Name: measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:00:00
Duration: 10 min 10 s
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이 연구는 체코 공화국 보조금 기관 (18-02699S), 체코 과학 아카데미 기관 연구 프로젝트 (RVO 68378050) 및 MEYS CR 프로젝트 NICR EXCELES (LX22NPO05102)의 지원을 받았습니다. CIISB, Instruct-CZ Center of Instruct-ERIC EU 컨소시엄, MEYS CR 인프라 프로젝트 LM2018127 및 유럽 지역 개발 기금 프로젝트 "UP CIISB"(No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974)은 CF 나노생명공학인 CEITEC MU에서 측정을 재정적으로 지원했습니다. 또한 MEYS(LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) 및 RVO: 68378050-KAV-NPUI가 지원하는 체코 프라하의 광학 현미경 핵심 시설(IMG CAS)이 여기에 제시된 현미경 이미징을 지원해 준 것을 인정합니다.

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

제시된 프로토콜은 정상 및 섬유성 마우스 간 조직의 AFM 측정을 위한 단계별 재현 가능한 방법을 제공한다. 결합 편광 현미경은 높은 공간 정밀도를 제공하고 복굴절로 인해 콜라겐 섬유의 시각화를 가능하게 합니다. 또한, 얻어진 힘 곡선의 분석에 대한 상세한 설명이 제공된다. AFM 강성 측정은 세포 수준에서 수행 할 수 있으므로 섬유 성 질환 발생으로 인한 간 조직의 기계적 특성의 국소 변화를 모니터링 할 수 있습니다. 간 섬유증은 전체 장기에 영향을 미치는 균질 한 과정이 아닙니다. 반대로, 콜라겐이 풍부한 섬유성 격막 영역에는 콜라겐 침착물이 적거나 없는 영역이 산재되어 있습니다. 따라서 강성 변화는 국소 미세 환경에 따라 다르며 손상으로 손상된 영역과 국소적으로 접촉하는 세포에만 영향을 미칩니다. 이러한 미세한 강성 이질성은 AFM Young의 계수 맵의 세부 사항에서도 분명하며, 여기서 고강성 지점은 거의 정상적인 강성 영역과 접해 있습니다. 이 변화는 콜라겐 흉터 조직 영역조차도 기계적으로 균질하지 않으며 세포 수준에서 특성화하기 위해 AFM 측정이 필요하다는 것을 보여줍니다 (그림 4).
제시된 프로토콜은 OCT에 내장 된 전체 간 엽이 -80 ° C에서 장기간 저장 될 수 있기 때문에 간 수집과 독립적으로 AFM에 의한 간 경화 측정을 허용합니다. 그러나 조직이 절편화되면 더 오랜 기간 동안 보관된 조직 절편의 점진적인 연화를 관찰했으므로 ~5주 이내에 샘플을 측정하는 것이 좋습니다(그림 5).
편광 현미경이 장착 된 AFM을 사용하면 간 소엽 구조 내에서 관심 영역을 정확하게 찾을 수 있습니다. 그러나 결과를 해석할 때 고려해야 할 몇 가지 제한 사항도 있습니다. 여기서 얻어진 강성 값은 실온에서 측정하였다. 우리는 연조직의 기계적 특성에 대한 온도의 영향이 작을 것이라고 가정합니다. 그러나 이것은 간 조직의 기계적 특성의 보고된 생체 내 값과 본 연구의 값 사이의 차이에 대한 이유 중 하나일 수 있습니다.
또한이 프로토콜을 사용하면 최대 3 시간 동안 간 조직의 AFM 분석을 수행 할 수 있으므로 조직의 가벼운 고정이 필요합니다. 조직 절편의 가벼운 고정과 동결-해동 주기는 영률의 절대값에 영향을 미칠 가능성이 큽니다. 따라서, 보고된 영률 값은 생체내 값과 다를 수 있다. 간 절편으로부터 영률의 절대 값을 측정하기위한 프로토콜을 최적화하기 위해서는 추가의 연구가 필요하며, 이는 간 조직(64)의 고정을위한 다른 방법에 의해 달성 될 수있다.
그럼에도 불구하고, 우리는 CCl4로 치료 한 마우스의 간에서 콜라겐이 풍부한 부위의 경직성이 6 주에 비해 3 주 동안 증가하는 것을 관찰했다. 이러한 변화는 장기간의 손상 동안 섬유증 진행에 해당하며(그림 4), 제시된 프로토콜을 사용하여 서로 다른 치료 간에 상대적 차이를 조사할 수 있음을 보여줍니다. 이것은 Calò et al.의 관찰과 일치하며, 그는 약간 고정 된 간 섹션이 신선한 조직25에서와 같이 콜라겐이 풍부한 영역과 콜라겐이 부족한 영역 사이의 강성 값에서 유사한 차이를 보인다는 것을 보여주었습니다.
