Name: measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:00:00
Duration: 10 min 10 s
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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Grant Agency della Repubblica Ceca (18-02699S), dal Progetto di ricerca istituzionale dell'Accademia ceca delle scienze (RVO 68378050) e dal progetto MEYS CR NICR EXCELES (LX22NPO05102). CIISB, Instruct-CZ Centre of Instruct-ERIC EU consortium, finanziato dal progetto infrastrutturale MEYS CR LM2018127 e dal progetto del Fondo europeo di sviluppo regionale "UP CIISB" (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) ha sostenuto finanziariamente le misurazioni presso il CF Nanobiotechnology, CEITEC MU. Ringraziamo inoltre la Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praga, Repubblica Ceca, supportata da MEYS (LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) e RVO: 68378050-KAV-NPUI, per il loro supporto con l'imaging microscopico qui presentato.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Il protocollo presentato fornisce un metodo riproducibile passo-passo per la misurazione AFM del tessuto epatico di topo normale e fibrotico. La microscopia a polarizzazione accoppiata fornisce un'elevata precisione spaziale e consente la visualizzazione delle fibre di collagene grazie alla loro birifrangenza. Inoltre, viene fornita una descrizione dettagliata dell'analisi delle curve di forza ottenute. La misurazione della rigidità AFM può essere eseguita a livello cellulare, il che consente di monitorare i cambiamenti locali nelle proprietà meccaniche del tessuto epatico dovuti allo sviluppo di malattie fibrotiche. La fibrosi epatica non è un processo omogeneo che colpisce l'intero organo. Al contrario, le aree di setti fibrotici ricchi di collagene sono intervallate da aree di depositi di collagene bassi o assenti. Pertanto, i cambiamenti di rigidità sono specifici del microambiente locale e influenzano solo le cellule localmente a contatto con le aree danneggiate da lesioni. Questa microscala di eterogeneità della rigidità è evidente anche nei dettagli delle mappe del modulo di AFM Young, dove i punti di elevata rigidità confinano con le aree di rigidità quasi normale. Questa variazione mostra che anche l'area del tessuto cicatriziale del collagene non è meccanicamente omogenea e richiede la misurazione dell'AFM per essere caratterizzata a livello cellulare (Figura 4).
Il protocollo presentato consente di misurare la rigidità epatica mediante AFM indipendentemente dalla raccolta del fegato, poiché i lobi interi del fegato incorporati nell'OCT possono essere conservati per un periodo prolungato a -80 °C. Tuttavia, una volta sezionato il tessuto, si consiglia di misurare i campioni entro ~ 2 settimane poiché abbiamo osservato un graduale ammorbidimento delle sezioni di tessuto conservate per periodi di tempo più lunghi (Figura 5).
L'AFM dotato di microscopia a polarizzazione consente di localizzare con precisione l'area di interesse all'interno della struttura del lobulo epatico. Tuttavia, ha anche alcune limitazioni che devono essere considerate quando si interpretano i risultati. I valori di rigidità qui ottenuti sono stati misurati a temperatura ambiente. Supponiamo che gli effetti della temperatura sulle proprietà meccaniche dei tessuti molli saranno piccoli; Tuttavia, questo potrebbe essere uno dei motivi delle differenze tra i valori riportati in vivo delle proprietà meccaniche dei tessuti epatici e i valori in questo studio.
Inoltre, questo protocollo consente l'analisi AFM del tessuto epatico fino a 3 ore, che richiede una lieve fissazione del tessuto. La lieve fissazione delle sezioni di tessuto, così come il ciclo di congelamento-disgelo, molto probabilmente influenzerà i valori assoluti del modulo di Young. Pertanto, i valori riportati dei moduli di Young potrebbero differire dai valori in vivo . Sono necessari ulteriori studi per ottimizzare il protocollo per la misurazione dei valori assoluti del modulo di Young da sezioni epatiche, che possono essere ottenuti con un metodo diverso per la fissazione del tessuto epatico64.
Tuttavia, abbiamo osservato una crescente rigidità delle aree ricche di collagene nel fegato dei topi trattati con CCl4 per 3 settimane rispetto a 6 settimane. Tali cambiamenti corrispondono alla progressione della fibrosi durante una lesione prolungata (Figura 4) e mostrano che le differenze relative possono essere sondate tra i diversi trattamenti utilizzando il protocollo presentato. Ciò è in accordo con le osservazioni di Calò et al., che hanno dimostrato che sezioni epatiche leggermente fisse mostrano differenze simili nei valori di rigidità tra aree ricche di collagene e prive di collagene come nel tessuto fresco25.
