Name: measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:00:00
Duration: 10 min 10 s
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इस काम को चेक गणराज्य की अनुदान एजेंसी (18-02699 एस), चेक एकेडमी ऑफ साइंसेज (आरवीओ 68378050) की संस्थागत अनुसंधान परियोजना और एमईवाईएस सीआर परियोजना एनआईसीआर एक्सेलेस (एलएक्स 22 एनपीओ 05102) द्वारा समर्थित किया गया था। सीआईआईएसबी, इंस्ट्रक्ट-सीजेड सेंटर ऑफ इंस्ट्रक्ट-एरिक ईयू कंसोर्टियम, एमईवाईएस सीआर इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोजेक्ट एलएम 2018127 और यूरोपीय क्षेत्रीय विकास निधि-परियोजना "यूपी सीआईआईएसबी" द्वारा वित्त पोषित है। CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) ने सीएफ नैनोबायोटेक्नोलॉजी, CEITEC MU में माप का वित्तीय रूप से समर्थन किया। हम लाइट माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा, आईएमजी सीएएस, प्राग, चेक गणराज्य को भी स्वीकार करते हैं, जो एमईवाईएस (एलएम 2018129, सीजेड.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) और आरवीओ: 68378050-केएवी-एनपीयूआई द्वारा समर्थित है।

