Name: measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:00:00
Duration: 10 min 10 s
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この研究は、チェコ共和国の無償資金協力機関(18-02699S)、チェコ科学アカデミーの制度的研究プロジェクト(RVO 68378050)、およびMEYS CRプロジェクトNICR EXCELES(LX22NPO05102)の支援を受けました。CIISB、インストラクト-CZインストラクト-ERIC EUコンソーシアムセンター、MEYS CRインフラストラクチャプロジェクトLM2018127および欧州地域開発基金-プロジェクト「UP CIISB」によって資金提供されました(No.CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974)は、CFナノバイオテクノロジー、CEITEC MUでの測定を財政的に支援しました。また、MEYS(LM2018129、CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045)およびRVO:68378050-KAV-NPUIが支援する、チェコ共和国プラハの光学顕微鏡コアファシリティであるIMG CASが、ここに提示する顕微鏡イメージングのサポートについても認めます。

著者は開示する利益相反を持っていません。

提示されたプロトコルは、正常および線維性マウス肝臓組織のAFM測定のための段階的な再現可能な方法を提供する。結合偏光顕微鏡は、高い空間精度を提供し、複屈折によるコラーゲン線維の視覚化を可能にします。さらに、得られた力曲線の解析の詳細な説明が提供される。AFM剛性測定は細胞レベルで行うことができるため、線維性疾患の発症による肝臓組織の機械的特性の局所的な変化を監視できます。肝線維症は、臓器全体に影響を与える均質なプロセスではありません。それどころか、コラーゲンが豊富な線維性中隔の領域には、コラーゲン沈着が少ないかまったくない領域が点在しています。したがって、剛性の変化は局所的な微小環境に固有であり、損傷によって損傷を受けた領域に局所的に接触している細胞にのみ影響します。このマイクロスケールの剛性の不均一性は、AFM Youngの弾性率マップの詳細でも明らかであり、剛性の高い点はほぼ通常の剛性の領域に隣接しています。この変動は、コラーゲン瘢痕組織領域でさえ機械的に均一ではなく、細胞レベルでの特性評価にはAFM測定が必要であることを示しています(図4)。
提示されたプロトコルは、OCTに埋め込まれた肝葉全体を-80°Cで長期間保存できるため、肝臓収集とは無関係にAFMによる肝臓の硬さの測定を可能にします。 ただし、組織切片を切片したら、長期間保存した組織切片が徐々に軟化するのが観察されているため、~2週間以内にサンプルを測定することをお勧めします(図5)。
偏光顕微鏡を搭載したAFMは、肝小葉構造内の関心領域を正確に特定することができます。ただし、結果を解釈するときに考慮する必要があるいくつかの制限もあります。ここで得られた剛性値は、室温で測定した。軟組織の機械的特性に対する温度の影響は小さいと仮定します。しかし、これは、報告されている肝臓組織の機械的特性の in vivo 値とこの研究の値との間に違いがある理由の1つである可能性があります。
さらに、このプロトコルは、組織の軽度の固定を必要とする最大3時間の肝臓組織のAFM分析を可能にします。組織切片の軽度の固定、および凍結融解サイクルは、ヤング率の絶対値に影響を与える可能性が最も高いです。したがって、ヤング率の報告値は、 in vivo 値とは異なる可能性があります。肝臓切片からのヤング率の絶対値の測定のためのプロトコルを最適化するためにさらなる研究が必要であり、これは肝臓組織の固定のための異なる方法によって達成され得る64。
それにもかかわらず、CCl4 で3週間治療されたマウスの肝臓のコラーゲンが豊富な領域の硬さが6週間と比較して増加していることが観察されました。このような変化は、長期の損傷中の線維症の進行に対応し(図4)、提示されたプロトコルを使用して異なる治療間で相対的な違いを調査できることを示しています。これは、穏やかに固定された肝臓切片が、コラーゲンが豊富な領域とコラーゲンが不足している領域の間で、新鮮な組織と同様の剛性値の違いを示すことを示したCalòらの観察と一致しています25。