Abbiamo utilizzato il cantilever SD-qp-BioT-TL-10 (costante teorica della molla ~0,09 N/m) modificato con una punta sferica di 5,7 μm di diametro per ridurre al minimo la rottura meccanica del tessuto epatico durante le misurazioni. Un tallone da 5,7 μm ha consentito una rientranza sufficiente del campione per sondarne la rigidità preservandone l'integrità. Un tallone con un diametro più piccolo può essere utilizzato, dopo diverse ottimizzazioni, per ottenere una risoluzione più elevata nelle mappe di rigidità, ma potrebbe portare a un'ulteriore sovrastima dei valori del modulo di Young (per maggiori dettagli, vedi Crichton et al.65). Utilizzando l'insieme di perline a sbalzo specificato, siamo stati in grado di caratterizzare la rigidità del campione in un ampio intervallo, da decine di unità di Pa a ~ 100 kPa.
Il modello di Sneddon è stato utilizzato per derivare il modulo di Young dalle curve di forza, in quanto consente l'analisi di rientranze profonde con sonde colloidali62. Il modello di Sneddon, a differenza del modello di Hertz, non soffre del vincolo che il raggio di contatto deve essere molto più piccolo del raggio della sfera. Si presuppone inoltre che lo spessore del campione sia parecchie volte superiore alla profondità di indentazione30,66. Nel presente studio, l'indentazione era ~ 2 μm con una dimensione del tallone di 5,7 μm e uno spessore del campione di 30 μm in aree ricche di collagene; quindi, il modello di Sneddon era appropriato. Altri modelli63 considerando la forza di adesione tra punta e substrato possono essere utilizzati per diversi tipi di tessuti.
L'analisi in AtomicJ implementa correzioni per lo spessore finito dei campioni per minimizzare il contributo di un substrato derivando il modulo di Young62,67. Nell'analisi delle curve di forza ottenute, abbiamo utilizzato un singolo rapporto di Poisson di 0,45, che è stato precedentemente raccomandato per gli organi dei tessuti molli24. Questa approssimazione non ha un effetto significativo sui valori calcolati del modulo di Young, poiché la variazione del valore del rapporto di Poisson da 0,4 a 0,5 risulta solo in una diminuzione di 0,893 volte i valori del modulo di Young calcolati secondo l'equazione di Sneddon. Date le molteplici differenze nel modulo di Young tra le diverse durate dei trattamenti CCl4, gli errori prodotti approssimando il rapporto di Poisson sono solo marginali.
Abbiamo usato curve di prelievo per calcolare i valori di rigidità, poiché eravamo interessati alla risposta elastica del tessuto al carico fornito dal cantilever piuttosto che alla risposta plastica all'indentazione68. A causa della risposta viscoelastica dei tessuti molli, le curve di ritiro potrebbero sovrastimare il modulo di Young, che dovrebbe essere tenuto a mente. Inoltre, abbiamo osservato che l'analisi dei dati con curve di approccio produce tendenze simili nei valori di rigidità tra aree fibrotiche e di controllo, sebbene i valori assoluti siano corrispondentemente inferiori (dati non mostrati).
Durante l'ottimizzazione del protocollo, abbiamo identificato diversi passaggi critici per la riproducibilità delle misurazioni. Innanzitutto, è importante assicurarsi che il tallone sia approssimativamente al centro della punta traslucida mentre si attacca al cantilever. Ciò impedisce possibili squilibri meccanici durante l'indentazione. In secondo luogo, durante la fissazione del fegato con PFA, è necessario seguire rigorosamente i limiti di tempo per lo scongelamento e la fissazione. La modifica dei tempi di questo passaggio potrebbe influire gravemente sulle proprietà meccaniche delle sezioni di tessuto. In terzo luogo, il cantilever deve essere ripetutamente calibrato con monitoraggio continuo e immissione di valori di temperatura simultanei per evitare che si verifichino artefatti nei valori di rigidità dovuti alle fluttuazioni di temperatura. Infine, una singola sezione del fegato non deve essere misurata per più di 3 ore dalla preparazione, poiché la PBS sovrapposta può evaporare per periodi più lunghi. I lettori possono fare riferimento alla tabella di risoluzione dei problemi (Tabella 3) per risolvere i problemi incontrati durante la misurazione AFM, discussa anche in dettaglio in Norman et al.46.