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल सामान्य और फाइब्रोटिक माउस यकृत ऊतक के एएफएम माप के लिए एक चरण-दर-चरण प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि प्रदान करता है। युग्मित ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी उच्च स्थानिक परिशुद्धता प्रदान करती है और कोलेजन फाइबर के विज़ुअलाइज़ेशन को उनके विघटन के कारण सक्षम बनाती है। इसके अलावा, प्राप्त बल वक्रों के विश्लेषण का विस्तृत विवरण प्रदान किया गया है। एएफएम कठोरता माप सेलुलर स्तर पर किया जा सकता है, जो फाइब्रोटिक रोग के विकास के कारण यकृत ऊतक यांत्रिक गुणों में स्थानीय परिवर्तनों की निगरानी करने की अनुमति देता है। लिवर फाइब्रोसिस पूरे अंग को प्रभावित करने वाली एक सजातीय प्रक्रिया नहीं है। इसके विपरीत, कोलेजन युक्त फाइब्रोटिक सेप्टा के क्षेत्रों को कम या बिना कोलेजन जमा वाले क्षेत्रों के साथ जोड़ा जाता है। इस प्रकार, कठोरता परिवर्तन स्थानीय माइक्रोएन्वायरमेंट के लिए विशिष्ट हैं और केवल चोट से क्षतिग्रस्त क्षेत्रों के संपर्क में स्थानीय रूप से कोशिकाओं को प्रभावित करते हैं। कठोरता विषमता का यह माइक्रोस्केल एएफएम यंग के मापांक मानचित्रों के विवरण में भी स्पष्ट है, जहां उच्च कठोरता के बिंदु लगभग सामान्य कठोरता के क्षेत्रों की सीमा बनाते हैं। इस भिन्नता से पता चलता है कि यहां तक कि कोलेजन निशान ऊतक क्षेत्र यांत्रिक रूप से सजातीय नहीं है और सेलुलर स्तर पर एएफएम माप की विशेषता की आवश्यकता होती है (चित्रा 4)।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल यकृत संग्रह से स्वतंत्र रूप से एएफएम द्वारा यकृत कठोरता के माप की अनुमति देता है, क्योंकि ओसीटी में एम्बेडेड पूरे यकृत लोब को -80 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक संग्रहीत किया जा सकता है। हालांकि, एक बार ऊतक को विभाजित करने के बाद, हम ~ 2 सप्ताह के भीतर नमूनों को मापने की सलाह देते हैं क्योंकि हमने लंबे समय तक संग्रहीत ऊतक वर्गों के क्रमिक नरम होने को देखा है (चित्रा 5)।
ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी से लैस एएफएम यकृत लोब्यूल संरचना के भीतर रुचि के क्षेत्र का सटीक पता लगाने की अनुमति देता है। हालांकि, इसकी कुछ सीमाएं भी हैं जिन्हें परिणामों की व्याख्या करते समय विचार करने की आवश्यकता है। यहां प्राप्त कठोरता मूल्यों को कमरे के तापमान पर मापा गया था। हम मानते हैं कि नरम ऊतक के यांत्रिक गुणों पर तापमान का प्रभाव छोटा होगा; हालांकि, यह यकृत ऊतकों के यांत्रिक गुणों के विवो मूल्यों और इस अध्ययन में मूल्यों के बीच अंतर के कारणों में से एक हो सकता है।
इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल 3 घंटे तक यकृत ऊतक के एएफएम विश्लेषण की अनुमति देता है, जिसके लिए ऊतक के हल्के निर्धारण की आवश्यकता होती है। ऊतक वर्गों के हल्के निर्धारण, साथ ही फ्रीज-पिघलना चक्र, यंग के मापांक के पूर्ण मूल्यों को प्रभावित करेगा। इस प्रकार, यंग के मोडुलिन के रिपोर्ट किए गए मूल्य विवो मूल्यों से भिन्न हो सकते हैं। यकृत वर्गों से यंग के मापांक के पूर्ण मूल्यों के माप के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है, जिसे यकृत ऊतक64 के निर्धारण के लिए एक अलग विधि द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।
बहरहाल, हमने 6 सप्ताह की तुलना में 3 सप्ताह के लिए सीसीएल4 के साथ इलाज किए गए चूहों के यकृत में कोलेजन युक्त क्षेत्रों की बढ़ती कठोरता देखी। इस तरह के परिवर्तन लंबे समय तक चोट के दौरान फाइब्रोसिस प्रगति के अनुरूप होते हैं (चित्रा 4) और दिखाते हैं कि प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करके विभिन्न उपचारों के बीच सापेक्ष अंतर की जांच की जा सकती है। यह कैलो एट अल के अवलोकनों के साथ सहमति में है, जिन्होंने दिखाया कि हल्के से निश्चित यकृत खंड कोलेजन युक्त और कोलेजन की कमी वाले क्षेत्रों के बीच कठोरता मूल्यों में समान अंतर दिखाते हैं जैसा कि ताजा ऊतक25 में होता है।
हमने माप के दौरान यकृत ऊतक के यांत्रिक व्यवधान को कम करने के लिए 5.7 μm व्यास गोलाकार टिप के साथ संशोधित एसडी-क्यूपी-बायोटी-टीएल -10 कैंटिलीवर (सैद्धांतिक स्प्रिंग स्थिरांक ~ 0.09 एन / एम) का उपयोग किया। एक 5.7 μm मोती ने इसकी अखंडता को संरक्षित करते हुए इसकी कठोरता की जांच करने के लिए नमूने के पर्याप्त इंडेंटेशन को सक्षम किया। कठोरता मानचित्रों में उच्च रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए कई अनुकूलनों के बाद, एक छोटे व्यास वाले मोती का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन यंग के मापांक मूल्यों की और अधिक अतिवृद्धि हो सकती है (अधिक जानकारी के लिए, देखें क्रिचटन एट अल.65)। निर्दिष्ट कैंटिलीवर-बीड पहनावा का उपयोग करके, हम पीए की दसियों इकाइयों से ~ 100 केपीए तक, एक विस्तृत श्रृंखला में नमूना कठोरता को चिह्नित करने में सक्षम थे।
स्नेडन के मॉडल का उपयोग बल वक्रों से यंग के मापांक को प्राप्त करने के लिए किया गया था, क्योंकि यह कोलाइडल जांच62 के साथ गहरे इंडेंटेशन के विश्लेषण की अनुमति देता है। हर्ट्ज के मॉडल के विपरीत स्नेडन का मॉडल, इस बाधा से ग्रस्त नहीं है कि संपर्क त्रिज्या गोले त्रिज्या की तुलना में बहुत छोटी होनी चाहिए। यह आगे मानता है कि नमूना मोटाई इंडेंटेशन गहराई30,66 से कई गुना अधिक है। वर्तमान अध्ययन में, इंडेंटेशन ~ 2 μm था जिसमें 5.7 μm के मोती का आकार और कोलेजन समृद्ध क्षेत्रों में 30 μm की नमूना मोटाई थी; इस प्रकार, स्नेडन का मॉडल उपयुक्त था। टिप और सब्सट्रेट के बीच आसंजन बल पर विचार करने वाले अन्य मॉडल63 का उपयोग विभिन्न प्रकार के ऊतकों के लिए किया जा सकता है।
