektion vonCCl 4 für 3 Wochen bzw. 6 Wochen bzw.49) wurden mit AFM untersucht, wie in diesem Protokoll beschrieben. Kollagenfasern in der Nähe der zentralen Venen wurden für die Messung von Steifigkeitskarten ausgewählt. Bereiche in der Nähe der zentralen Venen, die den Bereichen entsprechen, in denen sich bei CCl4-behandelten Tieren normalerweise Kollagenfasern bilden, wurden in Kontrolllebern analysiert (Abbildung 4A). Die Verteilung der Young-Module war reproduzierbar über verschiedene Kontrollleber und kollagenreiche Bereiche innerhalb eines einzigen Leberabschnitts (Abbildung 4B: linke Violine).
Bei CCl 4-behandelten Tieren zeigten Steifigkeitskarten, die den perizentralen Bereichen von Kollagenablagerungen entsprechen, signifikant höhere Werte der Young-Module im Vergleich zu äquivalenten Bereichen bei Kontrollmäusen (Abbildung 4B: 1,9 kPa vs. 2,6 kPa Median Elastizitätsmodulwerte für Kontroll- vs. 3-wöchige CCl 4-behandelte Maus; p = 0,07; 1,9 kPa vs. 5,1 kPa Median Elastizitätsmodulwerte für Kontrolle vs. 6 Wochen CCl4 -behandelte Maus; p = 0,02). Darüber hinaus gab es einen signifikanten Anstieg der Werte der Elastizitätsmodule bei längerer CCl4-Behandlung (Abbildung 4B; 2,6 kPa vs. 5,1 kPa Median-Elastizitätsmodulwerte für 3 Wochen vs. 6 Wochen CCl 4-behandelte Maus; p = 0,04). Dies zeigt eine allmähliche Versteifung der Kollagenablagerungen mit Fibroseprogression und dass AFM-Messungen die Fibrogenese widerspiegeln.
Um die Wirkung einer längeren Lagerung von OCT-eingebetteten Leberschnitten auf die mechanischen Eigenschaften von Kollagenfasern zu bewerten, haben wir die Steifigkeit von Kollagenfasern in Abschnitten von CCl4-behandelten Mäusen gemessen, die nach dem Schneiden für 2 Wochen oder 3 Monate bei −80 °C auf dem Objektträger gelagert wurden (Abbildung 5). AFM-Messungen zeigten signifikant niedrigere Werte der Young-Moduli in kollagenreichen Bereichen für Abschnitte, die 3 Monate gelagert wurden, verglichen mit denen, die von Abschnitten erhalten wurden, die innerhalb von 2 Wochen nach dem Probenschnitt gemessen wurden (Abbildung 5; 4,7 kPa vs. 3,6 kPa Median-Elastizitätsmodulwerte für 2 Wochen vs. 3 Monate Lagerung; p < 0,001). Daher ist es wichtig, die mechanischen Eigenschaften des Lebergewebes kurz nach der Vorbereitung der Abschnitte aus den OCT-eingebetteten Leberlappen zu messen.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig04.jpg"> Abbildung 4: AFM-Messungen zeigen eine fortschreitende Versteifung kollagenreicher Bereiche, die mit einer längeren CCl4-Behandlung korreliert. (A) Leberschnitte von Kontrollmäusen und Mäusen, die 3 Wochen oder 6 Wochen lang mit CCl4 behandelt wurden, wurden verwendet, um die mechanischen Eigenschaften kollagenreicher Bereiche zu messen. Die in den polarisierten Mikroskopiebildern (links) gezeigten Boxed-Areale von Leberabschnitten sind kollagenreiche Scanbereiche (oder entsprechende Regionen in der Kontrollleber), die für AFM-Messungen ausgewählt wurden (30 μm x 100 μm, 10 Pixel x 36 Pixel). Die Elastizitätsmodulkarten mit Farbskalen, die diesen Boxed-Bereichen entsprechen, sind rechts dargestellt, einschließlich Histogrammen der Elastizitätsmodulwerte aus diesen Karten; Inset-Streudiagramme zeigen Werte >10 kPa für jede Bedingung. Die Versteifung der Leber wird als eine allmähliche Rechtsverschiebung in der Histogrammverteilung und eine höhere Häufigkeit von Punkten im Einschubstreudiagramm visualisiert. Maßstabsbalken = 20 μm. (B) Geigendiagramme zeigen die Verteilung der Elastizitätsmodule aus drei Bereichen, die für jede Bedingung gemessen wurden (links) und zusammengefasste Elastizitätsmodulwerte aus allen drei Karten (rechts). Geigendiagramme zeigen den Median (rote Linie), das 25. Perzentil und das 75. Perzentil (schwarze Linien); Punkte stellen die Mittelwerte einzelner Karten aus den Bereichen 1-3 dar. Die vorgestellten p-Werte wurden mit Hilfe eines Student's t-Tests berechnet, der an Mittelwerten durchgeführt wurde. Abkürzungen: AFM = Rasterkraftmikroskopie; CCl4 = Tetrachlorkohlenstoff. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig05.jpg"> Abbildung 5: Eine längere Lagerung von Leberschnitten führt zu einer Abnahme der Steifigkeit kollagenreicher Bereiche. Leberschnitte (hergestellt von Mäusen, die 2 Wochen lang mit CCl4 behandelt wurden), die bei −80 °C für 2 Wochen oder 3 Monate gelagert wurden, wurden verwendet, um den Elastizitätsmodul zu messen. Polarisierte Mikroskopiebilder (links) mit Kästchen, die die kollagenreichen Bereiche angeben, die für die AFM-Messung verwendet werden (30 μm x 100 μm, 10 Pixel x 36 Pixel). Entsprechender Young-Modul bildet Farbskalen ab (rechts). Histogramme zeigen die Elastizitätsmodulwerte, die von 4-6 Bereichen in jeder Probe gesammelt wurden; Streudiagramme mit Einschub zeigen Werte >10 kPa für jede Bedingung. Maßstabsbalken = 20 μm. Abkürzungen: AFM = Rasterkraftmikroskopie; CCl4 = Tetrachlorkohlenstoff. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Ergänzende Abbildung S1: Verfahren zur Modifizierung des Cantilevers mit einer Melaminharz-Mikroperle. (A) Das gezeichnete Schema veranschaulicht die Befestigung einer kugelförmigen Perle an der Spitze des Auslegers. Eine schrittweise Beschreibung finden Sie in Abschnitt 2, Teil 1, Anbringen einer 5,7-μm-Perle an AFM-Cantilever-Spitze. (B) Mikroskopieaufnahme einer kugelförmigen 5,7 μm Perle, die an der Cantileverspitze befestigt ist, von oben (links) und seitlich (rechts). Maßstabsbalken = 20 μm. Abkürzungen: AFM = Rasterkraftmikroskopie; RT = Raumtemperatur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%201.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung S2: Datenanalyse in AtomicJ. (A) Die Abfolge der Schritte, die beim Öffnen von Steifigkeitskarten in AtomicJ zu befolgen sind. Ein einziger Linksklick auf die Prozesskraftkurven und Kennfelder (x) öffnet den Bearbeitungsassistenten. Dateien können in den Verarbeitungsassistenten geladen werden, indem Sie auf Hinzufügen (y) klicken und die gewünschten Dateien auswählen. Klicken Sie auf Weiter (z), um mit dem nächsten Schritt fortzufahren. (B) Parameter für die Kurvenanpassung, geeignetes Kontaktmechanikmodell und AFM-Einstellungen, die während der Messung verwendet werden. Die Schritte 1-11 beziehen sich auf die entsprechenden Unterpunkte, die in Protokollschritt 3, Abschnitt 5, Datenanalyse beschrieben sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary_fig_2.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung S3: Überblick über die analysierten Daten in AtomicJ. Die Vorschau der analysierten Daten zeigt Steifigkeitskarten (oberes linkes Fenster), Kraftkurven (oberes rechtes Fenster) und Rohdaten (unteres Fenster). Abkürzung: AFM = Rasterkraftmikroskopie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%203.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

Wir präsentieren ein Protokoll zur Messung der Elastizitätsmodule von kollagenreichen Bereichen in normaler und kranker Leber mittels Rasterkraftmikroskopie. Der gleichzeitige Einsatz der Polarisationsmikroskopie bietet eine hohe räumliche Präzision zur Lokalisierung kollagenreicher Areale in den Leberabschnitten.

