Name: measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי סוכנות המענקים של הרפובליקה הצ'כית (18-02699S), פרויקט המחקר המוסדי של האקדמיה הצ'כית למדעים (RVO 68378050), ופרויקט MEYS CR NICR EXCELES (LX22NPO05102). CIISB, מרכז הדרכה-CZ של קונסורציום הוראה-ERIC האיחוד האירופי, במימון פרויקט התשתית MEYS CR LM2018127 והקרן האירופית לפיתוח אזורי-פרויקט "UP CIISB" (לא. CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) תמך כספית במדידות בננו-ביוטכנולוגיה של CF, CEITEC MU. אנו מכירים גם במתקן הליבה של מיקרוסקופיית אור, IMG CAS, פראג, צ'כיה, הנתמך על ידי MEYS (LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) ו- RVO: 68378050-KAV-NPUI, על תמיכתם בהדמיית המיקרוסקופיה המוצגת כאן.

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

הפרוטוקול המוצג מספק שיטה הניתנת לשחזור שלב אחר שלב למדידת AFM של רקמת כבד עכבר רגילה ופיברוטית. מיקרוסקופיית קיטוב מצומדת מספקת דיוק מרחבי גבוה ומאפשרת הדמיה של סיבי קולגן בשל השבירה הדו-צדדית שלהם. יתר על כן, תיאור מפורט של ניתוח עקומות הכוח המתקבל מסופק. מדידת נוקשות AFM יכולה להתבצע ברמה התאית, מה שמאפשר לעקוב אחר שינויים מקומיים בתכונות המכניות של רקמת הכבד עקב התפתחות מחלה פיברוטית. פיברוזיס בכבד אינו תהליך הומוגני המשפיע על האיבר כולו. להיפך, אזורים של ספטה פיברוטית עשירה בקולגן משולבים עם אזורים של משקעי קולגן נמוכים או ללא קולגן כלל. לפיכך, שינויים בנוקשות הם ספציפיים למיקרו-סביבה המקומית ומשפיעים רק על תאים הנמצאים במגע מקומי עם אזורים שנפגעו מפציעה. ההטרוגניות הזעירה הזו ניכרת גם בפרטים של מפות המודולוס של AFM Young, שבהן נקודות של קשיחות גבוהה גובלות באזורים של קשיחות כמעט נורמלית. השונות הזו מראה שאפילו אזור רקמת צלקת הקולגן אינו הומוגני מבחינה מכנית ודורש מדידת AFM כדי לאפיין אותה ברמה התאית (איור 4).
הפרוטוקול המוצג מאפשר מדידות של נוקשות הכבד על ידי AFM ללא תלות באוסף הכבד, שכן ניתן לאחסן את כל אונות הכבד המוטבעות ב- OCT לתקופה ממושכת ב- −80 מעלות צלזיוס. עם זאת, לאחר ניתוח הרקמה, אנו ממליצים למדוד את הדגימות תוך ~2 שבועות, שכן ראינו ריכוך הדרגתי של מקטעי רקמה המאוחסנים לפרקי זמן ארוכים יותר (איור 5).
ה-AFM המצויד במיקרוסקופיית קיטוב מאפשר איתור מדויק של אזור העניין בתוך מבנה אונות הכבד. עם זאת, יש לו גם כמה מגבלות שיש לקחת בחשבון בעת פירוש התוצאות. ערכי הנוקשות שהתקבלו כאן נמדדו בטמפרטורת החדר. אנו מניחים כי ההשפעות של הטמפרטורה על התכונות המכניות של רקמות רכות יהיה קטן; עם זאת, זו עשויה להיות אחת הסיבות להבדלים בין ערכי in vivo המדווחים של תכונות מכניות של רקמות כבד לבין הערכים במחקר זה.
יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר ניתוח AFM של רקמת הכבד עד 3 שעות, אשר דורש קיבוע קל של הרקמה. הקיבוע המתון של מקטעי הרקמות, כמו גם מחזור ההפשרה, ישפיעו ככל הנראה על הערכים המוחלטים של המודולוס של יאנג. לפיכך, הערכים המדווחים של המודולי של יאנג עשויים להיות שונים מערכי in vivo . מחקרים נוספים נדרשים כדי לייעל את הפרוטוקול למדידת ערכים מוחלטים של מודולוס יאנג מקטעי כבד, אשר עשוי להיות מושגת על ידי שיטה אחרת לקיבוע של רקמת הכבד64.
עם זאת, ראינו נוקשות גוברת של אזורים עשירים בקולגן בכבדים של עכברים שטופלו ב-CCl4 במשך 3 שבועות, בהשוואה ל-6 שבועות. שינויים כאלה תואמים את התקדמות הפיברוזיס במהלך פציעה ממושכת (איור 4) ומראים שניתן לחקור הבדלים יחסיים בין טיפולים שונים באמצעות הפרוטוקול המוצג. זה עולה בקנה אחד עם התצפיות של Calò et al., שהראו כי מקטעי כבד קבועים קלות מראים הבדלים דומים בערכי הנוקשות בין אזורים עשירים בקולגן וחסרי קולגן כמו ברקמה טרייה25.