Tabella 3: Guida alla risoluzione dei problemi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%203v2.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Il protocollo presentato consente il sondaggio AFM riproducibile del tessuto epatico. Ha il potenziale per rivelare informazioni sullo sviluppo e l'eventuale regressione della malattia epatica fibrotica a livello microscopico e può contribuire allo sviluppo di terapie mirate alle regioni cicatriziali fibrotiche formate durante la progressione della malattia epatica cronica.

Il fegato è un organo vitale per il mantenimento dell'omeostasi negli organismi 1,2. Le malattie croniche del fegato rappresentano ~ 2 milioni di morti in tutto il mondo ogni anno3. Hanno origine più comunemente come infezioni virali, disturbi autoimmuni, sindromi metaboliche o malattie legate all'abuso di alcol e sono accompagnati da fibrosi epatica progressiva. Il danno epatico provoca una risposta infiammatoria, che porta all'attivazione delle cellule che depositano la matrice extracellulare (ECM) in una risposta di guarigione delle ferite. Tuttavia, in presenza di un insulto cronico, l'eccesso di ECM forma tessuto cicatriziale irrisolto all'interno del fegato, portando allo sviluppo di fibrosi epatica, cirrosi, carcinoma epatico e, infine, insufficienza epatica4.
La lesione degli epatociti provoca immediatamente un aumento della rigidità epatica 5,6. Ciò influenza direttamente la funzione degli epatociti, attiva le cellule stellate epatiche (HSC) e i fibroblasti portale e provoca la loro transdifferenziazione in miofibroblasti depositanti di collagene 7,8. La deposizione di ECM fibrosa aumenta ulteriormente la rigidità epatica, creando un ciclo di feedback auto-amplificatore di irrigidimento del fegato e attivazione cellulare produttrice di matrice.
La rigidità epatica è, quindi, diventata un parametro importante nella prognosi delle malattie del fegato. Il cambiamento nelle proprietà biomeccaniche del tessuto può essere rilevato prima che la fibrosi possa essere diagnosticata mediante analisi istologica. Pertanto, sono state sviluppate varie tecniche per la misurazione della rigidità epatica sia nella ricerca che nelle applicazioni cliniche. In ambito clinico, l'elastografia transitoria (TE)9,10,11,12,13 e l'elastografia a risonanza magnetica (MRE)14,15,16,17,18 sono state impiegate per diagnosticare in modo non invasivo le prime fasi del danno epatico esaminando la rigidità epatica grossolana 19.
In TE, le onde ultrasoniche di lieve ampiezza e bassa frequenza (50 Hz) vengono propagate attraverso il fegato e viene misurata la loro velocità, che viene quindi utilizzata per calcolare il modulo elastico tissutale13. Tuttavia, questa tecnica non è utile per i pazienti con ascite, obesità o spazi intercostali inferiori a causa della trasmissione impropria delle onde ultrasoniche attraverso i tessuti che circondano il fegato9.
La MRE si basa sulla modalità di risonanza magnetica e utilizza onde di taglio meccaniche a 20-200 Hz per colpire il fegato. Una specifica sequenza di risonanza magnetica viene quindi utilizzata per tracciare le onde all'interno del tessuto e per calcolare la rigidità del tessuto16. I valori di rigidità riportati con entrambe le tecniche TE e MRE sono ben correlati con il grado di fibrosi epatica ottenuto da biopsie di campioni di fegato umano classificati utilizzando i punteggi istologici METAVIR20 (Tabella 1). TE e MRE sono stati adattati anche per la misurazione della rigidità epatica in modelli di roditori per scopi di ricerca21,22,23. Tuttavia, poiché entrambi i metodi derivano i valori di rigidezza dalla risposta del tessuto alle onde di taglio che si propagano, i valori ottenuti potrebbero non riflettere la rigidità meccanica assoluta del tessuto.
Per una caratterizzazione meccanica diretta dei fegati dei roditori, Barnes et al. hanno sviluppato un test modello-gel-tessuto (saggio MGT) che coinvolge l'incorporazione del tessuto epatico in gel di poliacrilammide24. Questo gel è compresso da una forza uniforme pulsata da cui è possibile calcolare il modulo di Young. Il test MGT mostra una buona correlazione con un test di indentazione adattato sia per il fegato normale che per quello fibrotico24 (Tabella 1).