측정 중 간 조직의 기계적 파괴를 최소화하기 위해 직경 0.09μm 구형 팁으로 수정 된 SD-qp-BioT-TL-10 캔틸레버 (이론적 스프링 상수 ~ 0.7 N / m)를 사용했습니다. 5.7μm 비드는 무결성을 유지하면서 강성을 조사하기 위해 샘플의 충분한 압흔을 가능하게 했습니다. 강성 맵에서 더 높은 해상도를 얻기 위해 여러 최적화 후에 더 작은 직경의 비드를 사용할 수 있지만 영률 값을 더 과대 평가할 수 있습니다 (자세한 내용은 Crichton et al.65 참조). 지정된 캔틸레버-비드 앙상블을 사용하여 수십 Pa 단위에서 ~100kPa까지 광범위한 범위의 시료 강성을 특성화할 수 있었습니다.
Sneddon의 모델은 콜로이드 프로브62로 깊은 압흔을 분석 할 수 있기 때문에 힘 곡선에서 영률을 유도하는 데 사용되었습니다. Sneddon의 모델은 Hertz의 모델과 달리 접촉 반경이 구 반경보다 훨씬 작아야 한다는 제약 조건을 겪지 않습니다. 또한 샘플 두께가 압입 깊이30,66보다 몇 배 더 크다고 가정합니다. 본 연구에서 압흔은 콜라겐이 풍부한 영역에서 비드 크기가 5.7μm이고 샘플 두께가 30μm인 ~2μm였습니다. 따라서 Sneddon의 모델이 적절했습니다. 팁과 기재 사이의 접착력을 고려한 다른 모델(63)은 상이한 유형의 조직에 사용될 수 있다.
AtomicJ의 분석은 샘플의 유한 두께에 대한 보정을 구현하여 영률62,67을 도출하면서 기판의 기여를 최소화합니다. 얻어진 힘 곡선의 분석에서, 우리는 연조직 기관24에 대해 이전에 권장되었던 0.45의 단일 푸 아송 비를 사용했다. 푸아송 비율 값이 0.4에서 0.5로 변경되면 Sneddon 방정식에 따라 계산된 영률 값이 0.893배 감소하기 때문에 이 근사는 영률의 계산된 값에 큰 영향을 미치지 않습니다. CCl4 치료의 서로 다른 기간 간의 영률의 여러 배 차이를 감안할 때 푸아송 비를 근사화하여 발생하는 오류는 미미합니다.
우리는 압입68에 대한 소성 반응보다는 캔틸레버가 제공하는 하중에 대한 조직의 탄성 반응에 관심이 있었기 때문에 강성 값을 계산하기 위해 철수 곡선을 사용했습니다. 연조직의 점탄성 반응으로 인해 피팅 철회 곡선은 영률 과대 평가 될 수 있으므로 명심해야합니다. 또한, 접근 곡선을 사용한 데이터 분석은 섬유성 영역과 대조군 영역 간의 강성 값에서 유사한 추세를 산출하지만 절대값은 그에 따라 더 낮습니다(데이터는 표시되지 않음).
프로토콜을 최적화하는 동안 측정의 재현성에 중요한 몇 가지 단계를 확인했습니다. 첫째, 비드가 캔틸레버에 부착되는 동안 반투명 팁의 대략 중앙에 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이것은 압입 중에 발생할 수있는 기계적 불균형을 방지합니다. 둘째, PFA로 간 고정하는 동안 해동 및 고정에 대한 시간 제한을 엄격히 준수해야합니다. 이 단계의 타이밍을 변경하면 조직 절편의 기계적 특성에 심각한 영향을 미칠 수 있습니다. 셋째, 캔틸레버는 온도 변동으로 인한 강성 값에서 발생하는 아티팩트를 방지하기 위해 지속적인 모니터링 및 동시 온도 값 입력으로 반복적으로 보정되어야 합니다. 마지막으로, 겹쳐진 PBS가 더 오랜 기간 동안 증발 할 수 있으므로 단일 간 절편을 준비 후 3 시간 이상 측정해서는 안됩니다. 독자는 AFM 측정 중에 발생하는 문제를 해결하기 위해 문제 해결 표(표 3)를 참조할 수 있으며, Norman et al.46에서도 자세히 논의됩니다.
표 3: 문제 해결 가이드. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%203v2.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
제시된 프로토콜은 간 조직의 재현 가능한 AFM 프로빙을 허용합니다. 미시적 수준에서 섬유성 간 질환의 발달 및 최종 퇴행에 대한 정보를 밝힐 수 있는 잠재력을 가지고 있으며 만성 간 질환의 진행 중에 형성된 섬유성 흉터 영역을 표적으로 하는 치료법 개발에 기여할 수 있습니다.