השתמשנו ב-SD-qp-BioT-TL-10 cantilever (קבוע קפיץ תיאורטי ~0.09 N/m) ששונה עם קצה כדורי בקוטר 5.7 מיקרומטר כדי למזער את ההפרעה המכנית של רקמת הכבד במהלך המדידות. חרוז של 5.7 מיקרומטר איפשר כניסה מספקת של הדגימה כדי לבדוק את קשיחותה תוך שמירה על שלמותה. חרוז בקוטר קטן יותר יכול לשמש, לאחר מספר אופטימיזציות, לקבלת רזולוציה גבוהה יותר במפות הנוקשות, אך עלול להוביל להערכת יתר נוספת של ערכי המודולוס של יאנג (לפרטים נוספים, ראו Crichton et al.65). באמצעות אנסמבל החרוזים שצוין, הצלחנו לאפיין את קשיחות הדגימה בטווח רחב, מעשרות יחידות של Pa ועד ~ 100 kPa.
המודל של סנדון שימש לגזירת המודולוס של יאנג מעקומות כוח, שכן הוא מאפשר ניתוח של כניסות עמוקות עם גשושיות קולואידיות62. המודל של סנדון, בניגוד למודל של הרץ, אינו סובל מהאילוץ שרדיוס המגע חייב להיות קטן בהרבה מרדיוס הכדור. עוד הוא מניח כי עובי הדגימה גדול פי כמה מעומק הכניסה30,66. במחקר הנוכחי, הכניסה הייתה ~2 מיקרומטר עם גודל חרוז של 5.7 מיקרומטר ועובי דגימה של 30 מיקרומטר באזורים עשירים בקולגן; לפיכך, המודל של סנדון היה מתאים. מודלים אחרים63 בהתחשב בכוח ההידבקות בין קצה למצע יכולים לשמש לסוגים שונים של רקמות.
אנליזה ב-AtomicJ מיישמת תיקונים לעובי הסופי של הדגימות כדי למזער את תרומתו של מצע תוך הפקת מודולוס62,67 של יאנג. בניתוח עקומות הכוח המתקבלות, השתמשנו ביחס פואסון יחיד של 0.45, אשר הומלץ בעבר לאיברי רקמות רכות24. לקירוב זה אין השפעה משמעותית על הערכים המחושבים של המודולוס של יאנג, שכן השינוי בערך היחס של פואסון מ-0.4 ל-0.5 גורם רק לירידה של פי 0.893 בערכי המודולוס של יאנג המחושבים על פי משוואת סנדון. בהתחשב בהבדלים הרבים במודולוס של יאנג בין משכי הזמן השונים של טיפולי CCl4, השגיאות הנוצרות על ידי קירוב היחס של פואסון הן שוליות בלבד.
השתמשנו בעקומות משיכה כדי לחשב ערכי קשיחות, מכיוון שהתעניינו בתגובה האלסטית של הרקמה לעומס שמספק הקנטילבר ולא בתגובה הפלסטית לכניסה68. בשל התגובה הוויסקואלסטית של הרקמה הרכה, עקומות נסיגה מתאימות עשויות להעריך יתר על המידה את המודולוס של יאנג, שיש לזכור זאת. יתר על כן, ראינו שניתוח נתונים עם עקומי גישה מניב מגמות דומות בערכי הנוקשות בין אזורים פיברוטיים לאזורי בקרה, אם כי הערכים האבסולוטיים נמוכים יותר בהתאמה (הנתונים לא מוצגים).
תוך כדי אופטימיזציה של הפרוטוקול, זיהינו מספר שלבים קריטיים לשחזור המדידות. ראשית, חשוב לוודא שהחרוז נמצא בערך במרכז הקצה השקוף בזמן ההצמדה לקנטילבר. זה מונע חוסר איזון מכני אפשרי במהלך הכניסה. שנית, במהלך קיבוע הכבד עם PFA, יש צורך להקפיד על מגבלות הזמן להפשרה וקיבוע. שינוי התזמון של שלב זה עלול להשפיע קשות על התכונות המכניות של מקטעי רקמות. שלישית, יש לכייל את הקנטיליבר שוב ושוב עם ניטור רציף וקלט של ערכי טמפרטורה בו-זמניים כדי למנוע ממצאים המתרחשים בערכי קשיחות עקב תנודות טמפרטורה. לבסוף, אין למדוד חתך כבד יחיד במשך יותר מ-3 שעות מההכנה, שכן PBS שכבת-על עלולה להתאדות על פני תקופות ארוכות יותר. הקוראים יכולים לעיין בטבלת פתרון הבעיות (טבלה 3) לפתרון בעיות שנתקלו בהן במהלך מדידת AFM, שגם היא נדונה בהרחבה ב- Norman et al.46.
טבלה 3: מדריך לפתרון בעיות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%203v2.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
הפרוטוקול המוצג מאפשר בדיקת AFM ניתנת לשחזור של רקמת הכבד. יש לו פוטנציאל לחשוף מידע על התפתחות ורגרסיה בסופו של דבר של מחלת כבד פיברוטית ברמה מיקרוסקופית והוא יכול לתרום לפיתוח טיפולים המכוונים לאזורי צלקת פיברוטיים שנוצרו במהלך התקדמות מחלת כבד כרונית.