Tabella 1: Valori di rigidità epatica a livello di massa. TE e MRE confrontati con misurazioni meccaniche dirette ex vivo di moduli elastici epatici utilizzando saggi di indentazione e MGT per fegati provenienti da fonti diverse. La relazione tra E e G è data da E = 2G (1 + v), dove v è il rapporto di Poisson del campione; F0 a F4 rappresentano il punteggio di fibrosi nel sistema di punteggio METAVIR, con F0 che indica una fibrosi bassa o assente e fegati cirrotici F4. Abbreviazioni: TE = elastografia transitoria; MRE = elastografia a risonanza magnetica; MGT = modello-gel-tessuto; E = modulo elastico (di Young); G = modulo di taglio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%201v2.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Uno dei principali svantaggi delle misurazioni generiche della rigidità epatica è che non forniscono una risoluzione a livello cellulare dell'eterogeneità della rigidità nel fegato. Durante la progressione della fibrosi, le aree ricche di collagene mostrano una maggiore rigidità rispetto al parenchima circostante25,26. Questo gradiente di rigidità influenza localmente le cellule residenti e svolge un ruolo importante nel guidare l'eterogeneità HSC27. Pertanto, i cambiamenti nelle proprietà meccaniche locali durante lo sviluppo della malattia epatica devono essere caratterizzati a livello microscopico per comprendere meglio la progressione della fibrosi.
L'AFM consente di misurare le proprietà meccaniche del tessuto con alta risoluzione e alta sensibilità alla forza. AFM utilizza la punta di un cantilever per indentare la superficie di un campione con forze fino a diversi piconewton, inducendo una deformazione a livello microscopico o nanoscopico in base alla geometria e alle dimensioni della punta impiegata. La risposta forzata del campione alla deformazione applicata viene quindi misurata come deflessione nel cantilever28. Le curve forza-spostamento sono raccolte dall'avvicinamento e dalla retrazione del cantilever, che può essere dotato di opportuni modelli di meccanica di contatto per valutare la rigidità locale del campione29.
Oltre a misurare la rigidità di una determinata area, AFM può anche fornire informazioni topografiche su caratteristiche specifiche del campione, come la struttura delle fibre di collagene30,31,32. Diversi studi hanno descritto l'applicazione di AFM per misurare la rigidità di vari tessuti sani e malati, come pelle 32,33, polmone 34,35, cervello36, mammario37,38,39, cartilagine 40 o cuore41,42,43,44 da campioni di pazienti e modelli murini. Inoltre, l'AFM è stato utilizzato anche in vitro per determinare la rigidità delle cellule e degli scaffold proteici extracellulari45,46,47.
La misurazione delle proprietà meccaniche dei campioni biologici utilizzando AFM non è banale a causa della loro morbidezza e fragilità. Pertanto, vari studi hanno standardizzato diverse condizioni e impostazioni, che producono valori ampiamente fluttuanti dei moduli di Young (rivisti da Mckee et al.48). Analogamente ad altri tessuti molli, anche i valori del modulo di Young epatico a diversi gradi di fibrosi epatica mostrano ampie variazioni (Tabella 2). Le differenze nei valori del modulo di Young derivano da differenze nella modalità di funzionamento AFM, punta a sbalzo, metodo di preparazione del campione, spessore del campione, profondità e forze di indentazione, ambiente del tessuto epatico durante la misurazione e metodo di analisi (Tabella 2).
Tabella 2: Valori di rigidità epatica a livello cellulare. I valori di rigidità epatica ottenuti utilizzando AFM descrivono le proprietà meccaniche del fegato a livello cellulare. Abbreviazioni: AFM = microscopia a forza atomica; E = modulo elastico (di Young); PFA = paraformaldeide; PBS = soluzione salina tamponata con fosfato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%202v2.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Questo articolo descrive un protocollo per la misurazione riproducibile dei moduli di Young di aree fibrotiche ricche di collagene nel tessuto epatico mediante AFM con una localizzazione precisa fornita dall'uso della microscopia a polarizzazione. Abbiamo somministrato tetracloruro di carbonio (CCl4) per indurre la deposizione di collagene in modo centrilobulare49 in un modello murino, imitando in modo affidabile aspetti cruciali della fibrosi epatica umana50. Le immagini microscopiche polarizzate consentono la visualizzazione del collagene nel fegato grazie alla birifrangenza delle fibre di collagene51, che consente un posizionamento accurato della punta a sbalzo sull'area di interesse desiderata all'interno del lobulo epatico52.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >AFM head</td>
			<td >Bruker</td>
			<td >JPK nanowizard 3</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cameras</td>
			<td >Andor</td>
			<td >Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >The Imagingsource&#160;</td>
			<td >S/N:12310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cantilever</td>
			<td >SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors</td>
			<td>S/N:73750F05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryotome</td>
			<td >Leica&#160;</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epoxy resin glue (Long working time )</td>
			<td >Bison epoxy universal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Melamine beads; diameter, 5.7 um</td>
			<td >Microparticles, GmbH</td>
			<td>MF-R-5.7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td>&#160;IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrophobic&#160; slide marker</td>
			<td >SuperHT</td>
			<td>PAP PEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td >JPK nanowizard&#160; v6.1.151</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >AtomicJ v2.3.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost slides</td>
			<td >Thermoscientific</td>
			<td>ref no. J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >System</td>
			<td >Ubuntu 14.04.5 LTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibration isolation control unit</td>
			<td >Tablestable</td>
			<td>AVI-200-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy

L'irrigidimento della matrice è stato riconosciuto come uno dei fattori chiave della progressione della fibrosi epatica. Ha effetti profondi su vari aspetti del comportamento cellulare come la funzione cellulare, la differenziazione e la motilità. Tuttavia, poiché questi processi non sono omogenei in tutto l'organo, è diventato sempre più importante comprendere i cambiamenti nelle proprietà meccaniche dei tessuti a livello cellulare.