測定中の肝臓組織の機械的破壊を最小限に抑えるために、直径5.7μmの球状先端で変更されたSD-qp-BioT-TL-10カンチレバー(理論ばね定数~0.09 N/m)を使用しました。5.7 μmのビーズにより、サンプルの完全性を維持しながら剛性を調べるのに十分なくぼみが可能になりました。いくつかの最適化の後、剛性マップでより高い分解能を得るために、より小さな直径のビードを使用できますが、ヤング率値のさらなる過大評価につながる可能性があります(詳細については、Crichtonら65を参照)。指定されたカンチレバービーズアンサンブルを使用して、数十単位Paから~100kPaまでの広い範囲でサンプル剛性を特徴付けることができました。
スネドンのモデルは、コロイドプローブ62で深いくぼみの分析を可能にするため、力曲線からヤング率を導き出すために使用されました。スネドンのモデルは、ヘルツのモデルとは異なり、接触半径が球の半径よりもはるかに小さくなければならないという制約を受けません。さらに、試料厚さが押し込み深さ30、66の数倍であると仮定する。本研究では、コラーゲンが豊富な領域でのくぼみは~2 μmで、ビーズサイズは5.7 μm、サンプルの厚さは30 μmでした。したがって、スネドンのモデルは適切でした。先端と基板との間の接着力を考慮した他のモデル63 は、異なるタイプの組織に使用することができる。
AtomicJでの解析では、ヤング率62,67を導き出しながら基板の寄与を最小限に抑えるために、サンプルの有限の厚さの補正を実装します。得られた力曲線の解析では、軟部組織器官24に対して以前に推奨されていた0.45の単一のポアソン比を使用しました。ポアソン比の値を0.4から0.5に変更しても、スネドンの式に従って計算されたヤング率の値は0.893倍減少するだけなので、この近似はヤング率の計算値に大きな影響を与えません。CCl4治療の異なる期間間のヤング率の何倍もの差を考えると、ポアソン比を近似することによって生じる誤差はわずかです。
剛性値の計算には、くぼみ68に対する塑性応答ではなく、カンチレバーによって提供される荷重に対する組織の弾性応答に関心があったため、引き出し曲線を使用しました。軟組織の粘弾性応答により、フィッティング撤退曲線はヤング率を過大評価する可能性があり、これは留意する必要があります。さらに、アプローチ曲線を使用したデータ分析では、絶対値はそれに応じて低くなりますが、線維化領域と対照領域の間で剛性値の傾向が類似していることが観察されました(データは示されていません)。
プロトコルを最適化する際に、測定の再現性に不可欠ないくつかのステップを特定しました。まず、ビードがカンチレバーに取り付ける際に半透明の先端のほぼ中央にあることを確認することが重要です。これにより、くぼみ中の機械的不均衡を防ぐことができます。第二に、PFAによる肝臓固定中は、解凍と固定の制限時間を厳守する必要があります。このステップのタイミングを変更すると、組織切片の機械的特性に深刻な影響を与える可能性があります。第三に、カンチレバーは、温度変動による剛性値にアーティファクトが発生するのを避けるために、継続的な監視と同時温度値の入力で繰り返し校正する必要があります。最後に、重ね合わせたPBSは長期間にわたって蒸発する可能性があるため、単一の肝臓切片は準備から3時間以上測定しないでください。読者は、AFM測定中に発生した問題を解決するためにトラブルシューティング表(表3)を参照することができ、Norman et al.46でも詳しく説明されています。
表3:トラブルシューティングガイド。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%203v2.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
提示されたプロトコルは、肝臓組織の再現性のあるAFMプロービングを可能にする。線維性肝疾患の発症と退縮に関する情報を顕微鏡レベルで明らかにする可能性を秘めており、慢性肝疾患の進行時に形成される線維性瘢痕領域を標的とした治療法の開発に貢献する可能性があります。