הכבד הוא איבר חיוני לשמירה על הומאוסטזיס באורגניזמים 1,2. מחלות כבד כרוניות אחראיות ל~2 מיליון מקרי מוות ברחבי העולםמדי שנה 3. מקורם הנפוץ ביותר כזיהומים ויראליים, הפרעות אוטואימוניות, תסמונות מטבוליות או מחלות הקשורות לשימוש באלכוהול והם מלווים בפיברוזיס כבד מתקדם. פגיעה בכבד מעוררת תגובה דלקתית, מה שמוביל להפעלת תאים המפקידים מטריצה חוץ-תאית (ECM) בתגובה לריפוי פצעים. עם זאת, בנוכחות עלבון כרוני, עודף ECM יוצר רקמת צלקת לא פתורה בתוך הכבד, המוביל להתפתחות של פיברוזיס הכבד, שחמת הכבד, קרצינומה בכבד, ובסופו של דבר, לאי ספיקת כבד4.
פגיעה בהפטוציטים גורמת באופן מיידי לנוקשות מוגברת בכבד 5,6. זה משפיע ישירות על תפקוד הפטוציטים, מפעיל תאים סטלטים בכבד (HSCs) ופיברובלסטים פורטליים, וגורם לטרנס-דיפרנציאציה שלהם למיופיברובלסטים המכילים קולגן 7,8. התצהיר של ECM סיבי מגביר עוד יותר את נוקשות הכבד, ויוצר לולאת משוב המגבירה את עצמה של התקשות הכבד והפעלת תאים המייצרים מטריצה.
נוקשות הכבד הפכה, אם כן, לפרמטר חשוב בפרוגנוזה של מחלות כבד. את השינוי בתכונות הרקמה הביומכנית ניתן לזהות מוקדם יותר מאשר פיברוזיס ניתן לאבחן על ידי ניתוח היסטולוגי. לכן, טכניקות שונות למדידת נוקשות בכבד פותחו הן ביישומים מחקריים והן ביישומים קליניים. במסגרות קליניות, אלסטוגרפיה חולפת (TE)9,10,11,12,13 ואלסטוגרפיה של תהודה מגנטית (MRE)14,15,16,17,18 שימשו לאבחון לא פולשני של שלבים מוקדמים של נזק לכבד על ידי בדיקת נוקשות כבד גולמית 19.
ב- TE, גלי אולטרסאונד בעלי משרעת קלה ותדר נמוך (50 הרץ) מופצים דרך הכבד, ומהירותם נמדדת, המשמשת לאחר מכן לחישוב מודולוס אלסטי רקמה13. עם זאת, טכניקה זו אינה שימושית עבור חולים עם מיימת, השמנת יתר, או חללים intercostal נמוך יותר עקב שידור לא תקין של גלי אולטרסאונד דרך הרקמות המקיפות את הכבד9.
MRE מבוסס על שיטות הדמיה בתהודה מגנטית ומשתמש בגלי גזירה מכניים של 20-200 הרץ כדי לכוון לכבד. לאחר מכן נעשה שימוש ברצף הדמיה מסוים של תהודה מגנטית כדי לעקוב אחר הגלים בתוך הרקמה ולחשב את נוקשות הרקמה16. ערכי הנוקשות שדווחו בטכניקות TE ו-MRE מתואמים היטב עם מידת הפיברוזיס בכבד המתקבלת מביופסיות של דגימות כבד אנושיות המדורגות באמצעות ציוני METAVIR היסטולוגיים20 (טבלה 1). TE ו- MRE הותאמו גם למדידת נוקשות הכבד במודלים של מכרסמים למטרות מחקר21,22,23. עם זאת, מכיוון ששתי השיטות שואבות את ערכי הנוקשות מתגובת הרקמה לגלי הגזירה המתרבים, ייתכן שהערכים המתקבלים אינם משקפים את הנוקשות המכנית המוחלטת של הרקמה.
לצורך אפיון מכני ישיר של כבדי מכרסמים, פיתחו בארנס ואחרים בדיקת מודל-ג'ל-רקמה (בדיקת MGT) הכוללת הטבעה של רקמת כבד בג'ל פוליאקרילאמיד24. ג'ל זה נדחס על ידי כוח אחיד פועם שממנו ניתן לחשב את המודולוס של יאנג. בדיקת MGT מראה מתאם טוב עם בדיקת כניסה המותאמת לכבד רגיל ופיברוטי24 (טבלה 1).
טבלה 1: ערכי נוקשות הכבד ברמת התפזורת. TE ו- MRE בהשוואה למדידות מכניות ex vivo ישירות של מודולי אלסטי בכבד באמצעות הזחה ומבחני MGT עבור כבדים ממקורות שונים. היחס בין E ל-G נתון על ידי E = 2G (1 + v), כאשר v הוא היחס של פואסון למדגם; F0 עד F4 מייצגים את ניקוד הפיברוזיס במערכת הניקוד METAVIR, כאשר F0 מציין פיברוזיס נמוך או ללא כבד וכבד צ'ירוטי F4. קיצורים: TE = אלסטוגרפיה חולפת; MRE = אלסטוגרפיה של תהודה מגנטית; MGT = מודל-ג'ל-רקמה; E = מודולוס אלסטי (של יאנג); G = מודולוס גזירה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%201v2.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
אחד החסרונות העיקריים של מדידות נוקשות כבד גנריות הוא שהן אינן מספקות רזולוציה ברמת התא של הטרוגניות הנוקשות בכבד. במהלך התקדמות הפיברוזיס, אזורים עשירים בקולגן מראים קשיחות גבוהה יותר בהשוואה לפרנכימה25,26 שמסביב. שיפוע נוקשות זה משפיע באופן מקומי על התאים התושבים וממלא תפקיד חשוב בהנעת הטרוגניות HSC27. לפיכך, שינויים בתכונות המכניות המקומיות במהלך התפתחות מחלות כבד צריכים להיות מאופיינים ברמה מיקרוסקופית כדי להבין טוב יותר את התקדמות הפיברוזיס.