Per essere in grado di monitorare l'irrigidimento delle aree ricche di collagene all'interno dei lobi del fegato, questo documento presenta un protocollo per misurare i moduli elastici del tessuto epatico con elevata precisione spaziale mediante microscopia a forza atomica (AFM). L'AFM è un metodo sensibile con il potenziale di caratterizzare le proprietà meccaniche locali, calcolato come modulo di Young (noto anche come elastico). L'AFM accoppiato con la microscopia a polarizzazione può essere utilizzato per localizzare specificamente le aree di sviluppo della fibrosi in base alla birifrangenza delle fibre di collagene nei tessuti. Utilizzando il protocollo presentato, abbiamo caratterizzato la rigidità delle aree ricche di collagene da fegati di topo fibrotici e aree corrispondenti nei fegati dei topi di controllo.
Un notevole aumento della rigidità delle aree collagene-positive è stato osservato con lo sviluppo della fibrosi. Il protocollo presentato consente un metodo altamente riproducibile di misurazione dell'AFM, grazie all'uso di tessuto epatico leggermente fissato, che può essere utilizzato per approfondire la comprensione dei cambiamenti avviati dalla malattia nelle proprietà meccaniche dei tessuti locali e il loro effetto sul destino delle cellule vicine.

Sezioni epatiche lievemente fisse, spesse 30 μm ottenute da topi di controllo e da topi con fibrosi lieve o avanzata (indotta mediante iniezione di CCl4 per 3 settimane o 6 settimane, rispettivamente49) sono state esaminate con AFM come descritto in questo protocollo. Le fibre di collagene vicino alle vene centrali sono state selezionate per la misurazione delle mappe di rigidità. Le aree vicine alle vene centrali, che corrispondono alle aree in cui di solito si formano le fibre di collagene negli animali trattati con CCl4, sono state analizzate nei fegati di controllo (Figura 4A). La distribuzione dei moduli di Young era riproducibile attraverso diversi fegati di controllo e aree ricche di collagene all'interno di una singola sezione del fegato (Figura 4B: grafico del violino sinistro).
Negli animali trattati con CCl 4, le mappe di rigidità corrispondenti alle aree pericentrali dei depositi di collagene hanno mostrato valori significativamente più elevati dei moduli di Young rispetto alle aree equivalenti nei topi di controllo (Figura 4B: 1,9 kPa vs. 2,6 kPa mediana dei valori del modulo di Young per il controllo vs. 3 settimane di topo trattato con CCl 4; p = 0,07; 1,9 kPa vs. 5,1 kPa valori mediani del modulo di Young per il controllo vs. 6 settimane CCl4 -topo trattato; p = 0,02). Inoltre, c'è stato un aumento significativo dei valori dei moduli di Young con un trattamento CCl 4 più lungo (Figura 4B; 2,6 kPa vs 5,1 kPa valori del modulo mediano di Young per 3 settimane vs. 6 settimane di topi trattati con CCl4; p = 0,04). Ciò mostra un graduale irrigidimento dei depositi di collagene con progressione della fibrosi e che le misurazioni AFM riflettono la fibrogenesi.