肝臓は、生物の恒常性を維持するための重要な器官です1,2。慢性肝疾患は、世界中で年間200万人~200万人の死亡を占めています3。それらは、ウイルス感染症、自己免疫疾患、メタボリックシンドローム、またはアルコール乱用関連疾患として最も一般的に発生し、進行性の肝線維症を伴います。肝障害は炎症反応を誘発し、創傷治癒応答において細胞外マトリックス(ECM)を沈着させる細胞の活性化をもたらす。しかし、慢性的な侮辱の存在下では、過剰なECMが肝臓内に未解決の瘢痕組織を形成し、肝線維症、肝硬変、肝癌、そして最終的には肝不全の発症につながります4。
肝細胞損傷は直ちに肝硬直の増加をもたらす5,6。これは肝細胞機能に直接影響を及ぼし、肝星細胞(HSC)と門脈線維芽細胞を活性化し、コラーゲン沈着筋線維芽細胞への分化形質転換をもたらします7,8。線維性ECMの沈着は肝臓の硬さをさらに高め、肝臓の硬化とマトリックス産生細胞の活性化の自己増幅フィードバックループを作り出します。
したがって、肝硬直は肝疾患の予後において重要なパラメータとなっています。生体力学的組織特性の変化は、組織学的分析によって線維症を診断できるよりも早く検出することができる。そのため、肝臓のこわばり測定のための様々な技術が、研究と臨床応用の両方において開発されてきた。臨床現場では、一過性エラストグラフィ(TE)9,10,11,12,13および磁気共鳴エラストグラフィ(MRE)14,15,16,17,18が、肉眼的肝硬直を調べることにより、肝障害の初期段階を非侵襲的に診断するために採用されています19。
TEでは、穏やかな振幅と低周波(50 Hz)の超音波が肝臓を伝播し、それらの速度を測定し、それを使用して組織弾性率を計算します13。しかしながら、この技術は、肝臓9の周囲の組織を通る超音波の不適切な伝達のために、腹水、肥満、または下部肋間腔を有する患者には有用ではない。
MREは磁気共鳴画像法に基づいており、20〜200Hzの機械的横波を使用して肝臓を標的にします。次に、特定の磁気共鳴画像シーケンスを使用して、組織内の波を追跡し、組織の剛性を計算します16。TEおよびMRE技術の両方で報告された剛性値は、組織学的METAVIRスコア20を使用してランク付けされたヒト肝臓サンプルの生検から得られた肝線維症の程度とよく相関しています(表1)。TEとMREは、研究目的でげっ歯類モデルの肝臓の硬さの測定にも適合しています21、22、23。ただし、どちらの方法でも、伝播する横波に対する組織の応答から剛性値が導出されるため、得られた値は組織の絶対的な機械的剛性を反映していない可能性があります。
げっ歯類の肝臓の直接的な機械的特徴付けのために、Barnesらは、ポリアクリルアミドゲル24への肝臓組織の埋め込みを含むモデルゲル組織アッセイ(MGTアッセイ)を開発しました。このゲルはパルス状の均一な力によって圧縮され、そこからヤング率を計算することができます。MGTアッセイは、正常および線維性肝臓の両方に適合したインデンテーションアッセイと良好な相関を示す24 (表1)。
表1:バルクレベルでの肝臓のこわばり値。 TE および MRE を、異なるソースからの肝臓のインデンテーションおよび MGT アッセイを使用した肝臓弾性率の直接的なex vivo機械的測定と比較しました。E と G の関係は E = 2G (1 + v) で与えられ、v はサンプルのポアソン比です。F0からF4はMETAVIRスコアリングシステムの線維症スコアを表し、F0は線維症が低いかまったくないか、F4肝硬変を示します。略語:TE =過渡エラストグラフィー;MRE =磁気共鳴エラストグラフィー;MGT =モデルゲル組織;E =弾性(ヤング)弾性率。G =せん断弾性率。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%201v2.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
一般的な肝臓のこわばり測定の主な欠点の1つは、肝臓の硬さの不均一性の細胞レベルの分解能を提供しないことです。線維症の進行中、コラーゲンが豊富な領域は周囲の実質と比較してより高い剛性を示す25,26。この剛性勾配は、常在細胞に局所的に影響を及ぼし、HSCの不均一性を駆動する上で重要な役割を果たします27。したがって、肝疾患の発症中の局所的な機械的特性の変化は、線維症の進行をよりよく理解するために顕微鏡レベルで特徴付ける必要があります。
AFMにより、組織の機械的特性を高解像度と高力感度で測定できます。AFMは、カンチレバーの先端を使用して、数ピコニュートンという低い力でサンプルの表面をくぼみ、使用する先端の形状とサイズに基づいて微視的またはナノスコピックレベルで変形を誘発します。加えられたひずみに対するサンプルの力応答は、次にカンチレバー28のたわみとして測定されます。力−変位曲線は、カンチレバーの接近および後退から収集され、これは、試料29の局所剛性を評価するために適切な接触力学モデルと適合させることができる。
AFMは、所与の領域の剛性を測定することに加えて、コラーゲン繊維の構造など、サンプル中の特定の特徴に関するトポグラフィー情報も提供することができる30、31、32。複数の研究により、患者およびマウスモデルサンプルの両方から、皮膚32、33、肺34、35、脳36、乳腺37、38、39、軟骨40、または心臓41、42、43、44などのさまざまな健康組織および疾患組織の硬さを測定するためのAFMの適用が記載されている。さらに、AFMは、細胞および細胞外タンパク質足場の剛性を決定するためにインビトロでも使用されている45、46、47。