एटॉमिकजे में विश्लेषण यंग के मापांक62,67 को प्राप्त करते हुए सब्सट्रेट के योगदान को कम करने के लिए नमूनों की परिमित मोटाई के लिए सुधार लागू करता है। प्राप्त बल वक्रों के विश्लेषण में, हमने 0.45 के एकल पोइसन अनुपात का उपयोग किया, जिसे पहले नरम ऊतकअंगों 24 के लिए अनुशंसित किया गया था। इस सन्निकटन का यंग के मापांक के परिकलित मूल्यों पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ता है, क्योंकि पोइसन के अनुपात के मान में 0.4 से 0.5 तक परिवर्तन के परिणामस्वरूप स्नेडन के समीकरण के अनुसार गणना किए गए यंग के मापांक मानों में केवल 0.893x की कमी होती है। सीसीएल 4 उपचारों की विभिन्न अवधियों के बीच यंग के मापांक में कई गुना अंतरको देखते हुए, पोइसन के अनुपात को अनुमानित करके उत्पन्न त्रुटियां केवल मामूली हैं।
हमने कठोरता मूल्यों की गणना करने के लिए वापस वक्रों का उपयोग किया, क्योंकि हम इंडेंटेशन68 के लिए प्लास्टिक प्रतिक्रिया के बजाय कैंटिलीवर द्वारा प्रदान किए गए भार के लिए ऊतक की लोचदार प्रतिक्रिया में रुचि रखते थे। नरम ऊतक की विस्कोस्टिक प्रतिक्रिया के कारण, वापसी वक्रों को फिट करना यंग के मापांक को अधिक महत्व दे सकता है, जिसे ध्यान में रखा जाना चाहिए। इसके अलावा, हमने देखा है कि दृष्टिकोण वक्रों के साथ डेटा विश्लेषण फाइब्रोटिक और नियंत्रण क्षेत्रों के बीच कठोरता मूल्यों में समान रुझान पैदा करता है, हालांकि पूर्ण मान तदनुसार कम हैं (डेटा नहीं दिखाया गया है)।
प्रोटोकॉल को अनुकूलित करते समय, हमने माप की प्रजनन क्षमता के लिए महत्वपूर्ण कई चरणों की पहचान की। सबसे पहले, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि कैंटिलीवर से संलग्न करते समय मोती लगभग पारभासी नोक के केंद्र में है। यह इंडेंटेशन के दौरान संभावित यांत्रिक असंतुलन को रोकता है। दूसरा, पीएफए के साथ यकृत निर्धारण के दौरान, पिघलने और निर्धारण के लिए समय सीमा का सख्ती से पालन करना आवश्यक है। इस चरण के समय को बदलना ऊतक वर्गों के यांत्रिक गुणों को गंभीर रूप से प्रभावित कर सकता है। तीसरा, तापमान में उतार-चढ़ाव के कारण कठोरता मूल्यों में होने वाली किसी भी कलाकृतियों से बचने के लिए कैंटिलीवर को समवर्ती तापमान मूल्यों की निरंतर निगरानी और इनपुट के साथ बार-बार कैलिब्रेट किया जाना चाहिए। अंत में, एक एकल यकृत अनुभाग को तैयारी से 3 घंटे से अधिक समय तक नहीं मापा जाना चाहिए, क्योंकि ओवरलेड पीबीएस लंबी अवधि में वाष्पित हो सकता है। पाठक एएफएम माप के दौरान आने वाली समस्याओं को हल करने के लिए समस्या निवारण तालिका (तालिका 3) का उल्लेख कर सकते हैं, जिसकी चर्चा नॉर्मन एट अल.46 में भी की गई है।
तालिका 3: समस्या निवारण मार्गदर्शिका. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%203v2.xlsx" target="_blank">कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
प्रस्तुत प्रोटोकॉल यकृत ऊतक की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एएफएम जांच की अनुमति देता है। इसमें सूक्ष्म स्तर पर फाइब्रोटिक यकृत रोग के विकास और अंतिम प्रतिगमन पर जानकारी प्रकट करने की क्षमता है और पुरानी यकृत रोग की प्रगति के दौरान गठित फाइब्रोटिक निशान क्षेत्रों को लक्षित करने वाले उपचारों के विकास में योगदान कर सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >AFM head</td>
			<td >Bruker</td>
			<td >JPK nanowizard 3</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cameras</td>
			<td >Andor</td>
			<td >Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >The Imagingsource&#160;</td>
			<td >S/N:12310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cantilever</td>
			<td >SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors</td>
			<td>S/N:73750F05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryotome</td>
			<td >Leica&#160;</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epoxy resin glue (Long working time )</td>
			<td >Bison epoxy universal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Melamine beads; diameter, 5.7 um</td>
			<td >Microparticles, GmbH</td>
			<td>MF-R-5.7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td>&#160;IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrophobic&#160; slide marker</td>
			<td >SuperHT</td>
			<td>PAP PEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td >JPK nanowizard&#160; v6.1.151</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >AtomicJ v2.3.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost slides</td>
			<td >Thermoscientific</td>
			<td>ref no. J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >System</td>
			<td >Ubuntu 14.04.5 LTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibration isolation control unit</td>
			<td >Tablestable</td>
			<td>AVI-200-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy

मैट्रिक्स कठोरता को यकृत फाइब्रोसिस की प्रगति के प्रमुख ड्राइवरों में से एक के रूप में मान्यता दी गई है। इसका सेल व्यवहार के विभिन्न पहलुओं जैसे सेल फ़ंक्शन, भेदभाव और गतिशीलता पर गहरा प्रभाव पड़ता है। हालांकि, चूंकि ये प्रक्रियाएं पूरे अंग में सजातीय नहीं हैं, इसलिए सेलुलर स्तर पर ऊतकों के यांत्रिक गुणों में परिवर्तन को समझना तेजी से महत्वपूर्ण हो गया है।
यकृत लोब के भीतर कोलेजन युक्त क्षेत्रों की कठोरता की निगरानी करने में सक्षम होने के लिए, यह पेपर परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) द्वारा उच्च स्थानिक परिशुद्धता के साथ यकृत ऊतक लोचदार मोडुलिन को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। एएफएम स्थानीय यांत्रिक गुणों को चिह्नित करने की क्षमता के साथ एक संवेदनशील विधि है, जिसकी गणना यंग (लोचदार के रूप में भी जाना जाता है) मापांक के रूप में की जाती है। ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी के साथ युग्मित एएफएम का उपयोग विशेष रूप से ऊतकों में कोलेजन फाइबर के विघटन के आधार पर फाइब्रोसिस विकास के क्षेत्रों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने फाइब्रोटिक माउस लिवर से कोलेजन युक्त क्षेत्रों की कठोरता और नियंत्रण चूहों के यकृत में संबंधित क्षेत्रों की विशेषता बताई।
फाइब्रोसिस विकास के साथ कोलेजन-पॉजिटिव क्षेत्रों की कठोरता में एक प्रमुख वृद्धि देखी गई थी। प्रस्तुत प्रोटोकॉल हल्के रूप से निश्चित यकृत ऊतक के उपयोग के कारण एएफएम माप की एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि की अनुमति देता है, जिसका उपयोग स्थानीय ऊतक यांत्रिक गुणों में रोग-शुरू किए गए परिवर्तनों और पड़ोसी कोशिकाओं के भाग्य पर उनके प्रभाव की समझ को आगे बढ़ाने के लिए किया जा सकता है।