Per valutare l'effetto della conservazione prolungata di sezioni epatiche incorporate in OCT sulle proprietà meccaniche delle fibre di collagene, abbiamo misurato la rigidità delle fibre di collagene in sezioni di topi trattati con CCl4, che sono stati conservati a -80 ° C per 2 settimane o 3 mesi sul vetrino dopo il taglio (Figura 5). Le misurazioni AFM hanno mostrato valori significativamente più bassi dei moduli di Young nelle aree ricche di collagene per le sezioni conservate per 3 mesi rispetto a quelle ottenute dalle sezioni misurate entro 2 settimane dal sezionamento del campione (Figura 5; 4,7 kPa rispetto ai valori del modulo di Young mediano di 3,6 kPa per 2 settimane rispetto a 3 mesi di conservazione; p < 0,001). Pertanto, è importante misurare le proprietà meccaniche del tessuto epatico poco dopo che le sezioni sono state preparate dai lobi epatici incorporati nell'OCT.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig04.jpg"> Figura 4: Le misurazioni dell'AFM rivelano un progressivo irrigidimento delle aree ricche di collagene correlate al trattamento prolungato con CCl4. (A) Sezioni di fegato di topi di controllo e topi trattati con CCl4 per 3 settimane o 6 settimane sono state utilizzate per misurare le proprietà meccaniche delle aree ricche di collagene. Le aree inscatolate delle sezioni epatiche mostrate nelle immagini di microscopia polarizzata (a sinistra) sono aree di scansione ricche di collagene (o regioni corrispondenti nel fegato di controllo) selezionate per le misurazioni AFM (30 μm x 100 μm, 10 pixel x 36 pixel). Le mappe del modulo di Young con scale di colori corrispondenti a queste aree riposte sono mostrate sulla destra, compresi gli istogrammi dei valori del modulo di Young da queste mappe; I grafici a dispersione inseriti mostrano valori >10 kPa per ogni condizione. L'irrigidimento del fegato viene visualizzato come un graduale spostamento verso destra nella distribuzione dell'istogramma e una maggiore frequenza di punti nel grafico a dispersione inserito. Barra di scala = 20 μm. (B) I grafici a violino mostrano la distribuzione dei moduli elastici da tre aree misurate per ciascuna condizione (a sinistra) e riassumono i valori dei moduli elastici da tutte e tre le mappe (a destra). I grafici del violino mostrano la mediana (linea rossa), il 25° percentile e il 75° percentile (linee nere); I punti rappresentano i valori medi delle singole mappe delle aree 1-3. I valori p presentati sono stati calcolati utilizzando un t-test di Student eseguito sulle medie. Abbreviazioni: AFM = microscopia a forza atomica; CCl4 = tetracloruro di carbonio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig05.jpg"> Figura 5: La conservazione prolungata delle sezioni del fegato porta ad una diminuzione della rigidità delle aree ricche di collagene. Per misurare il modulo di Young sono state utilizzate sezioni di fegato (preparate da topi trattati con CCl4 per 2 settimane) conservate a -80 °C per 2 settimane o 3 mesi. Immagini al microscopio polarizzato (a sinistra) con caselle che indicano le aree ricche di collagene utilizzate per la misurazione dell'AFM (30 μm x 100 μm, 10 pixel x 36 pixel). Mappe del modulo di Young corrispondenti con scale di colori (a destra). Gli istogrammi mostrano i valori del modulo di Young raccolti da 4-6 aree in ciascun campione; I grafici a dispersione inseriti mostrano valori >10 kPa per ogni condizione. Barra della scala = 20 μm. Abbreviazioni: AFM = microscopia a forza atomica; CCl4 = tetracloruro di carbonio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Figura supplementare S1: Metodo per modificare il cantilever con un micro perlo di resina melamminica. (A) Lo schema disegnato illustra il fissaggio di una perla sferica alla punta del cantilever. Per una descrizione graduale, vedere Sezione 2, Parte 1, Fissaggio di un tallone da 5,7 μm alla punta a sbalzo AFM. (B) Immagine al microscopio di una sferica da 5,7 μm attaccata alla punta a sbalzo mostrata dall'alto (a sinistra) e laterale (a destra). Barre della scala = 20 μm. Abbreviazioni: AFM = microscopia a forza atomica; RT = temperatura ambiente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%201.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare S2: Analisi dei dati in AtomicJ. (A) La sequenza di passaggi da seguire per l'apertura delle mappe di rigidezza in AtomicJ. Un singolo clic sinistro sulle curve di forza di processo e sulle mappe (x) apre l'assistente di elaborazione. I file possono essere caricati nell'assistente di elaborazione facendo clic su aggiungi (y) e selezionando i file richiesti. Fare clic su Avanti (z) per procedere al passaggio successivo. (B) Parametri per l'adattamento della curva, il modello di meccanica di contatto appropriato e le impostazioni AFM utilizzate durante la misurazione. I passaggi da 1 a 11 si riferiscono ai corrispondenti sottopunti dettagliati nella fase 3 del protocollo, Sezione 5, Analisi dei dati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary_fig_2.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare S3: Schema dei dati analizzati in AtomicJ. L'anteprima dei dati analizzati mostra le mappe di rigidità (finestra in alto a sinistra), le curve di forza (finestra in alto a destra) e i dati grezzi (finestra inferiore). Abbreviazione: AFM = microscopia a forza atomica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%203.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

Presentiamo un protocollo per misurare i moduli elastici di aree ricche di collagene in fegato normale e malato utilizzando la microscopia a forza atomica. L'uso simultaneo della microscopia a polarizzazione fornisce un'elevata precisione spaziale per localizzare aree ricche di collagene nelle sezioni del fegato.