AFM מאפשר למדוד את התכונות המכניות של הרקמה ברזולוציה גבוהה וברגישות כוח גבוהה. AFM משתמש בקצה של קנטילבר כדי להסיט פנימה את פני השטח של דגימה עם כוחות נמוכים כמו כמה פיקונוויטונים, מה שגורם לעיוות ברמה מיקרוסקופית או ננוסקופית בהתבסס על הגיאומטריה והגודל של הקצה שבו נעשה שימוש. תגובת הכוח של הדגימה לזן המופעל נמדדת לאחר מכן כסטייה בקנטילבר28. עקומות תזוזה בכוח נאספות מהגישה והנסיגה של הקנטילבר, אשר ניתן להתאים מודלים מתאימים של מכניקת מגע כדי להעריך את הנוקשות המקומית של הדגימה29.
בנוסף למדידת הנוקשות של אזור נתון, AFM יכול גם לספק מידע טופוגרפי על תכונות ספציפיות בדגימה, כגון המבנה של סיבי קולגן30,31,32. מחקרים רבים תיארו את היישום של AFM למדידת הנוקשות של רקמות בריאות וחולות שונות, כגון עור 32,33, ריאה 34,35, מוח36, יונק37,38,39, סחוס 40, או לב41,42,43,44 מדגימות מודל של מטופלים ועכברים. יתר על כן, AFM שימש גם במבחנה כדי לקבוע את הנוקשות של תאים ופיגומי חלבון חוץ-תאיים45,46,47.
מדידת התכונות המכניות של דגימות ביולוגיות באמצעות AFM אינה טריוויאלית בשל רכותן ושבריריותן. לפיכך, מחקרים שונים תיקנו תנאים והגדרות שונות, אשר מניבים ערכים משתנים באופן נרחב של מודולי יאנג (שנסקרו על ידי Mckee et al.48). בדומה לרקמות רכות אחרות, גם ערכי המודולוס של הכבד יאנג בדרגות שונות של פיברוזיס בכבד מראים שונות רבה (טבלה 2). ההבדלים בערכי המודולוס של יאנג נובעים מהבדלים באופן פעולת AFM, קצה קנטילבר, שיטת הכנת הדגימה, עובי הדגימה, עומק וכוחות הכניסה, סביבת רקמת הכבד במהלך המדידה ושיטת הניתוח (טבלה 2).
טבלה 2: ערכי נוקשות הכבד ברמה התאית. ערכי קשיחות הכבד המתקבלים באמצעות AFM מתארים את התכונות המכניות של הכבד ברמה התאית. קיצורים: AFM = מיקרוסקופיה של כוח אטומי; E = מודולוס אלסטי (של יאנג); PFA = פרפורמלדהיד; PBS = מלח חצוב פוספט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%202v2.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
מאמר זה מתאר פרוטוקול למדידה ניתנת לשחזור של מודולי יאנג של אזורים פיברוטיים עשירים בקולגן ברקמת הכבד על ידי AFM עם לוקליזציה מדויקת המסופקת על ידי שימוש במיקרוסקופיית קיטוב. נתנו פחמן טטרה-כלוריד (CCl 4) כדי לגרום לתצהיר קולגן באופן צנטרילובולרי49 במודל עכבר, תוך חיקוי אמין של היבטים חיוניים של פיברוזיס כבד אנושי50. תמונות מיקרוסקופיות מקוטבות מאפשרות הדמיה של קולגן בכבד עקב השבירה הדו-פרצופית של סיבי הקולגן51, המאפשרת מיקום מדויק של קצה הקנטילבר מעל אזור העניין הרצוי בתוך אונת הכבד52.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >AFM head</td>
			<td >Bruker</td>
			<td >JPK nanowizard 3</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cameras</td>
			<td >Andor</td>
			<td >Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >The Imagingsource&#160;</td>
			<td >S/N:12310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cantilever</td>
			<td >SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors</td>
			<td>S/N:73750F05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryotome</td>
			<td >Leica&#160;</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epoxy resin glue (Long working time )</td>
			<td >Bison epoxy universal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Melamine beads; diameter, 5.7 um</td>
			<td >Microparticles, GmbH</td>
			<td>MF-R-5.7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td>&#160;IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrophobic&#160; slide marker</td>
			<td >SuperHT</td>
			<td>PAP PEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td >JPK nanowizard&#160; v6.1.151</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >AtomicJ v2.3.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost slides</td>
			<td >Thermoscientific</td>
			<td>ref no. J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >System</td>
			<td >Ubuntu 14.04.5 LTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibration isolation control unit</td>
			<td >Tablestable</td>
			<td>AVI-200-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy

התקשות מטריקס הוכרה כאחד המניעים העיקריים להתקדמות פיברוזיס בכבד. יש לו השפעות עמוקות על היבטים שונים של התנהגות התא, כגון תפקוד התא, התמיינות ותנועתיות. עם זאת, מכיוון שתהליכים אלה אינם הומוגניים בכל האיבר, חשוב יותר ויותר להבין את השינויים בתכונות המכניות של הרקמות ברמה התאית.
כדי להיות מסוגל לעקוב אחר התקשות של אזורים עשירים בקולגן בתוך אונות הכבד, מאמר זה מציג פרוטוקול למדידת מודולי אלסטיות של רקמת הכבד בדיוק מרחבי גבוה על ידי מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM). AFM היא שיטה רגישה בעלת פוטנציאל לאפיין תכונות מכניות מקומיות, המחושבת כמודולוס של יאנג (המכונה גם אלסטי). AFM בשילוב עם מיקרוסקופיית קיטוב יכולים לשמש לאיתור ספציפי של אזורי התפתחות פיברוזיס בהתבסס על השבירה הדו-שבירה של סיבי קולגן ברקמות. באמצעות הפרוטוקול המוצג, אפיינו את הנוקשות של אזורים עשירים בקולגן מכבדי עכברים פיברוטיים ואזורים מקבילים בכבדים של עכברי בקרה.
עלייה בולטת בנוקשות של אזורים חיוביים לקולגן נצפתה עם התפתחות פיברוזיס. הפרוטוקול המוצג מאפשר שיטה ניתנת לשחזור של מדידת AFM, בשל השימוש ברקמת כבד קבועה קלות, שניתן להשתמש בה כדי לקדם את ההבנה של שינויים יזומים של מחלות בתכונות מכניות של רקמות מקומיות והשפעתם על גורלם של תאים שכנים.