간은 유기체 1,2에서 항상성을 유지하는 데 중요한 기관입니다. 만성 간 질환은 전 세계적으로 매년 ~ 2 백만 명의 사망자를 차지합니다3. 그들은 바이러스 감염,자가 면역 질환, 대사 증후군 또는 알코올 남용 관련 질병으로 가장 일반적으로 발생하며 진행성 간 섬유증을 동반합니다. 간 손상은 염증 반응을 유도하여 상처 치유 반응에서 세포 외 기질 (ECM)을 침착시키는 세포의 활성화를 유도합니다. 그러나 만성 모욕이있는 경우 과도한 ECM은 간 내에 해결되지 않은 흉터 조직을 형성하여 간 섬유증, 간경변, 간암의 발병 및 궁극적으로 간부전으로 이어집니다4.
간세포 손상은 즉시 간 경직을 증가시킵니다 5,6. 이것은 간세포 기능에 직접적인 영향을 미치고 간 성상 세포 (HSC) 및 문맥 섬유 아세포를 활성화하며 콜라겐 침착 근섬유 아세포로 전이 분화합니다 7,8. 섬유질 ECM의 침착은 간 경직을 더욱 증가시켜 간 경화 및 매트릭스 생성 세포 활성화의 자가 증폭 피드백 루프를 생성합니다.
따라서 간 경직은 간 질환 예후에 중요한 매개 변수가되었습니다. 생체역학적 조직 특성의 변화는 섬유증이 조직학적 분석에 의해 진단될 수 있는 것보다 더 일찍 검출될 수 있다. 따라서 간 경화도 측정을위한 다양한 기술이 연구 및 임상 응용 모두에서 개발되었습니다. 임상 환경에서 일시적인 탄성 조영술 (TE) 9,10,11,12,13 및 자기 공명 탄성 검사 (MRE) 14,15,16,17,18은 총 간 경직 19을 검사하여 간 손상의 초기 단계를 비 침습적으로 진단하는 데 사용되었습니다.
TE에서는 약한 진폭과 저주파 (50Hz)의 초음파가 간을 통해 전파되고 속도가 측정되어 조직 탄성 계수13을 계산하는 데 사용됩니다. 그러나, 이 기술은 간 주변 조직을 통한 초음파의 부적절한 전달로 인해 복수, 비만 또는 하부 늑간 공간을 갖는 환자에게는 유용하지 않다9.
MRE는 자기 공명 영상 방식을 기반으로하며 20-200Hz 기계적 전단파를 사용하여 간을 표적으로 삼습니다. 이어서, 특정 자기 공명 영상 시퀀스가 조직 내부의 파동을 추적하고 조직 강성(16)을 계산하는데 사용된다. TE 및 MRE 기술 모두로보고 된 강성 값은 조직 학적 METAVIR 점수20을 사용하여 순위가 매겨진 인간 간 샘플의 생검에서 얻은 간 섬유증 정도와 잘 상관 관계가 있습니다 (표 1). TE와 MRE는 또한 연구 목적21,22,23을 위한 설치류 모델의 간 경직도 측정에 적용되었습니다. 그러나 두 방법 모두 전파 전단파에 대한 조직의 반응에서 강성 값을 도출하므로 얻은 값은 조직의 절대 기계적 강성을 반영하지 않을 수 있습니다.
설치류 간의 직접적인 기계적 특성화를 위해 Barnes 등은 폴리 아크릴 아미드 겔24에 간 조직을 매립하는 것을 포함하는 모델-겔-조직 분석 (MGT 분석)을 개발했습니다. 이 젤은 영률을 계산할 수있는 펄스 균일 한 힘에 의해 압축됩니다. MGT 분석은 정상 및 섬유성 간 모두에 적합한 압흔 분석과 양호한 상관관계를 나타낸다(표 1).
표 1 : 벌크 수준의 간 경화도 값. TE와 MRE는 다양한 출처의 간에 대한 압흔 및 MGT 분석을 사용한 간 탄성 계수의 직접적인 생체 외 기계적 측정과 비교했습니다. E와 G의 관계는 E = 2G (1 + v)로 주어지며, 여기서 v는 샘플의 푸 아송 비율입니다. F0 내지 F4는 METAVIR 채점 시스템에서 섬유증 점수를 나타내고, F0은 섬유증이 낮거나 전혀 없음, F4 간경변성 간을 나타낸다. 약어 : TE = 일시적인 탄성; MRE = 자기 공명 탄성; MGT = 모델-겔-조직; E = 탄성 (영) 계수; G = 전단 계수. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%201v2.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
일반적인 간 경직 측정의 주요 단점 중 하나는 간에서 경직 이질성에 대한 세포 수준의 해상도를 제공하지 않는다는 것입니다. 섬유증이 진행되는 동안, 콜라겐이 풍부한 영역은 주변 실질25,26에 비해 더 높은 강성을 나타낸다. 이러한 강성 구배는 국부적으로 상주 세포에 영향을 미치며 HSC 이질성을 유도하는 데 중요한 역할을 합니다(27). 따라서 간 질환 발병 중 국소 기계적 특성의 변화는 섬유증 진행을 더 잘 이해하기 위해 현미경 수준에서 특성화되어야합니다.
AFM을 사용하면 조직의 기계적 특성을 고분해능 및 높은 힘 감도로 측정 할 수 있습니다. AFM은 캔틸레버의 팁을 사용하여 몇 피코네우톤만큼 낮은 힘으로 샘플 표면을 들여쓰기하여 사용된 팁의 형상과 크기에 따라 미세한 또는 나노적 수준에서 변형을 유도합니다. 적용된 변형률에 대한 샘플의 힘 응답은 캔틸레버(28)에서의 처짐으로서 측정된다. 힘-변위 곡선은 캔틸레버의 접근 및 후퇴로부터 수집되며, 이는 샘플(29)의 국부적 강성을 평가하기 위해 적절한 접촉 역학 모델을 장착할 수 있다.