Misurazione della rigidità epatica mediante microscopia a forza atomica accoppiata con microscopia a polarizzazione

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

Il nostro protocollo prevede una distinzione tra aree ricche di collagene e aree prive di collagene nelle sezioni del fegato. Può quindi essere utilizzato per studiare i processi della fibrogenesi nei dettagli più grandi. Il principale vantaggio della tecnica risiede nell'uso della microscopia polarizzante per localizzare aree ricche di collagene nelle sezioni del fegato.I nostri protocolli possono fornire una grande comprensione dello sviluppo della fibrosi epatica e possono anche essere adottati per altri tessuti molli come i polmoni dopo alcune ottimizzazioni. Per iniziare, rimuovere le sezioni di fegato congelate da meno 80 gradi Celsius e scongelarle a temperatura ambiente per due minuti. Fissare le sezioni con paraformaldeide ghiacciata al 4% in PBS per 10 minuti a quattro gradi Celsius, quindi lavare cinque volte con PBS.Dopo l'ultimo lavaggio, pulire il PBS in eccesso intorno alla sezione epatica usando il tessuto e segnare un confine di circa due per quattro centimetri attorno alla sezione epatica con un pennarello idrofobo. Coprire il campione con PBS, quindi caricare il campione sullo stadio AFM e coprirlo con la testa AFM. Nella microscopia a forza atomica o nel software AFM, vai alla scheda di configurazione e contrassegna un segno di spunta sul salvataggio automatico per salvare automaticamente tutti i file.Quindi specificare il nome del file e la directory per il salvataggio dei file di misurazione andando alla scheda di configurazione e facendo clic su salvataggio delle impostazioni. Avvicinarsi alla superficie del tessuto con il cantilever AFM accendendo il laser e facendo clic sul tasto di avvicinamento. Al termine dell'avvicinamento, ritrarre la punta a sbalzo facendo clic una volta sul tasto di retrazione, che ritrae il cantilever all'estremità superiore della gamma piezoelettrica.Se necessario, riallineare il rilevatore utilizzando manopole sulla testa AFM. Spegnere il laser. La punta è ora al centro dell'obiettivo.Quindi, sovrapporre il campo ottico del microscopio con le mappe di misurazione AFM facendo clic sulla scheda accessori e selezionando la calibrazione ottica di sovrapposizione diretta. Nella finestra successiva, fare clic su Avanti per scattare una serie di immagini del cantilever che scansiona un'area specifica. Fare di nuovo clic su Avanti per passare alla finestra successiva.Nella prima immagine, fare clic manualmente sul centro della punta del cantilever per rappresentare la posizione della punta nel software. Il cerchio che rappresenta la posizione della punta può essere manipolato in dimensioni indicandone il raggio per aumentare la precisione. Fare clic su Calibra per rilevare automaticamente la posizione della punta a sbalzo in tutte le immagini.Conferma l'accuratezza del rilevamento delle punte esaminando le immagini. Fare clic su Avanti e quindi su Fine per completare la sovrapposizione ottica. Quindi, sposta lo stage per posizionare un'area ricca di collagene all'interno della casella verde, visibile nella scheda del visualizzatore di dati, utilizzando l'immagine polarizzata.Selezionare l'area ricca di collagene definendo l'area sotto la scheda griglia, quindi creando un rettangolo nella scheda del visualizzatore di dati premendo a lungo il pulsante sinistro del mouse all'interno della casella verde specificata. Fare clic su conferma nuova regione di scansione per impostare l'area selezionata come area di misurazione. Impostare i parametri del ciclo di feedback.Imposta I guadagno a 50 hertz e guadagno P a 0,001. Quindi impostare il set point su un nano Newton. Selezionare il valore relativo del set point in base alle proprietà meccaniche dei materiali studiati e alla rigidità del cantilever.Specificate una linea di base giusta per adattare correttamente le curve di forza. Quindi selezionare la lunghezza del movimento a sbalzo nell'asse Z in base alla topografia della superficie del campione. Impostare il movimento Z su una durata costante.Impostare il tempo di estensione su un secondo con ritardi di estensione e retrazione su zero. Impostare la frequenza di campionamento su 5.000 hertz. Contrassegnare un segno di spunta davanti