AFMを使用した生物学的サンプルの機械的特性の測定は、その柔らかさと脆弱性のために自明ではありません。したがって、さまざまな研究がさまざまな条件と設定を標準化しており、ヤング率の値が大きく変動しています(Mckeeらによるレビュー48)。他の軟部組織と同様に、異なるグレードの肝線維症における肝ヤング率値も広範な変動を示す(表2)。ヤング率値の違いは、AFMの動作モード、カンチレバーチップ、サンプル調製方法、サンプルの厚さ、くぼみの深さと力、測定中の肝臓組織環境、および分析方法の違いから生じます(表2)。
表2:細胞レベルでの肝臓のこわばり値。 AFMを使用して得られた肝臓のこわばり値は、細胞レベルでの肝臓の機械的特性を表します。略語:AFM =原子間力顕微鏡;E =弾性(ヤング)弾性率。PFA = パラホルムアルデヒド;PBS =リン酸緩衝生理食塩水。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%202v2.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
この論文では、偏光顕微鏡を使用して提供される正確な局在化を使用して、AFMによる肝臓組織のコラーゲンに富む線維性領域のヤング率の再現可能な測定のためのプロトコルについて説明します。四塩化炭素(CCl4)を投与して、マウスモデルにおいて小葉中心様式でコラーゲン沈着を誘導し49、ヒト肝線維症の重要な側面を確実に模倣した50。偏光顕微鏡画像は、コラーゲン線維51の複屈折による肝臓におけるコラーゲンの可視化を可能にし、これにより、肝小葉52内の所望の関心領域上でカンチレバー先端を正確に位置決めすることができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >AFM head</td>
			<td >Bruker</td>
			<td >JPK nanowizard 3</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cameras</td>
			<td >Andor</td>
			<td >Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >The Imagingsource&#160;</td>
			<td >S/N:12310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cantilever</td>
			<td >SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors</td>
			<td>S/N:73750F05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryotome</td>
			<td >Leica&#160;</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epoxy resin glue (Long working time )</td>
			<td >Bison epoxy universal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Melamine beads; diameter, 5.7 um</td>
			<td >Microparticles, GmbH</td>
			<td>MF-R-5.7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td>&#160;IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrophobic&#160; slide marker</td>
			<td >SuperHT</td>
			<td>PAP PEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td >JPK nanowizard&#160; v6.1.151</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >AtomicJ v2.3.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost slides</td>
			<td >Thermoscientific</td>
			<td>ref no. J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >System</td>
			<td >Ubuntu 14.04.5 LTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibration isolation control unit</td>
			<td >Tablestable</td>
			<td>AVI-200-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy

マトリックスの硬化は、肝線維症の進行の主要な推進力の1つとして認識されています。細胞機能、分化、運動性など、細胞の挙動のさまざまな側面に大きな影響を与えます。しかし、これらの過程は臓器全体で均一ではないため、組織の機械的性質の変化を細胞レベルで理解することがますます重要になっています。
肝葉内のコラーゲンが豊富な領域の硬化を監視できるようにするために、この論文は、原子間力顕微鏡(AFM)によって高い空間精度で肝臓組織の弾性率を測定するためのプロトコルを提示します。AFMは、ヤング率(弾性率とも呼ばれる)として計算される局所的な機械的特性を特徴付ける可能性のある高感度な方法です。偏光顕微鏡と組み合わせたAFMを使用して、組織内のコラーゲン線維の複屈折に基づいて線維症の発生領域を特異的に特定できます。提示されたプロトコルを使用して、線維性マウス肝臓からのコラーゲンリッチ領域と対照マウスの肝臓の対応する領域の剛性を特徴付けました。
コラーゲン陽性領域の剛性の顕著な増加は、線維症の発症とともに観察されました。提示されたプロトコルは、穏やかに固定された肝臓組織の使用により、再現性の高いAFM測定方法を可能にし、局所組織の機械的特性における疾患による変化と隣接細胞の運命への影響の理解を深めるために使用できます。