हल्के रूप से तय, नियंत्रण चूहों से प्राप्त 30 μm मोटी यकृत खंडों और हल्के या उन्नत फाइब्रोसिस वाले चूहों से (क्रमशः 3 सप्ताह या 6 सप्ताह के लिए CCl4 के इंजेक्शन से प्रेरित) को AFM के साथ जांच की गई थी जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है। कठोरता मानचित्रों के माप के लिए केंद्रीय नसों के करीब कोलेजन फाइबर का चयन किया गया था। केंद्रीय नसों के करीब के क्षेत्र, जो उन क्षेत्रों के अनुरूप हैं जहां सीसीएल4-उपचारित जानवरों में कोलेजन फाइबर आमतौर पर बनते हैं, नियंत्रण यकृत (चित्रा 4 ए) में विश्लेषण किया गया था। यंग के मोडुलिन का वितरण एक एकल यकृत खंड (चित्रा 4 बी: बाएं वायलिन प्लॉट) के भीतर विभिन्न नियंत्रण यकृत और कोलेजन समृद्ध क्षेत्रों में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य था।
सीसीएल4-उपचारित जानवरों में, कोलेजन जमा के पेरीसेंट्रल क्षेत्रों के अनुरूप कठोरता मानचित्रों ने नियंत्रण चूहों में समकक्ष क्षेत्रों की तुलना में यंग के मापांक के काफी अधिक मूल्य दिखाए (चित्रा 4 बी: 1.9 केपीए बनाम 2.6 केपीए औसत यंग के नियंत्रण के लिए मापांक मान बनाम 3 सप्ताह सीसीएल4-उपचारित माउस; पी = 0.07; 1.9 केपीए बनाम 5.1 केपीए औसत यंग का मापांक मान बनाम 6 सप्ताह सीसीएल4 -इलाज माउस; पी = 0.02)। इसके अलावा, लंबे सीसीएल4 उपचार के साथ यंग के मापांक के मूल्यों में उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी (चित्रा 4 बी; 2.6 केपीए बनाम 5.1 केपीए औसत यंग के मापांक मान 3 सप्ताह बनाम 6 सप्ताह सीसीएल4-उपचारित माउस; पी = 0.04)। यह फाइब्रोसिस प्रगति के साथ कोलेजन जमा की क्रमिक कठोरता को दर्शाता है और एएफएम माप फाइब्रोजेनेसिस को दर्शाता है।
कोलेजन फाइबर के यांत्रिक गुणों पर ओसीटी-एम्बेडेड यकृत वर्गों के लंबे समय तक भंडारण के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, हमने सीसीएल4-उपचारित चूहों के वर्गों में कोलेजन फाइबर की कठोरता को मापा, जिन्हें काटने के बाद स्लाइड पर 2 सप्ताह या 3 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था (चित्रा 5)। एएफएम माप ने नमूना सेक्शनिंग के 2 सप्ताह के भीतर मापे गए वर्गों से प्राप्त वर्गों की तुलना में 3 महीने के लिए संग्रहीत वर्गों के लिए कोलेजन समृद्ध क्षेत्रों में यंग के मापांक के काफी कम मूल्य दिखाए (चित्रा 5; 4.7 केपीए बनाम 3.6 केपीए औसत यंग के मापांक मान 2 सप्ताह बनाम 3 महीने के भंडारण; पी < 0.001)। इस प्रकार, ओसीटी-एम्बेडेड लिवर लोब से अनुभाग तैयार होने के तुरंत बाद यकृत ऊतक के यांत्रिक गुणों को मापना महत्वपूर्ण है।
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig04.jpg"> चित्रा 4: एएफएम माप लंबे समय तक सीसीएल4 उपचार के साथ सहसंबंधित कोलेजन समृद्ध क्षेत्रों की प्रगतिशील कठोरता को प्रकट करते हैं। (ए) 3 सप्ताह या 6 सप्ताह के लिए सीसीएल 4 के साथ इलाज किए गएचूहों और चूहों से यकृत वर्गों का उपयोग कोलेजन युक्त क्षेत्रों के यांत्रिक गुणों को मापने के लिए किया गया था। ध्रुवीकृत माइक्रोस्कोपी छवियों (बाएं) में दिखाए गए यकृत वर्गों के बॉक्स किए गए क्षेत्र कोलेजन युक्त स्कैन क्षेत्र (या नियंत्रण यकृत में संबंधित क्षेत्र) हैं जो एएफएम माप (30 μm x 100 μm, 10 पिक्सेल x 36 पिक्सेल) के लिए चुने गए हैं। इन बॉक्स किए गए क्षेत्रों के अनुरूप रंग तराजू के साथ यंग के मापांक मानचित्र दाईं ओर दिखाए गए हैं, जिसमें इन मानचित्रों से यंग के मापांक मूल्यों के हिस्टोग्राम शामिल हैं; इनसेट स्कैटर प्लॉट प्रत्येक स्थिति के लिए >10 kPa मान दिखाते हैं। जिगर की कठोरता को हिस्टोग्राम वितरण में क्रमिक दाईं ओर बदलाव और इनसेट स्कैटर प्लॉट में बिंदुओं की उच्च आवृत्ति के रूप में देखा जाता है। (बी) वायलिन प्लॉट प्रत्येक स्थिति (बाएं) के लिए मापे