all'anello chiuso Z per regolare automaticamente la distanza tra il campione e la punta a sbalzo durante le misurazioni.Quindi disinnestare il controllo motorizzato dello stage deselezionando il pulsante di coinvolgimento. Accendere il laser e avvicinarsi al campione con il cantilever. Fare clic su avvia scansione per raccogliere le curve di distanza di forza.Analizza i dati acquisiti utilizzando il software open source AtomicJ. Caricare le curve di forza nel programma facendo clic sull'icona Curve di forza processo e mappe. Quindi nell'assistente di elaborazione, aggiungi le mappe da analizzare facendo clic sul pulsante aggiungi.Dopo aver caricato le mappe, fare clic su Avanti. Specificare le impostazioni di elaborazione nella finestra successiva. Per stimare automaticamente il punto di contatto tra il campione e il cantilever utilizzando una serie di parametri della curva di raccordo, utilizzare la stima automatica del punto di contatto.Determinare il punto di contatto tra il cantilever e il campione con il classico metodo a griglia focalizzata. Selezionare il metodo di stima come metodo indipendente dal modello per ottenere la migliore determinazione del punto di contatto in base alla qualità delle curve di forza misurate, che deve essere determinata empiricamente durante l'ottimizzazione dell'analisi dei dati. Adattate la curva di rientro della forza utilizzando un modello classico come L due classico per l'adattamento del modello.Impostate l'adattamento del modello sulla curva di prelievo. Impostare il rapporto di Poisson a 0,45 come raccomandato per i tessuti molli come il fegato. Impostate l'adattamento della curva utilizzando un grado di linea di base pari a tre e un grado di contatto pari a uno.Modificate il grado di adattamento polinomiale in base alla scala delle deviazioni delle curve dal modello. Selezionate il modello utilizzato per adattare le curve di prelievo come modello Sneddon. Riempire il raggio della punta sferica a 2,9 micrometri.Caricare la costante di molla e invOLS dai file di dati abilitando la lettura, quindi fare clic su Fine. Dopo l'analisi dei dati, passare attraverso le curve di forza. Escludere le curve di forza in cui il cantilever si è avvicinato in modo errato alla superficie della sezione del fegato.Queste curve hanno un rumore elevato e forme aberranti. Successivamente, i dati possono essere copiati o esportati. In questo studio, sezioni epatiche leggermente fissate ottenute dai topi di controllo e topi con fibrosi lieve e avanzata indotta dall'iniezione di tetracloruro di carbonio sono state sondate con AFM.Le aree vicine alle vene centrali corrispondenti alle aree in cui di solito si formano le fibre di collagene nei topi con tetracloruro di carbonio sono state analizzate nei fegati di controllo. La distribuzione dei moduli di Young era riproducibile in diverse regioni nei fegati di controllo e nelle aree ricche di collagene all'interno di una singola sezione epatica. Nei topi trattati con tetracloruro di carbonio, le mappe di rigidità corrispondenti alle aree pericentrali dei depositi di collagene hanno mostrato valori significativamente più alti dei moduli di Young rispetto alle aree equivalenti nei topi di controllo.Inoltre, c'è stato un aumento significativo dei valori dei moduli di Young con un trattamento più lungo. È stato anche valutato l'effetto della conservazione prolungata delle sezioni epatiche sulle proprietà meccaniche delle fibre di collagene. Le misurazioni AFM hanno mostrato valori significativamente più bassi dei moduli di Young nelle aree ricche di collagene per le sezioni conservate per tre mesi, rispetto a quelle ottenute entro due settimane.Il tempo di fissazione della sezione epatica determina notevolmente le proprietà meccaniche della sezione epatica. Raccomandiamo che gli intervalli di tempo indicati nel protocollo debbano essere rigorosamente seguiti. Dopo alcune ottimizzazioni nel protocollo, il metodo indicato può essere utilizzato per qualsiasi tessuto molle che mostri una significativa deposizione di collagene, che è rilevabile mediante microscopia polarizzante.La tecnica data fornisce ai ricercatori un protocollo unificato e conveniente per studiare il meccanismo del fegato in salute e malattia.

Research

JoVE Journal

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