מקטעי כבד בעובי 30 מיקרומטר קבועים קלות, שהתקבלו מעכברי בקרה ומעכברים עם פיברוזיס קל או מתקדם (המושרה על ידי הזרקה של CCl4 במשך 3 שבועות או 6 שבועות,בהתאמה 49) נבדקו עם AFM כמתואר בפרוטוקול זה. סיבי קולגן הקרובים לוורידים מרכזיים נבחרו למדידת מפות קשיחות. אזורים קרובים לוורידים המרכזיים, שמתאימים לאזורים שבהם נוצרים בדרך כלל סיבי קולגן בחיות שטופלו ב-CCl4, נותחו בכבדי בקרה (איור 4A). התפלגות המודולי של יאנג הייתה ניתנת לשחזור על פני כבדי בקרה שונים ואזורים עשירים בקולגן בתוך מקטע כבד יחיד (איור 4B: עלילת כינור שמאלי).
בבעלי חיים שטופלו ב-CCl 4, מפות נוקשות המתאימות לאזורים הפריצנטריים של מרבצי קולגן הראו ערכים גבוהים יותר באופן משמעותי של מודולי יאנג בהשוואה לאזורים מקבילים בעכברי בקרה (איור 4B: 1.9 kPa לעומת 2.6 kPa ערכי המודולוס החציוניים של יאנג לבקרה לעומת 3 שבועות CCl 4 שטופלו בעכבר 4; p = 0.07; 1.9 kPa לעומת 5.1 kPa ערכי המודולוס החציוניים של יאנג לבקרה לעומת 6 שבועות CCl4 -עכבר מטופל; p = 0.02). יתר על כן, חלה עלייה משמעותית בערכי המודולי של יאנג עם טיפול CCl 4 ארוך יותר (איור 4B; 2.6 kPa לעומת 5.1 kPa ערכי המודולוס החציוניים של יאנג למשך 3 שבועות לעומת 6 שבועות CCl4 שטופלו בעכבר 4; p = 0.04). זה מראה התקשות הדרגתית של משקעי קולגן עם התקדמות פיברוזיס וכי מדידות AFM משקפות את הפיברוגנזה.
כדי להעריך את ההשפעה של אחסון ממושך של מקטעי כבד משובצים ב-OCT על התכונות המכניות של סיבי קולגן, מדדנו את הנוקשות של סיבי קולגן במקטעים של עכברים שטופלו ב-CCl4, שאוחסנו בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס במשך שבועיים או שלושה חודשים במגלשה לאחר החיתוך (איור 5). מדידות AFM הראו ערכים נמוכים משמעותית של מודולי יאנג באזורים עשירים בקולגן עבור מקטעים שאוחסנו במשך 3 חודשים בהשוואה לאלה שהתקבלו ממקטעים שנמדדו תוך שבועיים מחיתוך הדגימה (איור 5; 4.7 kPa לעומת ערכי מודולוס חציוניים של יאנג למשך 3.6 kPa במשך שבועיים לעומת 3 חודשי אחסון; p < 0.001). לכן, חשוב למדוד את התכונות המכניות של רקמת הכבד זמן קצר לאחר שהקטעים מוכנים מאונות הכבד המשובצות ב- OCT.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig04.jpg"> איור 4: מדידות AFM חושפות התקשות הדרגתית של אזורים עשירים בקולגן בקורלציה עם טיפול ממושך ב-CCl4. (A) מקטעי כבד מעכברי בקרה ועכברים שטופלו ב-CCl4 במשך 3 שבועות או 6 שבועות שימשו למדידת התכונות המכניות של אזורים עשירים בקולגן. האזורים הדחוסים של מקטעי הכבד המוצגים בתמונות המיקרוסקופיה המקוטבת (משמאל) הם אזורי סריקה עשירים בקולגן (או אזורים מקבילים בכבד הבקרה) שנבחרו למדידות AFM (30 מיקרומטר x 100 מיקרומטר, 10 פיקסלים x 36 פיקסלים). מפות המודולוס של יאנג עם קני מידה צבעוניים המתאימים לאזורים אלה מוצגות מימין, כולל היסטוגרמות של ערכי המודולוס של יאנג ממפות אלה; תרשימי פיזור משובצים מציגים ערכים >10 kPa עבור כל תנאי. התקשות הכבד מתוארת כתזוזה הדרגתית ימינה בהתפלגות ההיסטוגרמה ותדירות גבוהה יותר של נקודות בעלילת הפיזור המשובצת. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (B) עלילות כינור מציגות את התפלגות המודולים האלסטיים משלושה אזורים שנמדדו עבור כל תנאי (משמאל) וסיכמו ערכי מודולי אלסטיים מכל שלוש המפות (מימין). עלילות כינור מציגות את החציון (קו אדום), אחוזון25 ואחוזון 75 (קווים שחורים); נקודות מייצגות את הערכים הממוצעים של מפות בודדות מאזורים 1-3. ערכי ה-p המוצגים חושבו באמצעות מבחן t של סטודנט שבוצע באמצעים. קיצורים: AFM = מיקרוסקופיה של כוח אטומי; CCl4 = פחמן טטרה-כלוריד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig05.jpg"> איור 5: אחסון מורחב של מקטעי כבד מוביל לירידה בנוקשות של אזורים עשירים בקולגן. מקטעי כבד (שהוכנו מעכברים שטופלו ב-CCl 4 במשך שבועיים) שאוחסנו בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס במשך שבועיים או 3 חודשים שימשו למדידת המודולוס של יאנג. תמונות מיקרוסקופיה מקוטבות (משמאל) עם תיבות המציינות את האזורים העשירים בקולגן המשמשים למדידת AFM (30 μm x 100 μm, 10 פיקסלים x 36 פיקסלים). מפות מודולוס תואמות של יאנג עם סולמות צבעים (מימין). היסטוגרמות מראות את ערכי המודולוס של יאנג שנאספו מ-4-6 אזורים בכל דגימה; תרשימי פיזור משובצים מציגים ערכים >10 kPa עבור כל תנאי. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: AFM = מיקרוסקופיה של כוח אטומי; CCl4 = פחמן טטרה-כלוריד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
איור משלים S1: שיטה לשינוי הקנטילבר עם מיקרו חרוז שרף מלמין. (A) שרטוט סכמטי ממחיש את החיבור של חרוז כדורי לקצה הקנטילבר. לקבלת תיאור חכם, ראה סעיף 2, חלק 1, צירוף חרוז בגודל 5.7 מיקרומטר לקצה המעטפת של AFM. (B) תמונת מיקרוסקופיה של חרוז כדורי בקוטר 5.7 מיקרומטר המחובר לקצה הקנטילבר המוצג מלמעלה (משמאל) וממבט לרוחב (מימין). סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: AFM = מיקרוסקופיה של כוח אטומי; RT = טמפרטורת החדר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%201.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים S2: ניתוח נתונים ב- AtomicJ. (A) רצף הצעדים שיש לעקוב אחריהם לפתיחת מפות קשיחות ב- AtomicJ. לחיצה ימנית אחת על עקומות כוח התהליך והמפות (x) פותחת את עוזר העיבוד. ניתן לטעון קבצים לעוזר העיבוד על ידי לחיצה על הוסף (y) ובחירת הקבצים הנדרשים. לחץ על הבא (z) כדי להמשיך לשלב הבא. (B) פרמטרים להתאמת עקומות, דגם מכניקת מגע מתאים והגדרות AFM המשמשות במהלך המדידה. שלבים 1-11 מתייחסים לנקודות משנה מתאימות המפורטות בשלב 3 של הפרוטוקול, סעיף 5, ניתוח נתונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary_fig_2.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים S3: מתווה של נתונים מנותחים ב- AtomicJ. התצוגה המקדימה של הנתונים שנותחו מציגה מפות קשיחות (חלון שמאלי עליון), עקומות כוח (חלון ימני עליון) ונתונים גולמיים (חלון תחתון). קיצור: AFM = מיקרוסקופיה של כוח אטומי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%203.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy at JoVE.com

Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

אנו מציגים פרוטוקול למדידת המודולי האלסטי של אזורים עשירים בקולגן בכבד רגיל וחולה באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי. השימוש בו זמנית במיקרוסקופיית קיטוב מספק דיוק מרחבי גבוה ללוקליזציה של אזורים עשירים בקולגן במקטעי הכבד.

מדידת נוקשות הכבד באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי בשילוב עם מיקרוסקופיית קיטוב

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

הפרוטוקול שלנו מספק הבחנה בין אזורים עשירים בקולגן לבין אזורים חסרי קולגן במקטעי הכבד. לכן ניתן להשתמש בו כדי ללמוד את תהליכי הפיברוגנזה בפרטים הגדולים יותר. היתרון העיקרי של הטכניקה טמון בשימוש במיקרוסקופיה מקטבת לאיתור אזורים עשירים בקולגן במקטעי הכבד.הפרוטוקולים שלנו יכולים לספק תובנות נהדרות על התפתחות פיברוזיס בכבד, וניתן לאמץ אותו גם עבור רקמות רכות אחרות כגון ריאות לאחר אופטימיזציות מסוימות. כדי להתחיל, להסיר את קטעי הכבד קפוא מינוס 80 מעלות צלזיוס, ולהפשיר אותם בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות. לתקן את החלקים עם קר כקרח 4% paraformaldehyde ב PBS במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לשטוף חמש פעמים עם PBS.לאחר הכביסה האחרונה, נגבו את עודפי ה-PBS סביב מקטע הכבד באמצעות רקמה, וסמנו גבול של כשניים על ארבעה סנטימטרים סביב מקטע הכבד באמצעות עט טוש הידרופובי. כסה את הדגימה באמצעות PBS, ולאחר מכן טען את הדגימה על במת ה- AFM וכסה אותה בראש ה- AFM. במיקרוסקופיה של הכוח האטומי או בתוכנת AFM, עבור אל הכרטיסייה הגדרה וסמן סמן על שמירה אוטומטית כדי לשמור באופן אוטומטי את כל הקבצים.לאחר מכן ציין את שם הקובץ והספרייה לשמירת קובצי המדידה על ידי מעבר לכרטיסייה הגדרה ולחיצה על הגדרות שמירה. התקרב למשטח הרקמה עם משטח ה- AFM על ידי הפעלת הלייזר ולחיצה על מקש הגישה. לאחר השלמת הגישה, חזור על קצה הקנטילבר על ידי לחיצה אחת על מקש הנסיגה, אשר מחזיר את הקנטילבר לקצה העליון של טווח הפיאזו.במידת הצורך, יישרו מחדש את הגלאי באמצעות ידיות בראש ה-AFM. כבה את הלייזר. הטיפ נמצא כעת במוקד המטרה.לאחר מכן, שכב את השדה האופטי של המיקרוסקופ במפות מדידה של AFM על ידי לחיצה על לשונית האביזרים ובחירת כיול אופטי ישיר של שכבת-על. בחלון המצליח, לחץ על הבא כדי לצלם סדרה של תמונות של הקנטילבר הסורק אזור מסוים. לחץ שוב על הבא כדי לעבור לחלון הבא.בתמונה הראשונה, לחץ על מרכז קצה הקנטילבר באופן ידני כדי לתאר את מיקום הקצה בתוכנה. ניתן לשנות את העיגול המתאר את מיקום הקצה בגודלו על ידי ציון הרדיוס שלו כדי להגדיל את הדיוק. לחץ על כיול כדי לזהות באופן אוטומטי את מיקום קצה הכנף בכל התמונות.אשר את הדיוק של זיהוי עצות על-ידי מעבר על התמונות. לחץ על הבא ולאחר מכן סיים כדי לסיים את השכבה האופטית. לאחר מכן, הזז את הבמה כדי למקם אזור עשיר בקולגן בתוך הקופסה הירוקה, גלוי בכרטיסייה מציג הנתונים, באמצעות התמונה המקוטבת.בחר את האזור העשיר בקולגן על-ידי הגדרת האזור שמתחת לכרטיסיית הרשת ולאחר מכן יצירת מלבן בכרטיסיית מציג הנתונים באמצעות לחיצה ארוכה על לחצן העכבר השמאלי בתוך התיבה הירוקה שצוינה. לחצו על 'אשר אזור סריקה חדש' כדי להגדיר את האזור שנבחר כאזור מדידה. הגדר את הפרמטרים של לולאת המשוב.סט אני מרוויח ב-50 הרץ ורווח P ב-0.001. לאחר מכן הגדר את נקודת ההגדרה בננו ניוטון אחד. בחר את ערך הנקודה היחסית שנקבע בהתאם לתכונות המכניות של החומרים הנחקרים ולנוקשות הקנטילבר.ציין קו בסיס פשוט שיתאים כראוי לעקומות הכוח. לאחר מכן בחר את אורך תנועת הקנטילבר בציר Z בהתאם לטופוגרפיית פני השטח של הדגימה. הגדר את תנועת Z למשך זמן קבוע.הגדר את זמן ההארכה לשנייה אחת עם עיכובים בהארכה ובנסיגה כאפס. הגדר קצב דגימה ב 5, 000 הרץ. סמן סמן לפני לולאה סגורה Z כדי להתאים באופן אוטומטי את המרחק בין הדגימה לקצה הקנטילבר במהלך המדידות.