गए तीन क्षेत्रों से लोचदार मोडुलिन के वितरण को दर्शाते हैं और सभी तीन मानचित्रों (दाएं) से लोचदार मोडुलिन मूल्यों को संक्षेप में दिखाते हैं। वायलिन प्लॉट औसत (लाल रेखा), 25वें प्रतिशत और 75 वें प्रतिशत (काली रेखाएं) दिखाते हैं; डॉट्स क्षेत्र 1-3 से अलग-अलग मानचित्रों के औसत मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रस्तुत पी-मानों की गणना साधनों पर किए गए छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके की गई थी। संक्षेप: एएफएम = परमाणु बल माइक्रोस्कोपी; सीसीएल4 = कार्बन टेट्राक्लोराइड। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig04large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig05.jpg"> चित्रा 5: यकृत वर्गों के विस्तारित भंडारण से कोलेजन युक्त क्षेत्रों की कठोरता में कमी आती है। 2 सप्ताह या 3 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत यकृत अनुभागों (2 सप्ताह के लिए सीसीएल4 के साथ इलाज किए गए चूहों से तैयार) का उपयोग यंग के मापांक को मापने के लिए किया गया था। ध्रुवीकृत माइक्रोस्कोपी छवियां (बाएं) एएफएम माप के लिए उपयोग किए जाने वाले कोलेजन समृद्ध क्षेत्रों को इंगित करने वाले बक्से के साथ (30 μm x 100 μm, 10 पिक्सेल x 36 पिक्सेल)। संबंधित यंग के मापांक रंग तराजू (दाएं) के साथ मानचित्र। हिस्टोग्राम प्रत्येक नमूने में 4-6 क्षेत्रों से एकत्र किए गए यंग के मापांक मान दिखाते हैं; इनसेट स्कैटर ग्राफ़ प्रत्येक स्थिति के लिए >10 kPa मान दिखाते हैं। स्केल बार = 20 μm। संक्षेप: एएफएम = परमाणु बल माइक्रोस्कोपी; सीसीएल4 = कार्बन टेट्राक्लोराइड। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig05large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
पूरक चित्रा एस 1: मेलामाइन राल माइक्रो बीड के साथ कैंटिलीवर को संशोधित करने की विधि। (ए) तैयार योजनाबद्ध कैंटिलीवर के सिरे पर एक गोलाकार मोती के लगाव को दर्शाता है। चरण-वार विवरण के लिए, अनुभाग 2, भाग 1, एएफएम कैंटिलीवर टिप के लिए 5.7 μm मोती का अनुलग्नक देखें। (बी) शीर्ष (बाएं) और पार्श्व दृश्य (दाएं) से दिखाए गए कैंटिलीवर सिरे से जुड़े गोलाकार 5.7 μm मोती की माइक्रोस्कोपी छवि। स्केल सलाखों = 20 μm. संक्षेप: एएफएम = परमाणु बल माइक्रोस्कोपी; आरटी = कमरे का तापमान। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%201.pdf" target="_blank">कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
पूरक चित्रा एस 2: परमाणु जे में डेटा विश्लेषण। (ए) परमाणुजे में कठोरता मानचित्र खोलने के लिए पालन किए जाने वाले चरणों का अनुक्रम। प्रक्रिया बल वक्रों और मानचित्रों (x) पर एक एकल बाएं-क्लिक प्रसंस्करण सहायक को खोलता है। ऐड (वाई) पर क्लिक करके और आवश्यक फ़ाइलों का चयन करके फ़ाइलों को प्रसंस्करण सहायक में लोड किया जा सकता है। अगले चरण पर जाने के लिए अगले (जेड) पर क्लिक करें। (बी) माप के दौरान उपयोग किए जाने वाले वक्र फिटिंग, उपयुक्त संपर्क यांत्रिकी मॉडल और एएफएम सेटिंग्स के लिए पैरामीटर। चरण 1-11 प्रोटोकॉल चरण 3, धारा 5, डेटा विश्लेषण में विस्तृत संबंधित उप-बिंदुओं को संदर्भित करता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary_fig_2.pdf" target="_blank">कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
पूरक चित्रा एस 3: परमाणुजे में विश्लेषण किए गए डेटा की रूपरेखा। विश्लेषण किए गए डेटा का पूर्वावलोकन कठोरता मानचित्र (ऊपरी बाईं खिड़की), बल वक्र (ऊपरी दाईं खिड़की), और कच्चे डेटा (निचली खिड़की) को दर्शाता है। संक्षिप्त नाम: एएफएम = परमाणु बल माइक्रोस्कोपी। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%203.pdf" target="_blank">कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