주어진 영역의 강성을 측정하는 것 외에, AFM은 또한 콜라겐 섬유(30,31,32)의 구조와 같은 샘플의 특정 특징에 대한 지형 정보를 제공할 수 있다. 여러 연구에서는 환자 및 마우스 모델 샘플 모두에서 피부 32,33, 폐 34,35, 뇌36, 유방37,38,39, 연골 40 또는 심장41,42,43,44와 같은 다양한 건강하고 병든 조직의 강성을 측정하기 위해 AFM을 적용하는 방법을 설명했습니다. 또한, AFM은 또한 세포 및 세포외 단백질 스캐폴드45,46,47의 강성을 결정하기 위해 시험관내에서 사용되었다.
AFM을 사용한 생물학적 샘플의 기계적 특성 측정은 부드러움과 취약성으로 인해 중요하지 않습니다. 따라서 다양한 연구에서 다양한 조건과 설정을 표준화하여 영률의 변동이 심한 값을 산출했습니다 (Mckee et al.48에 의해 검토 됨). 다른 연조직과 유사하게, 다른 등급의 간 섬유증에서 간 영률 값도 광범위한 변화를 보여줍니다 (표 2). 영률 값의 차이는 AFM 작동 모드, 캔틸레버 팁, 샘플 준비 방법, 샘플 두께, 압입 깊이 및 힘, 측정 중 간 조직 환경 및 분석 방법의 차이로 인해 발생합니다 (표 2).
표 2 : 세포 수준에서의 간 경화도 값. AFM을 사용하여 얻은 간 경화 값은 세포 수준에서 간의 기계적 특성을 설명합니다. 약어 : AFM = 원자력 현미경; E = 탄성 (영) 계수; PFA = 파라포름알데히드; PBS = 인산염 완충 식염수. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%202v2.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
이 논문은 편광 현미경을 사용하여 제공되는 정확한 국소화를 통해 AFM에 의한 간 조직의 콜라겐이 풍부한 섬유성 영역의 Young's 계수의 재현 가능한 측정을 위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 마우스 모델에서 중심엽 방식 (49)으로 콜라겐 침착을 유도하기 위해 사염화탄소 (CCl 4)를 투여하여 인간 간 섬유증50의 중요한 측면을 안정적으로 모방했습니다. 편광된 현미경 이미지는 콜라겐 섬유(51)의 복굴절로 인해 간에서 콜라겐의 시각화를 가능하게 하며, 이는 간소엽(52) 내의 원하는 관심 영역 위에 캔틸레버 팁의 정확한 위치를 가능하게 한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >AFM head</td>
			<td >Bruker</td>
			<td >JPK nanowizard 3</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cameras</td>
			<td >Andor</td>
			<td >Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >The Imagingsource&#160;</td>
			<td >S/N:12310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cantilever</td>
			<td >SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors</td>
			<td>S/N:73750F05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryotome</td>
			<td >Leica&#160;</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epoxy resin glue (Long working time )</td>
			<td >Bison epoxy universal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Melamine beads; diameter, 5.7 um</td>
			<td >Microparticles, GmbH</td>
			<td>MF-R-5.7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td>&#160;IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrophobic&#160; slide marker</td>
			<td >SuperHT</td>
			<td>PAP PEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td >JPK nanowizard&#160; v6.1.151</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >AtomicJ v2.3.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost slides</td>
			<td >Thermoscientific</td>
			<td>ref no. J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >System</td>
			<td >Ubuntu 14.04.5 LTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibration isolation control unit</td>
			<td >Tablestable</td>
			<td>AVI-200-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy

매트릭스 경화는 간 섬유증 진행의 주요 동인 중 하나로 인식되었습니다. 그것은 세포 기능, 분화 및 운동성과 같은 세포 행동의 다양한 측면에 지대한 영향을 미칩니다. 그러나 이러한 과정이 전체 장기에서 균질하지 않기 때문에 세포 수준에서 조직의 기계적 특성 변화를 이해하는 것이 점점 더 중요 해지고 있습니다.
간엽 내 콜라겐이 풍부한 영역의 경화를 모니터링 할 수 있도록이 논문은 원자력 현미경 (AFM)으로 높은 공간 정밀도로 간 조직 탄성 계수를 측정하는 프로토콜을 제시합니다. AFM은 영률(탄성이라고도 함)로 계산되는 국부적 기계적 특성을 특성화할 수 있는 민감한 방법입니다. 편광 현미경과 결합 된 AFM은 조직에서 콜라겐 섬유의 복굴절을 기반으로 섬유증 발생 영역을 구체적으로 찾는 데 사용할 수 있습니다. 제시된 프로토콜을 사용하여, 우리는 섬유성 마우스 간으로부터의 콜라겐이 풍부한 영역과 대조군 마우스의 간에서 상응하는 영역의 강성을 특성화하였다.
콜라겐 양성 영역의 강성의 현저한 증가가 섬유증 발달과 함께 관찰되었습니다. 제시된 프로토콜은 약간 고정 된 간 조직의 사용으로 인해 국소 조직의 기계적 특성의 질병 유발 변화와 이웃 세포의 운명에 미치는 영향에 대한 이해를 높이는 데 사용할 수있는 AFM 측정의 재현성이 높은 방법을 허용합니다.