軽度に固定された、対照マウスおよび軽度または進行した線維症(それぞれ3週間または6週間のCCl4の注射によって誘発された)を有するマウスから得られた厚さ30μmの肝臓切片を、このプロトコルに記載されているようにAFMでプローブした。中心静脈に近いコラーゲン線維を剛性マップの測定のために選択した。CCl4処置動物におけるコラーゲン線維が通常形成される領域に対応する中心静脈に近い領域を、対照肝臓において分析した(図4A)。ヤング率の分布は、単一の肝臓切片内の異なる対照肝臓およびコラーゲンが豊富な領域にわたって再現可能でした(図4B:左のバイオリンプロット)。
CCl 4処理動物では、コラーゲン沈着物の周囲領域に対応する剛性マップは、対照マウスの同等の領域と比較して有意に高いヤング率の値を示しました(図4B:対照のヤング率値1.9 kPa vs. 2.6 kPaの中央値 vs 3週間CCl 4処理マウス;p = 0.07;1.9 kPa vs. 5.1 kPaの中央値 対照のヤング率値 vs. 6週間 CCl4-処置されたマウス;p = 0.02)。さらに、より長いCCl 4処理でヤング率の値に有意な増加が見られた(図4B;3週間のヤング率中央値対6週間のCCl4処置マウスのヤング率中央値2.6 kPa vs 5.1 kPa;p = 0.04)。これは、線維症の進行に伴うコラーゲン沈着物の漸進的な硬化を示しており、AFM測定値が線維形成を反映していることを示しています。
OCT包埋肝臓切片の長期保存がコラーゲン線維の機械的特性に及ぼす影響を評価するために、切断後のスライド上で-80°Cで2週間または3ヶ月間保存されたCCl4治療マウスの切片のコラーゲン線維の硬さを測定しました(図5)。AFM測定では、サンプル切片採取から2週間以内に測定した切片と比較して、3ヶ月間保存した切片のコラーゲンリッチ領域におけるヤング率の値が有意に低かった(図5;2週間保存時のヤング率の中央値4.7 kPa vs. 3.6 kPa;p < 0.001)。したがって、OCTに埋め込まれた肝葉から切片を調製した直後に肝臓組織の機械的特性を測定することが重要です。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig04.jpg"> 図4:AFM測定は、長期のCCl4治療と相関するコラーゲンが豊富な領域の進行性の硬化を明らかにします。 (A)対照マウスおよびCCl4で3週間または6週間処置したマウスの肝臓切片を用いて、コラーゲンリッチ領域の機械的特性を測定した。偏光顕微鏡画像(左)に示されている肝臓切片の四角形領域は、AFM測定用に選択されたコラーゲンリッチスキャン領域(または対照肝臓の対応する領域)です(30 μm x 100 μm、10ピクセルx 36ピクセル)。これらの四角で囲まれた領域に対応するカラースケールを持つヤング率マップは、これらのマップからのヤング率値のヒストグラムを含めて右側に示されています。差し込み散布図には、各条件の値 >10 kPa が表示されます。肝臓の硬化は、ヒストグラム分布の緩やかな右へのシフトと、はめ込み散布図のポイントの頻度が高いとして視覚化されます。スケールバー = 20 μm。 (B)バイオリンプロットは、各条件で測定された3つの領域の弾性率の分布(左)と、3つのマップすべての弾性率値を要約した(右)を示しています。バイオリンプロットは、中央値(赤い線)、25パーセンタイル、75パーセンタイル(黒い線)を示しています。ドットは、エリア1〜3の個々のマップの平均値を表します。提示されたp値は、平均で実行されたスチューデントのt検定を使用して計算されました。略語:AFM =原子間力顕微鏡;CCl4 =四塩化炭素。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig05.jpg"> 図5:肝臓切片を長期間保管すると、コラーゲンが豊富な領域の剛性が低下します。 -80°Cで2週間または3ヶ月間保存された肝臓切片(CCl4 で2週間処理したマウスから調製)を使用して、ヤング率を測定しました。AFM測定に使用したコラーゲンリッチ領域を示すボックス付きの偏光顕微鏡画像(左)(30 μm x 100 μm、10ピクセルx 36ピクセル)。カラースケールによる対応するヤング率マップ(右)。ヒストグラムは、各サンプルの4〜6個の領域から収集されたヤング率値を示します。差し込み散布図は、各条件の値>10 kPaを示しています。スケールバー= 20μm。略語:AFM =原子間力顕微鏡;CCl4 =四塩化炭素。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図S1:メラミン樹脂マイクロビーズによるカンチレバーの改質方法。 (A)描かれた概略図は、カンチレバーの先端への球状ビーズの取り付けを示しています。段階的な説明については、セクション2、パート1、AFMカンチレバーチップへの5.7μmビーズの取り付けを参照してください。(B)カンチレバー先端に取り付けられた球状5.7μmビーズの顕微鏡像を上(左)と側面図(右)から示した。スケールバー= 20μm。略語:AFM =原子間力顕微鏡;RT =室温。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%201.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図S2:アトミックJでのデータ解析 (A) AtomicJで剛性マップを開くために従う一連の手順。プロセスフォースカーブとマップ(x)を1回左クリックすると、処理アシスタントが開きます。ファイルを処理アシスタントにロードするには、追加(y)をクリックして必要なファイルを選択します。次へ(z)をクリックして、次の手順に進みます。(B)カーブフィッティングのパラメータ、適切な接触力学モデル、および測定中に使用されるAFM設定。ステップ1〜11は、プロトコルステップ3、セクション5、データ分析で詳述されている対応するサブポイントを参照します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary_fig_2.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図S3:AtomicJにおける解析データの概要。 解析データのプレビューには、剛性マップ(左上のウィンドウ)、力曲線(右上のウィンドウ)、および生データ(下のウィンドウ)が表示されます。略称:AFM = 原子間力顕微鏡。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%203.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