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Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

हम परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सामान्य और रोगग्रस्त यकृत में कोलेजन समृद्ध क्षेत्रों के लोचदार मोडुलिन को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी का एक साथ उपयोग यकृत वर्गों में कोलेजन युक्त क्षेत्रों के स्थानीयकरण के लिए उच्च स्थानिक परिशुद्धता प्रदान करता है।

ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी के साथ युग्मित परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके यकृत कठोरता का मापन

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

हमारा प्रोटोकॉल यकृत वर्गों में कोलेजन समृद्ध और कोलेजन की कमी वाले क्षेत्रों के बीच अंतर प्रदान करता है। इस प्रकार इसका उपयोग फाइब्रोजेनेसिस की प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए अधिक विवरण में किया जा सकता है। तकनीक का मुख्य लाभ यकृत वर्गों में कोलेजन समृद्ध क्षेत्रों का पता लगाने के लिए ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी के उपयोग में निहित है।हमारे प्रोटोकॉल यकृत फाइब्रोसिस के विकास में महान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, और इसे कुछ अनुकूलन के बाद फेफड़ों जैसे अन्य नरम ऊतकों के लिए भी अपनाया जा सकता है। शुरू करने के लिए, जमे हुए यकृत वर्गों को शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस से हटा दें, और उन्हें दो मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पिघलाएं। चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में बर्फ ठंडा 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ खंडों को ठीक करें, इसके बाद पीबीएस के साथ पांच बार धोएं।अंतिम धोने के बाद, ऊतक का उपयोग करके यकृत अनुभाग के चारों ओर अतिरिक्त पीबीएस को पोंछें, और हाइड्रोफोबिक मार्कर पेन के साथ यकृत अनुभाग के चारों ओर लगभग दो से चार सेंटीमीटर की सीमा चिह्नित करें। पीबीएस के साथ नमूने को कवर करें, फिर नमूने को एएफएम चरण पर लोड करें, और इसे एएफएम सिर के साथ कवर करें। परमाणु बल माइक्रोस्कोपी या एएफएम सॉफ्टवेयर में, सेटअप टैब पर जाएं और स्वचालित रूप से सभी फ़ाइलों को सहेजने के लिए ऑटोसेव पर एक टिक चिह्नित करें।फिर सेटअप टैब पर जाकर और सेटिंग्स को सहेजकर माप फ़ाइलों को सहेजने के लिए फ़ाइल नाम और निर्देशिका निर्दिष्ट करें। लेजर को चालू करके और दृष्टिकोण कुंजी पर क्लिक करके एएफएम कैंटिलीवर के साथ ऊतक की सतह से संपर्क करें। दृष्टिकोण पूरा होने के बाद, एक बार वापसी कुंजी पर क्लिक करके कैंटिलीवर टिप को वापस लें, जो कैंटिलीवर को पीजो रेंज के शीर्ष छोर पर वापस ले लेता है।यदि आवश्यक हो, तो एएफएम सिर पर नॉब्स का उपयोग करके डिटेक्टर को फिर से संरेखित करें। लेजर बंद कर दें। टिप अब उद्देश्य के फोकस में है।इसके बाद, सहायक उपकरण टैब पर क्लिक करके और प्रत्यक्ष ओवरले ऑप्टिकल अंशांकन का चयन करके एएफएम माप मानचित्रों के साथ माइक्रोस्कोप के ऑप्टिकल क्षेत्र को ओवरले करें। सफल विंडो में, एक विशिष्ट क्षेत्र को स्कैन करने वाले कैंटिलीवर की छवियों की एक श्रृंखला लेने के लिए बगल में क्लिक करें। अगली विंडो पर जाने के लिए फिर से क्लिक करें।पहली छवि में, सॉफ्टवेयर में टिप स्थिति को चित्रित करने के लिए मैन्युअल रूप से कैंटिलीवर के सिरे के केंद्र पर क्लिक करें। टिप स्थिति को दर्शाने वाले सर्कल को सटीकता बढ़ाने के लिए इसकी त्रिज्या को इंगित करके आकार में हेरफेर किया जा सकता है। स्वचालित रूप से सभी छवियों में कैंटिलीवर टिप स्थिति का पता लगाने के लिए कैलिब्रेट पर क्लिक करें।छवियों के माध्यम से जाकर टिप डिटेक्शन की सटीकता की पुष्टि करें। अगला क्लिक करें, और फिर ऑप्टिकल ओवरले को पूरा करने के लिए समाप्त करें। इसके बाद, ध्रुवीकृत छवि का उपयोग करके डेटा व्यूअर टैब में दिखाई देने वाले हरे बॉक्स के अंदर कोलेजन समृद्ध क्षेत्र को स्थान देने के लिए चरण को स्थानांतरित करें।ग्रिड टैब के तहत क्षेत्र को परिभाषित करके कोलेजन समृद्ध क्षेत्र का चयन करें, और फिर निर्दिष्ट हरे बॉक्स के अंदर बाएं माउस बटन पर एक लंबे प्रेस का उपयोग करके डेटा व्यूअर टैब पर एक आयत बनाएं। चयनित क्षेत्र को माप के क्षेत्र के रूप में सेट करने के लिए नए स्कैन क्षेत्र की पुष्टि करें पर क्लिक करें। फीडबैक लूप के पैरामीटर सेट करें।सेट मुझे 50 हर्ट्ज पर लाभ होता है और पी 0.001 पर लाभ होता है। फिर सेट बिंदु को एक नैनो न्यूटन पर सेट करें। अध्ययन सामग्री यांत्रिक गुणों और कैंटिलीवर की कठोरता के अनुसार सापेक्ष सेट बिंदु मान का चयन करें।बल वक्रों को ठीक से फिट करने के लिए एक आधार रेखा निर्दिष्ट करें। फिर नमूने की सतह स्थलाकृति के अनुसार जेड अक्ष में कैंटिलीवर आंदोलन की लंबाई का चयन करें। Z आंदोलन को स्थिर अवधि पर सेट करें।विस्तार और वापसी में देरी के साथ विस्तार समय को एक सेकंड तक सेट करें। नमूना दर 5,000 हर्ट्ज पर सेट करें। माप के दौरान नमूने और कैंटिलीवर टिप के बीच की दूरी को स्वचालित रूप से समायोजित करने के लिए जेड बंद लूप के सामने एक टिक चिह्नित करें।फिर संलग्न बटन का चयन करके मोटरचालित चरण नियंत्रण को अलग करें। लेजर पर स्विच करें और कैंटिलीवर के साथ नमूने से संपर्क करें। बल दूरी वक्र एकत्र करने के लिए स्टार्ट स्कैन पर क्लिक करें।ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर एटॉमिकजे का उपयोग करके अधिग्रहित डेटा का विश्लेषण करें। प्रक्रिया बल वक्र और मानचित्र आइकन पर क्लिक करके बल वक्रों को प्रोग्राम में लोड करें। फिर प्रसंस्करण सहायक में, ऐड बटन पर क्लिक करके विश्लेषण किए जाने वाले मानचित्र जोड़ें।