대조군 마우스 및 경증 또는 진행성 섬유증(각각 3주 또는 6주 동안 CCl4 의 주사에 의해 유도됨,49)으로부터 수득된 경미하게 고정된 30μm 두께의 간 절편을 본 프로토콜에 기재된 바와 같이 AFM으로 프로핑하였다. 중심 정맥에 가까운 콜라겐 섬유는 강성 맵의 측정을 위해 선택되었습니다. CCl4 처리 동물의 콜라겐 섬유가 일반적으로 형성되는 영역에 해당하는 중앙 정맥에 가까운 영역을 대조군 간에서 분석했습니다 (그림 4A). 영률의 분포는 단일 간 섹션 내에서 다양한 대조군 간과 콜라겐이 풍부한 영역에서 재현 가능했습니다(그림 4B: 왼쪽 바이올린 플롯).
CCl 4 처리 동물에서, 콜라겐 침착물의 주변 영역에 해당하는 강성 맵은 대조군 마우스의 동등한 영역에 비해 영률의 유의하게 더 높은 값을 나타냈다 (그림 4B : 1.9 kPa 대 2.6 kPa 대조군에 대한 중앙값 대 3 주 CCl 4 처리 마우스; p = 0.07; 1.9 kPa 대 5.1 kPa 중앙값 대조군에 대한 영 계수 값 대 6 주 CCl4 -처리 된 마우스; p = 0.02). 더욱이, 더 긴 CCl4 처리에서 영률의 값이 유의하게 증가하였다(도 4B; 2.6 kPa 대 5.1 kPa 중앙값 3주 대 6주 CCl4 처리된 마우스; p = 0.04). 이것은 섬유증 진행과 함께 콜라겐 침착 물의 점진적인 경화를 보여주고 AFM 측정은 섬유 형성을 반영합니다.
OCT 포매 간 절편의 장기간 보관이 콜라겐 섬유의 기계적 특성에 미치는 영향을 평가하기 위해 CCl4 처리 마우스 절편에서 콜라겐 섬유의 강성을 측정했으며, 절단 후 슬라이드에서 -80 ° C에서 2 주 또는 3 개월 동안 보관했습니다 (그림 5). AFM 측정은 샘플 절편 후 2주 이내에 측정된 절편에서 얻은 절편에 비해 3개월 동안 보관된 절편에 대해 콜라겐이 풍부한 영역에서 영률의 값이 유의하게 낮은 것으로 나타났습니다(그림 5; 4.7kPa 대 3.6kPa 중앙값 영률 값 2주 대 3개월 보관; p < 0.001). 따라서 OCT 포매 간엽으로부터 절편을 준비한 직후 간 조직의 기계적 특성을 측정하는 것이 중요합니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig04.jpg"> 그림 4: AFM 측정은 장기간의 CCl4 치료와 상관관계가 있는 콜라겐이 풍부한 영역의 점진적인 경화를 보여줍니다. (a) 대조군 마우스와CCl4로 처리된 마우스로부터의 간 절편을 3주 또는 6주 동안 콜라겐이 풍부한 영역의 기계적 특성을 측정하기 위해 사용하였다. 편광 현미경 이미지(왼쪽)에 표시된 간 섹션의 박스형 영역은 AFM 측정을 위해 선택된 콜라겐이 풍부한 스캔 영역(또는 대조군 간의 해당 영역)입니다(30μm x 100μm, 10픽셀 x 36픽셀). 이러한 박스형 영역에 해당하는 컬러 스케일을 가진 영률 맵이 오른쪽에 표시되며, 이 맵의 영률 값의 히스토그램이 포함됩니다. 삽입 산점도는 각 조건에 대해 >10kPa의 값을 표시합니다. 간의 경화는 히스토그램 분포의 점진적인 오른쪽 이동과 삽입 산점도에서 점의 빈도가 높은 것으로 시각화됩니다. 스케일 바 = 20 μm. (B) 바이올린 플롯은 각 조건에 대해 측정된 세 영역(왼쪽)의 탄성 계수 분포와 세 맵 모두(오른쪽)의 요약된 탄성 계수 값을 보여줍니다. 바이올린 플롯은 중앙값 (빨간색 선), 25 번째 백분위 수 및 75번째 백분위 수 (검은 선)를 보여줍니다. 점은 영역 1-3의 개별 맵의 평균값을 나타냅니다. 제시된 p-값은 평균에 대해 수행된 스튜던트 t-검정을 사용하여 계산되었습니다. 약어 : AFM = 원자력 현미경; CCl4 = 사염화탄소. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig05.jpg"> 그림 5: 간 절편을 장기간 보관하면 콜라겐이 풍부한 부위의 경직이 감소합니다. 2주 또는 3개월 동안 -80°C에서 보관된 간 절편(2주 동안 CCl4로 처리된 마우스로부터 제조됨)을 영률을 측정하기 위해 사용하였다. AFM 측정에 사용된 콜라겐이 풍부한 영역을 나타내는 상자가 있는 편광 현미경 이미지(왼쪽). 컬러 스케일이 있는 해당 영률 맵(오른쪽). 히스토그램은 각 샘플의 4-6 영역에서 수집 된 영률 값을 보여줍니다. 삽입 산점도 그래프는 각 조건에 대해 >10kPa의 값을 표시합니다. 스케일 바 = 20 μm. 약어 : AFM = 원자력 현미경; CCl4 = 사염화탄소. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S1: 멜라민 수지 마이크로 비드로 캔틸레버를 개질하는 방법. (A) 그려진 개략도는 캔틸레버의 팁에 구형 비드의 부착을 보여줍니다. 단계별 설명은 섹션 2, 파트 1, AFM 캔틸레버 팁에 5.7μm 비드 부착을 참조하십시오. (B) 캔틸레버 팁에 부착된 구형 5.7μm 비드의 현미경 이미지는 상단(왼쪽) 및 측면도(오른쪽)에서 표시됩니다. 스케일 바 = 20 μm. 약어 : AFM = 원자력 현미경; RT = 실온. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%201.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S2 : AtomicJ의 데이터 분석. (A) AtomicJ에서 강성 맵을 열기 위해 따라야 할 일련의 단계. 프로세스 힘 곡선과 맵(x)을 한 번 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하면 처리 도우미가 열립니다. 추가(y)를 클릭하고 필요한 파일을 선택하여 처리 도우미에 파일을 로드할 수 있습니다. 다음(z)을 클릭하여 다음 단계로 진행합니다. (B) 측정 중에 사용되는 곡선 피팅, 적절한 접촉 역학 모델 및 AFM 설정에 대한 매개 변수. 1-11단계는 프로토콜 단계 3, 섹션 5, 데이터 분석에 자세히 설명된 해당 하위 지점을 참조합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary_fig_2.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S3: AtomicJ에서 분석된 데이터의 개요. 분석된 데이터의 미리 보기에는 강성 맵(왼쪽 위 창), 힘 곡선(오른쪽 위 창) 및 원시 데이터(아래 창)가 표시됩니다. 약어: AFM = 원자력 현미경. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%203.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