Messung der Lebersteifigkeit mittels Rasterkraftmikroskopie gekoppelt mit Polarisationsmikroskopie

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

Unser Protokoll unterscheidet zwischen kollagenreichen und kollagenarmen Bereichen in den Leberabschnitten. Es kann somit verwendet werden, um die Prozesse der Fibrogenese genauer zu untersuchen. Der Hauptvorteil der Technik liegt in der Verwendung der Polarisationsmikroskopie, um kollagenreiche Bereiche in den Leberabschnitten zu lokalisieren.Unsere Protokolle können einen guten Einblick in die Entwicklung von Leberfibrose geben, und es kann auch für andere Weichteile wie Lungen nach bestimmten Optimierungen übernommen werden. Entfernen Sie zunächst die gefrorenen Leberabschnitte von minus 80 Grad Celsius und tauen Sie sie zwei Minuten lang bei Raumtemperatur auf. Fixieren Sie die Abschnitte mit eiskaltem 4% Paraformaldehyd in PBS für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, gefolgt von fünfmaligem Waschen mit PBS.Wischen Sie nach dem letzten Waschen das überschüssige PBS mit Gewebe um den Leberabschnitt herum ab und markieren Sie mit einem hydrophoben Markerstift eine Grenze von etwa zwei mal vier Zentimetern um den Leberabschnitt. Decken Sie die Probe mit PBS ab, laden Sie sie dann auf den AFM-Tisch und decken Sie sie mit dem AFM-Kopf ab. Gehen Sie in der Rasterkraftmikroskopie- oder AFM-Software zur Registerkarte Setup und aktivieren Sie ein Häkchen bei AutoSave, um alle Dateien automatisch zu speichern.Geben Sie dann den Dateinamen und das Verzeichnis zum Speichern der Messdateien an, indem Sie auf die Registerkarte Einstellungen klicken und auf Einstellungen speichern klicken. Nähern Sie sich der Gewebeoberfläche mit dem AFM-Cantilever, indem Sie den Laser einschalten und auf die Annäherungstaste klicken. Nachdem der Anflug abgeschlossen ist, ziehen Sie die Auslegerspitze ein, indem Sie einmal auf die Rückzugstaste klicken, wodurch der Ausleger bis zum oberen Ende des Piezobereichs zurückgezogen wird.Richten Sie den Detektor bei Bedarf mit Drehknöpfen am AFM-Kopf neu aus. Schalten Sie den Laser aus. Der Tipp steht nun im Fokus des Ziels.Als nächstes überlagern Sie das optische Feld des Mikroskops mit AFM-Messkarten, indem Sie auf die Registerkarte Zubehör klicken und die direkte optische Overlay-Kalibrierung auswählen. Klicken Sie im folgenden Fenster auf Weiter, um eine Reihe von Bildern des Auslegers aufzunehmen, der einen bestimmten Bereich scannt. Klicken Sie erneut auf Weiter, um zum nächsten Fenster zu gelangen.Klicken Sie im ersten Bild manuell auf die Mitte der Spitze des Auslegers, um die Spitzenposition in der Software darzustellen. Der Kreis, der die Spitzenposition darstellt, kann in der Größe manipuliert werden, indem sein Radius angegeben wird, um die Genauigkeit zu erhöhen. Klicken Sie auf Kalibrieren, um die Position der Cantilever-Spitze in allen Bildern automatisch zu erkennen.Bestätigen Sie die Genauigkeit der Spitzenerkennung, indem Sie die Bilder durchgehen. Klicken Sie auf Weiter und dann auf Fertig stellen, um die optische Überlagerung abzuschließen. Bewegen Sie als Nächstes die Bühne, um einen kollagenreichen Bereich innerhalb des grünen Felds zu positionieren, der auf der Registerkarte Datenanzeige sichtbar ist, indem Sie das polarisierte Bild verwenden.Wählen Sie den kollagenreichen Bereich aus, indem Sie den Bereich unter der Rasterregisterkarte definieren und dann mit langem Drücken der linken Maustaste innerhalb des angegebenen grünen Felds ein Rechteck auf der Registerkarte Datenanzeige erstellen. Klicken Sie auf Neuen Scanbereich bestätigen, um den ausgewählten Bereich als Messbereich festzulegen. Stellen Sie die Parameter der Rückkopplungsschleife ein.Setze I Verstärkung bei 50 Hertz und P Verstärkung bei 0,001. Stellen Sie dann den Sollwert auf einen Nano-Newton ein. Wählen Sie den relativen Sollwert entsprechend den untersuchten mechanischen Eigenschaften des Materials und der Steifigkeit des Auslegers.Geben Sie eine gerade Basislinie an, um die Kraftkurven richtig anzupassen. Wählen Sie dann die Länge der Cantilever-Bewegung in der Z-Achse entsprechend der Oberflächentopographie der Probe. Stellen Sie die Z-Bewegung auf konstante Dauer ein.Stellen Sie die Verlängerungszeit auf eine Sekunde ein, wobei die Verlängerungs- und Rückzugsverzögerungen auf Null gesetzt sind. Stellen Sie die Abtastrate auf 5.000 Hertz ein. Markieren Sie ein