नक्शे लोड होने के बाद, अगला पर क्लिक करें। अगली विंडो में प्रसंस्करण सेटिंग्स निर्दिष्ट करें। फिटिंग वक्र मापदंडों के एक सेट का उपयोग करके स्वचालित रूप से नमूने और कैंटिलीवर के बीच संपर्क बिंदु का अनुमान लगाने के लिए, संपर्क बिंदु के स्वचालित अनुमान का उपयोग करें।शास्त्रीय केंद्रित ग्रिड विधि द्वारा कैंटिलीवर और नमूने के बीच संपर्क बिंदु निर्धारित करें। मापा बल वक्रों की गुणवत्ता के आधार पर संपर्क बिंदु का सर्वोत्तम निर्धारण प्राप्त करने के लिए मॉडल स्वतंत्र विधि के रूप में आकलन विधि का चयन करें, जिसे डेटा विश्लेषण के अनुकूलन के दौरान अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता है। मॉडल फिट के लिए शास्त्रीय एल दो के रूप में शास्त्रीय मॉडल का उपयोग करके बल इंडेंटेशन वक्र फिट करें।मॉडल के फिट को वापसी वक्र पर सेट करें। यकृत जैसे नरम ऊतकों के लिए अनुशंसित पोइसन का अनुपात 0.45 के रूप में सेट करें। तीन की बेसलाइन डिग्री और एक की इन-कॉन्टैक्ट डिग्री का उपयोग करके वक्र का फिट सेट करें।मॉडल से वक्रों के विचलन के पैमाने के आधार पर बहुपद फिट की डिग्री बदलें। स्नेडन मॉडल के रूप में वापसी वक्रों को फिट करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मॉडल का चयन करें। गोलाकार नोक की त्रिज्या को 2.9 माइक्रोमीटर तक भरें।रीड-इन सक्षम करके डेटा फ़ाइलों से स्प्रिंग स्थिरांक और इनवोल्स लोड करें, फिर फिनिश पर क्लिक करें। डेटा विश्लेषण के बाद, बल वक्रों के माध्यम से जाएं। उन बल वक्रों को बाहर रखें जहां कैंटिलीवर गलत तरीके से यकृत अनुभाग की सतह के करीब पहुंचता है।इन वक्रों में उच्च शोर और असामान्य आकार होते हैं। इसके बाद डेटा को कॉपी या एक्सपोर्ट किया जा सकता है। इस अध्ययन में, कार्बन टेट्राक्लोराइड के इंजेक्शन से प्रेरित हल्के और उन्नत फाइब्रोसिस वाले चूहों और नियंत्रित चूहों से प्राप्त हल्के निश्चित यकृत वर्गों की एएफएम के साथ जांच की गई थी।उन क्षेत्रों के अनुरूप केंद्रीय नसों के करीब के क्षेत्र जहां कार्बन टेट्राक्लोराइड चूहों में कोलेजन फाइबर आमतौर पर बनते हैं, नियंत्रण यकृत में विश्लेषण किया गया था। यंग के मोडुलिन का वितरण एक एकल यकृत अनुभाग के भीतर नियंत्रित यकृत और कोलेजन समृद्ध क्षेत्रों में विभिन्न क्षेत्रों में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य था। कार्बन टेट्राक्लोराइड उपचारित चूहों में, कोलेजन जमा के पेरीसेंट्रल क्षेत्रों के अनुरूप कठोरता मानचित्रों ने नियंत्रित चूहों में समकक्ष क्षेत्रों की तुलना में यंग के मोडुलिन के काफी अधिक मूल्य दिखाए।इसके अलावा, लंबे समय तक उपचार के साथ यंग के मोडुलिन के मूल्यों में उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी। कोलेजन फाइबर के यांत्रिक गुणों पर यकृत वर्गों के लंबे समय तक भंडारण के प्रभाव का भी आकलन किया गया था। एएफएम माप ने दो सप्ताह के भीतर प्राप्त किए गए वर्गों की तुलना में तीन महीने के लिए संग्रहीत वर्गों के लिए कोलेजन समृद्ध क्षेत्रों में यंग के मोडुलिन के काफी कम मूल्य दिखाए।यकृत अनुभाग के निर्धारण का समय यकृत अनुभाग के यांत्रिक गुणों को बहुत निर्धारित करता है। हम अनुशंसा करते हैं कि प्रोटोकॉल में बताए गए समयबद्ध अंतराल का सख्ती से पालन किया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल में कुछ अनुकूलन के बाद, दी गई विधि का उपयोग किसी भी नरम ऊतकों के लिए किया जा सकता है जो महत्वपूर्ण कोलेजन जमाव दिखाते हैं, जो ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाने योग्य है।दी गई तकनीक शोधकर्ताओं को स्वस्थ और बीमारी में यकृत के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक एकीकृत और सुविधाजनक प्रोटोकॉल प्रदान करती है।

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

SiRNA अभिकर्मक के बाद समय चूक सूत्रीविभाजन की इमेजिंग

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

सेल Electrofusion प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ visualized

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

लाइव सेल यांत्रिक उत्तेजना उत्तर एकीकृत ऑप्टिकल और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा पढ़ाई

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

जी प्रोटीन रिसेप्टर युग्मित spectrally हल दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग सहभागिता के vivo मात्रा में

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

माइक्रो यांत्रिक फेफड़े ऊतक का उपयोग परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी की विशेषता

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

LightSwitch luciferase परख 3&#39;UTR संवाददाता constructs और एक microRNA का उपयोग कर प्रणाली के साथ मानव microRNAs की पहचान लक्ष्य पक्षपाती कक्ष में नकल

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

एकल वीरीय परमाणु बल माइक्रोस्कोपी और सुपर-रेजोल्यूशन फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Confocal और Multiphoton माइक्रोस्कोपी का उपयोग पांच फ्लोरोसेंट प्रोटीन द्वारा चिह्नित hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की विवो Clonal ट्रैकिंग में

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

मापने की कठोरता<em&gt; पूर्व विवो</em&gt; माउस Aortas परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा लिगेंड सक्रिय जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर internalization की जांच

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...