우리는 원자력 현미경을 사용하여 정상 및 병든 간에서 콜라겐이 풍부한 영역의 탄성 계수를 측정하는 프로토콜을 제시합니다. 편광 현미경의 동시 사용은 간 절편에서 콜라겐이 풍부한 부위를 국소화하기 위한 높은 공간 정밀도를 제공합니다.

편광 현미경과 결합된 원자력 현미경을 사용한 간 경화도 측정

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

우리의 프로토콜은 콜라겐이 풍부한 부위와 간 섹션의 콜라겐 부족 부위를 구분합니다. 따라서 섬유 형성 과정을 더 자세히 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 편광 현미경을 사용하여 간 섹션에서 콜라겐이 풍부한 영역을 찾는 데 있습니다.우리의 프로토콜은 간 섬유증의 발달에 대한 훌륭한 통찰력을 제공 할 수 있으며 특정 최적화 후 폐와 같은 다른 연조직에도 채택 될 수 있습니다. 시작하려면 섭씨 영하 80도에서 얼어 붙은 간 부분을 제거하고 실온에서 2 분 동안 해동하십시오. PBS에서 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드로 절편을 섭씨 4도에서 10분 동안 고정한 후 PBS로 5회 세척합니다.마지막 세척 후 조직을 사용하여 간 부분 주변의 과도한 PBS를 닦고 소수성 마커 펜으로 간 부분 주위에 약 2 x 4cm의 경계를 표시하십시오. 샘플을 PBS로 덮은 다음 샘플을 AFM 스테이지에 로드하고 AFM 헤드로 덮습니다. 원자력 현미경 또는 AFM 소프트웨어에서 설정 탭으로 이동하여 자동 저장에 체크 표시를 하여 모든 파일을 자동으로 저장합니다.그런 다음 설정 탭으로 이동하여 설정 저장을 클릭하여 측정 파일을 저장할 파일 이름과 디렉토리를 지정합니다. 레이저를 켜고 접근 키를 클릭하여 AFM 캔틸레버로 조직 표면에 접근하십시오. 접근이 완료된 후, 후퇴 키를 한 번 클릭하여 캔틸레버 팁을 집어넣으면 캔틸레버가 피에조 범위의 상단 끝으로 후퇴됩니다.필요한 경우 AFM 헤드의 손잡이를 사용하여 감지기를 다시 정렬합니다. 레이저를 끕니다. 이제 팁이 목표의 초점에 있습니다.다음으로, 액세서리 탭을 클릭하고 직접 오버레이 광학 교정을 선택하여 현미경의 광학 필드를 AFM 측정 맵으로 오버레이합니다. 다음 창에서 다음을 클릭하여 특정 영역을 스캔하는 캔틸레버의 일련의 이미지를 촬영합니다. 다음을 다시 클릭하여 다음 창으로 이동합니다.첫 번째 이미지에서 캔틸레버 끝의 중심을 수동으로 클릭하여 소프트웨어에서 팁 위치를 나타냅니다. 팁 위치를 나타내는 원은 정확도를 높이기 위해 반경을 표시하여 크기를 조작 할 수 있습니다. 보정을 클릭하면 모든 이미지에서 캔틸레버 팁 위치가 자동으로 감지됩니다.이미지를 통해 팁 감지의 정확성을 확인하십시오. 다음을 클릭하고 마침을 클릭하여 광학 오버레이를 완료합니다. 그런 다음 스테이지를 이동하여 편광 이미지를 사용하여 데이터 뷰어 탭에 표시되는 녹색 상자 안에 콜라겐이 풍부한 영역을 배치합니다.그리드 탭 아래에 영역을 정의하여 콜라겐이 풍부한 영역을 선택한 다음 지정된 녹색 상자 안의 마우스 왼쪽 단추를 길게 눌러 데이터 뷰어 탭에서 사각형을 만듭니다. 새 스캔 영역 확인을 클릭하여 선택한 영역을 측정 영역으로 설정합니다. 피드백 루프의 매개 변수를 설정합니다.I 게인을 50헤르츠로 설정하고 P 게인을 0.001로 설정합니다. 그런 다음 설정점을 1나노 뉴턴으로 설정합니다. 연구 된 재료의 기계적 특성과 캔틸레버의 강성에 따라 상대 설정점 값을 선택하십시오.힘 곡선을 적절하게 맞추기 위해 기준선을 지정합니다. 그런 다음 샘플의 표면 지형에 따라 Z 축에서 캔틸레버 이동 길이를 선택하십시오. Z 이동을 일정한 지속 시간으로 설정합니다.연장 시간을 1초로 설정하고 확장 및 철회 지연을 0으로 설정합니다. 샘플 속도를 5, 000 헤르츠로 설정하십시오. Z 폐쇄 루프 앞에 체크 표시를 하여 측정 중에 샘플과 캔틸레버 팁 사이의 거리를 자동으로 조정합니다.그런 다음 결합 버튼을 선택 해제하여 전동 스테이지 컨트롤을 해제합니다. 레이저를 켜고 캔틸레버로 샘플에 접근하십시오. 스캔 시작을 클릭하여 힘 거리 곡선을 수집합니다.오픈 소스 소프트웨어 AtomicJ를 사용하여 수집된 데이터를 분석합니다. 힘 곡선을 프로그램에 로드하려면 프로세스 힘 곡선 및 맵 아이콘을 클릭합니다. 그런 다음 처리 도우미에서 추가 버튼을 클릭하여 분석할 맵을 추가합니다.지도가로드 된 후 다음을 클릭하십시오. 다음 창에서 처리 설정을 지정합니다. 