לאחר מכן נתקו את בקרת הבמה הממונעת על ידי ביטול הבחירה בלחצן ההפעלה. הפעל את הלייזר והתקרב לדגימה עם ה- cantilever. לחץ על התחל סריקה כדי לאסוף עקומות מרחק כוח.נתח את הנתונים שנרכשו באמצעות תוכנת הקוד הפתוח AtomicJ. טען את עקומות הכוח לתוכנית על ידי לחיצה על עקומות כוח התהליך וסמל המפות. לאחר מכן במסייע העיבוד, הוסף את המפות לניתוח על ידי לחיצה על כפתור ההוספה.לאחר טעינת המפות, לחץ על הבא. ציין את הגדרות העיבוד בחלון הבא. כדי להעריך את נקודת המגע בין הדגימה לנקודת המגע באופן אוטומטי באמצעות קבוצה של פרמטרים של עקומה מתאימה, השתמש בהערכה האוטומטית של נקודת המגע.קבע את נקודת המגע בין הקנטילבר לדגימה בשיטת הרשת הממוקדת הקלאסית. בחר את שיטת ההערכה כשיטה הבלתי תלויה במודל כדי להניב את הקביעה הטובה ביותר של נקודת המגע בהתבסס על איכות עקומי הכוח הנמדדים, אשר צריכה להיקבע באופן אמפירי במהלך אופטימיזציה של ניתוח נתונים. התאם את עקומת כניסת הכוח באמצעות מודל קלאסי כ- L 2 קלאסי להתאמת המודל.הגדר את ההתאמה של המודל לעקומת הנסיגה. הגדר את היחס של פואסון כ- 0.45 כפי שמומלץ לרקמות רכות כגון הכבד. הגדר את ההתאמה של העקומה באמצעות דרגת בסיס של שלוש ודרגה במגע של אחת.שנה את מידת ההתאמה הפולינומית בהתבסס על סולם הסטיות של העקומות מהמודל. בחר את המודל המשמש להתאמת עקומות המשיכה כמודל Sneddon. ממלאים את רדיוס הקצה הכדורי ל-2.9 מיקרומטר.טען את קבוע הקפיץ ואת invOLS מקבצי הנתונים על ידי הפעלת קריאה, ולאחר מכן לחץ על סיום. לאחר ניתוח הנתונים, עבור דרך עקומות הכוח. אל תכלול את עקומות הכוח שבהן הכנף התקרבה אל פני השטח של קטע הכבד באופן שגוי.לקימורים אלה יש רעש גבוה וצורות חריגות. לאחר מכן, ניתן להעתיק או לייצא את הנתונים. במחקר זה, מקטעי כבד קבועים קלות שהתקבלו מעכברי הביקורת ומעכברים עם פיברוזיס קל ומתקדם המושרה על ידי הזרקת פחמן טטרה-כלוריד נחקרו עם AFM.אזורים הקרובים לוורידים המרכזיים המתאימים לאזורים שבהם נוצרים בדרך כלל סיבי קולגן בעכברי פחמן טטרה-כלוריד נותחו בכבדי בקרה. התפלגות המודולי של יאנג הייתה ניתנת לשחזור על פני אזורים שונים בכבדי בקרה ובאזורים עשירים בקולגן בתוך מקטע כבד יחיד. בעכברים שטופלו בפחמן טטרה-כלוריד, מפות קשיחות המתאימות לאזורים הפריצנטריים של מרבצי קולגן הראו ערכים גבוהים משמעותית של מודולי יאנג בהשוואה לאזורים מקבילים בעכברי בקרה.יתר על כן, חלה עלייה משמעותית בערכים של מודולי יאנג עם טיפול ארוך יותר. כמו כן הוערכה ההשפעה של אחסון ממושך של מקטעי כבד על התכונות המכניות של סיבי הקולגן. מדידות AFM הראו ערכים נמוכים משמעותית של מודולי יאנג באזורים עשירים בקולגן עבור מקטעים שאוחסנו במשך שלושה חודשים, בהשוואה לאלה שהתקבלו תוך שבועיים.זמן הקיבוע של סעיף הכבד קובע מאוד את התכונות המכניות של קטע הכבד. אנו ממליצים שיש להקפיד על מרווחים מתוזמנים המצוינים בפרוטוקול. לאחר אופטימיזציות מסוימות בפרוטוקול, ניתן להשתמש בשיטה הנתונה עבור כל רקמות רכות המראות תצהיר קולגן משמעותי, אשר ניתן לזיהוי על ידי מיקרוסקופיה מקטבת.הטכניקה הנתונה מספקת לחוקרים פרוטוקול אחיד ונוח לחקר מנגנון הכבד על פני בריאים ומחלות.

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Electrofusion Cell דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

ב כימות vivo של G מצמידים חלבון קולטן אינטראקציות באמצעות נפתר Spectrally שני פוטון מיקרוסקופית

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

מיקרו מכונות אפיון רקמת הריאה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

זיהוי מטרות של רנ&quot;א האדם עם מערכת Assay בלוציפראז LightSwitch באמצעות 3&#39;UTR-הכתב בונה microRNA מחקים בתאים חסיד

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

איתור של הפנמת קולטן מצמיד חלבון G-מופעל ליגנד ידי מיקרוסקופי Confocal

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...