原子間力顕微鏡を使用して、正常および病気の肝臓のコラーゲンが豊富な領域の弾性率を測定するためのプロトコルを提示します。偏光顕微鏡を同時に使用することで、肝臓切片のコラーゲンが豊富な領域を特定するための高い空間精度が得られます。

原子間力顕微鏡と偏光顕微鏡を組み合わせた肝臓のこわばり測定

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

私たちのプロトコルは、肝臓切片のコラーゲンが豊富な領域とコラーゲンが不足している領域を区別します。したがって、線維形成の過程をより詳細に研究するために使用することができます。この技術の主な利点は、偏光顕微鏡を使用して肝臓切片のコラーゲンが豊富な領域を見つけることにあります。私たちのプロトコルは、肝線維症の発症に関する優れた洞察を提供することができ、特定の最適化後に肺などの他の軟部組織にも採用できます。まず、凍結した肝臓切片をマイナス80°Cから取り除き、室温で2分間解凍します。氷冷した4%パラホルムアルデヒドでPBSで摂氏4度で10分間固定し、続いてPBSで5回洗浄します。最後の洗浄後、組織を使用して肝臓切片の周りの余分なPBSを拭き取り、疎水性マーカーペンで肝臓切片の周囲約2 x 4センチメートルの境界に印を付けます。サンプルをPBSで覆い、次にサンプルをAFMステージにロードし、AFMヘッドで覆います。原子間力顕微鏡またはAFMソフトウェアで、[セットアップ]タブに移動し、自動保存にチェックマークを付けて、すべてのファイルを自動的に保存します。次に、セットアップタブに移動し、設定の保存をクリックして、測定ファイルを保存するためのファイル名とディレクトリを指定します。AFMカンチレバーで組織表面にアプローチするには、レーザーのスイッチを入れ、アプローチキーをクリックします。アプローチが完了したら、リトラクションキーを1回クリックしてカンチレバーチップを引っ込めると、カンチレバーがピエゾ範囲の上端まで引っ込められます。必要に応じて、AFMヘッドのノブを使用して検出器を再調整します。レーザーをオフにします。これで、ヒントが目的の焦点になりました。次に、アクセサリータブをクリックし、直接オーバーレイ光学キャリブレーションを選択して、顕微鏡の光学フィールドをAFM測定マップにオーバーレイします。次のウィンドウで、[次へ]をクリックして、特定の領域をスキャンするカンチレバーの一連の画像を撮ります。もう一度[次へ]をクリックして、次のウィンドウに移動します。最初の画像では、カンチレバーの先端の中央を手動でクリックして、ソフトウェアで先端の位置を示しています。先端位置を表す円は、その半径を示すことでサイズを操作し、精度を高めることができます。キャリブレーションをクリックすると、すべての画像で片持ち梁の先端位置が自動的に検出されます。画像を見て、チップ検出の精度を確認します。[次へ] をクリックし、[完了] をクリックして光学オーバーレイを終了します。次に、ステージを移動し、偏光画像を使用して、データビューアタブに表示される緑色のボックス内にコラーゲンが豊富な領域を配置します。グリッドタブの下の領域を定義し、指定した緑色のボックス内でマウスの左ボタンを長押ししてデータビューアタブに長方形を作成することで、コラーゲンが豊富な領域を選択します。[新しいスキャン領域の確認]をクリックして、選択した領域を測定領域として設定します。フィードバックループのパラメータを設定します。Iゲインを50ヘルツに設定し、Pゲインを0.001に設定します。次に、設定値を1ナノニュートンに設定します。調査した材料の機械的特性とカンチレバーの剛性に応じて、相対的な設定値を選択します。力曲線に適切に適合するように、ジャストベースラインを指定します。次に、サンプルの表面トポグラフィーに応じて、Z軸のカンチレバーの動きの長さを選択します。Z 移動を一定時間に設定します。延長時間を 1 秒に設定し、延長とリトラクションの遅延をゼロに設定します。サンプルレートを5, 000ヘルツに設定します。Z閉ループの前に目盛りを付けると、測定中にサンプルとカンチレバー先端の間の距離が自動的に調整されます。次に、エンゲージボタンの選択を解除して、電動ステージコントロールを解除します。レーザーのスイッチを入れ、カンチレバーでサンプルに近づきます。スキャンの開始をクリックして、力の距離曲線を収集します。取得したデータをオープンソースソフトウェアAtomicJで解析します。プロセス力曲線とマップアイコンをクリックして、力曲線をプログラムにロードします。