Häkchen vor dem Z Closed Loop, um den Abstand zwischen der Probe und der Cantileverspitze während der Messungen automatisch anzupassen.Deaktivieren Sie dann die motorisierte Bühnensteuerung, indem Sie die Aktivieren-Taste deaktivieren. Schalten Sie den Laser ein und nähern Sie sich der Probe mit dem Ausleger. Klicken Sie auf Scan starten, um Kraftabstandskurven zu sammeln.Analysieren Sie die erfassten Daten mit der Open-Source-Software AtomicJ. Laden Sie die Kraftkurven in das Programm, indem Sie auf das Symbol Prozesskraftkurven und Kennfelder klicken. Fügen Sie dann im Bearbeitungsassistenten die zu analysierenden Karten hinzu, indem Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen klicken.Nachdem die Karten geladen sind, klicken Sie auf Weiter. Geben Sie die Verarbeitungseinstellungen im nächsten Fenster an. Um den Kontaktpunkt zwischen der Probe und dem Ausleger automatisch anhand eines Satzes von Passkurvenparametern zu schätzen, verwenden Sie die automatische Schätzung des Kontaktpunktes.Bestimmen Sie den Kontaktpunkt zwischen dem Cantilever und der Probe nach der klassischen fokussierten Rastermethode. Wählen Sie die Schätzmethode als modellunabhängige Methode, um die beste Bestimmung des Kontaktpunktes basierend auf der Qualität der gemessenen Kraftkurven zu erhalten, die bei der Optimierung der Datenanalyse empirisch ermittelt werden muss. Passen Sie die Krafteindringkurve mit einem klassischen Modell als klassisches L zwei für die Modellanpassung an.Stellen Sie die Anpassung des Modells an die Entnahmekurve ein. Stellen Sie das Poisson-Verhältnis auf 0,45 ein, wie für Weichteile wie die Leber empfohlen. Legen Sie die Anpassung der Kurve mit einem Basisliniengrad von drei und einem Kontaktgrad von eins fest.Ändern Sie den Grad der Polynomanpassung basierend auf der Skala der Abweichungen der Kurven vom Modell. Wählen Sie als Sneddon-Modell das Modell aus, das für die Rücknahmekurven verwendet wird. Füllen Sie den Radius der kugelförmigen Spitze auf 2,9 Mikrometer aus.Laden Sie die Federkonstante und invOLS aus den Datendateien, indem Sie das Einlesen aktivieren, und klicken Sie dann auf Fertig stellen. Gehen Sie nach der Datenanalyse die Kraftkurven durch. Schließen Sie die Kraftkurven aus, bei denen sich der Ausleger der Oberfläche des Leberabschnitts falsch näherte.Diese Kurven haben hohes Rauschen und abweichende Formen. Danach können die Daten kopiert oder exportiert werden. In dieser Studie wurden leicht fixierte Leberabschnitte, die von den Kontrollmäusen und Mäusen mit leichter und fortgeschrittener Fibrose erhalten wurden, die durch die Injektion von Tetrachlorkohlenstoff induziert wurden, mit AFM untersucht.Bereiche in der Nähe der zentralen Venen, die den Bereichen entsprechen, in denen sich normalerweise Kollagenfasern in Tetrachlorkohlenstoffmäusen bilden, wurden in Kontrolllebern analysiert. Die Verteilung der Young-Module war über verschiedene Regionen in Kontrolllebern und kollagenreichen Bereichen innerhalb eines einzigen Leberabschnitts reproduzierbar. In mit Tetrachlorkohlenstoff behandelten Mäusen zeigten Steifigkeitskarten, die den perizentralen Bereichen von Kollagenablagerungen entsprechen, signifikant höhere Werte der Young-Moduli im Vergleich zu äquivalenten Bereichen bei Kontrollmäusen.Darüber hinaus gab es einen signifikanten Anstieg der Werte der Young-Module bei längerer Behandlung. Die Wirkung einer längeren Lagerung von Leberabschnitten auf die mechanischen Eigenschaften von Kollagenfasern wurde ebenfalls bewertet. AFM-Messungen zeigten signifikant niedrigere Werte der Young-Module in kollagenreichen Bereichen für Abschnitte, die drei Monate gelagert wurden, verglichen mit denen, die innerhalb von zwei Wochen erhalten wurden.Der Zeitpunkt der Fixierung des Leberabschnitts bestimmt stark die mechanischen Eigenschaften des Leberabschnitts. Wir empfehlen, dass die im Protokoll angegebenen Zeitintervalle strikt eingehalten werden müssen. Nach bestimmten Optimierungen im Protokoll kann die angegebene Methode für alle Weichteile verwendet werden, die eine signifikante Kollagenablagerung aufweisen, die durch Polarisationsmikroskopie nachweisbar ist.Die gegebene Technik bietet den Forschern ein einheitliches und bequemes Protokoll, um den Mechanismus der Leber über gesunde und Krankheit zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Biology

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