피팅 곡선 파라미터 세트를 사용하여 샘플과 캔틸레버 사이의 접촉점을 자동으로 추정하려면 접촉점의 자동 추정을 사용하십시오.캔틸레버와 샘플 사이의 접촉점을 고전적인 초점 그리드 방법으로 결정하십시오. 추정 방법을 모델 독립적 방법으로 선택하여 데이터 분석 최적화 중에 경험적으로 결정해야 하는 측정된 힘 곡선의 품질을 기반으로 접촉점을 가장 잘 결정할 수 있습니다. 모델 피팅을 위해 클래식 모델을 클래식 L 2로 사용하여 힘 압입 곡선을 피팅합니다.모델의 피팅을 인출 곡선에 설정합니다. 포아송 비율을 간과 같은 연조직에 권장되는 대로 0.45로 설정합니다. 기준선 차수 3과 접촉 차수 1을 사용하여 곡선의 피팅을 설정합니다.모델에서 곡선의 편차 척도를 기반으로 다항식 피팅 정도를 변경합니다. 인출 곡선을 피팅하는 데 사용되는 모형을 Sneddon 모형으로 선택합니다. 구형 팁의 반경을 2.9 마이크로 미터로 채 웁니다.읽기를 활성화하여 데이터 파일에서 스프링 상수와 invOLS를 로드한 다음 마침을 클릭합니다. 데이터 분석 후 힘 곡선을 통과합니다. 캔틸레버가 간 섹션의 표면에 잘못 접근 한 힘 곡선을 제외하십시오.이 곡선은 노이즈가 높고 비정상적인 모양을 가지고 있습니다. 그런 다음 데이터를 복사하거나 내보낼 수 있습니다. 이 연구에서, 대조군 마우스와 사염화탄소 주입에 의해 유도 된 경증 및 진행성 섬유증을 가진 마우스로부터 얻은 경미하게 고정 된 간 절편을 AFM으로 조사했다.사염화탄소 마우스의 콜라겐 섬유가 일반적으로 형성되는 영역에 해당하는 중앙 정맥에 가까운 영역을 대조군 간에서 분석했습니다. 영률의 분포는 대조군 간 및 단일 간 섹션 내의 콜라겐이 풍부한 영역의 여러 영역에서 재현 가능했습니다. 사염화탄소 처리된 마우스에서, 콜라겐 침착물의 중심 주변 영역에 해당하는 강성 맵은 대조군 마우스의 동등한 영역에 비해 영률의 유의하게 더 높은 값을 나타내었다.또한, 더 긴 치료로 영률의 값이 크게 증가했다. 간 절편의 장기간 보관이 콜라겐 섬유의 기계적 특성에 미치는 영향도 평가되었습니다. AFM 측정은 2 주 이내에 얻은 것과 비교하여 3 개월 동안 보관 된 절편에 대한 콜라겐이 풍부한 영역에서 영률의 값이 유의하게 낮았다.간 절편의 고정 시간은 간 절편의 기계적 특성을 크게 결정합니다. 프로토콜에 명시된 시간 간격을 엄격히 준수하는 것이 좋습니다. 프로토콜에서 특정 최적화 후, 주어진 방법은 편광 현미경으로 검출 할 수있는 상당한 콜라겐 침착을 나타내는 모든 연조직에 사용될 수 있습니다.주어진 기술은 연구자에게 건강과 질병에 걸친 간 메커니즘을 연구하는 통일되고 편리한 프로토콜을 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

연구

생물학

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

세포는 형광 현미경 Electrofusion와 시각

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

기계 자극에 라이브 세포 응답 통합 광학과 원자 힘 현미경에 의해 연구

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

Spectrally 해결된 두 광자 현미경을 사용하여 G 단백질 결합 수용체 상호 작용의 생체내 부량에서

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

원자 힘 현미경을 사용하여 폐 조직의 미세 기계적 특성

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

3&#39;UTR - 기자의 구성과 microRNA를 사용하여 LightSwitch의 루시페라제 분석 시스템과 인간 microRNAs의 확인 대상이 자기편 세포의 모방

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

단일 비리온 원자력 현미경 검사및 초분해성 형광 이미징을 위한 샘플 준비

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

의 강성 측정<em&gt; 전의 VIVO</em원자 힘 현미경을 사용하여&gt; 마우스 대동맥

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

공 초점 현미경으로 리간드 - 활성화 된 G 단백질 결합 수용체 내재화 검출

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...