次に、処理アシスタントで、追加ボタンをクリックして分析するマップを追加します。マップが読み込まれたら、[次へ]をクリックします。次のウィンドウで処理設定を指定します。一連のフィッティング曲線パラメータを使用してサンプルとカンチレバーの間の接触点を自動的に推定するには、接触点の自動推定を使用します。カンチレバーとサンプルの接触点を、古典的な集束グリッド法で決定します。データ解析の最適化中に経験的に決定する必要がある測定された力曲線の品質に基づいて接触点の最良の決定を得るために、モデルに依存しない方法として推定方法を選択します。モデルフィットの古典L 2として古典モデルを使用して力のくぼみ曲線をフィットします。離脱曲線に対するモデルの適合を設定します。ポアソン比を0.45に設定し、肝臓などの軟部組織に推奨します。ベースライン角度 3 と接触角度 1 を使用して曲線のフィットを設定します。モデルからの曲線の偏差のスケールに基づいて多項式適合度を変更します。撤退曲線の適合に使用するモデルをスネードンモデルとして選択します。球形の先端の半径を2.9マイクロメートルに記入します。読み込みを有効にしてデータファイルからばね定数とinvOLSをロードし、[完了]をクリックします。データ分析後、力曲線を通過します。カンチレバーが肝臓セクションの表面に誤って接近した力曲線を除外します。これらの曲線は、高いノイズと異常な形状を持っています。この後、データをコピーまたはエクスポートできます。この研究では、対照マウスおよび四塩化炭素の注射によって誘発された軽度および進行した線維症を有するマウスから得られた軽度に固定された肝臓切片をAFMでプローブした。四塩化炭素マウスのコラーゲン線維が通常形成する領域に対応する中心静脈に近い領域を、対照肝臓で分析した。ヤング率の分布は、単一の肝臓切片内の対照肝臓およびコラーゲンリッチ領域の異なる領域にわたって再現可能でした。四塩化炭素処理マウスにおいて、コラーゲン沈着物の周辺領域に対応する剛性マップは、対照マウスにおける同等の領域と比較してヤング率の有意に高い値を示した。さらに、より長い治療でヤング率の値の有意な増加があった。コラーゲン線維の機械的特性に対する肝臓切片の長期保存の影響も評価された。AFM測定は、2週間以内に得られたものと比較して、3ヶ月間保存された切片のコラーゲンリッチ領域におけるヤング率の有意な低い値を示した。肝切片の固定時間は、肝切片の機械的性質を大きく左右する。プロトコルに記載されている時間間隔に厳密に従うことをお勧めします。プロトコルにおける特定の最適化の後、与えられた方法は、偏光顕微鏡によって検出可能な有意なコラーゲン沈着を示す任意の軟組織に使用することができる。与えられた技術は、健康と病気にわたる肝臓のメカニズムを研究するための統一された便利なプロトコルを研究者に提供します。

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

細胞の電気融合を蛍光顕微鏡で可視化

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

集積光と原子間力顕微鏡による研究機械的刺激に対する細胞応答を生きる

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

スペクトル的に解決された二光子顕微鏡を用いたGタンパク質共役受容体相互作用の in vivo定量で

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

原子間力顕微鏡を用いた肺組織のマイクロメカニカル特性

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

3&#39;UTR -レポーターコンストラクトとマイクロRNAを使用してLightSwitchルシフェラーゼアッセイシステムによるヒトマイクロRNAの識別対象は付着細胞へのミミック

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

の剛性を測定します<em&gt; ex vivoで</em原子間力顕微鏡を使用&gt;マウス大動脈

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

共焦点顕微鏡により、リガンド活性化Gタンパク質共役型受容体内在化の検出

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...