Name: measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Grant Agency of the Czech Republic (18-02699S), Institutional Research Project of the Czech Academy of Sciences (RVO 68378050) og MEYS CR-prosjektet NICR EXCELES (LX22NPO05102). CIISB, Instruct-CZ Centre of Instruct-ERIC EU-konsortium, finansiert av MEYS CR infrastrukturprosjekt LM2018127 og European Regional Development Fund-Project "UP CIISB" (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) støttet målingene ved CF Nanobiotechnology, CEITEC MU, økonomisk. Vi anerkjenner også kjernefasiliteten for lysmikroskopi, IMG CAS, Praha, Tsjekkia, støttet av MEYS (LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) og RVO: 68378050-KAV-NPUI, for deres støtte med mikroskopiavbildningen som presenteres her.

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.

Den presenterte protokollen gir en trinnvis reproduserbar metode for AFM-måling av normalt og fibrotisk muselevervev. Koblet polarisasjonsmikroskopi gir høy romlig presisjon og muliggjør visualisering av kollagenfibre på grunn av deres birefringence. Videre er det gitt en detaljert beskrivelse av analysen av de oppnådde kraftkurvene. AFM-stivhetsmåling kan utføres på mobilnivå, noe som gjør at lokale endringer i levervevets mekaniske egenskaper på grunn av utvikling av fibrotisk sykdom kan overvåkes. Leverfibrose er ikke en homogen prosess som påvirker hele organet. Tvert imot er områder med kollagenrik fibrotisk septa ispedd områder med lave eller ingen kollagenavsetninger. Dermed er stivhetsendringer spesifikke for det lokale mikromiljøet og påvirker bare celler lokalt i kontakt med områder som er skadet av skade. Denne mikroskalaen av stivhet heterogenitet er også tydelig i detaljene i AFM Youngs modulkart, hvor punkter med høy stivhet grenser til områdene med nesten normal stivhet. Denne variasjonen viser at selv kollagen arrvevsområde ikke er mekanisk homogent og krever AFM-måling for å kunne karakteriseres på cellenivå (figur 4).
Den presenterte protokollen tillater målinger av leverstivhet ved AFM uavhengig av leversamlingen, da hele leverlappene innebygd i OCT kan lagres i en lengre periode ved -80 ° C. Når vevet er seksjonert, anbefaler vi imidlertid å måle prøvene innen ~ 2 uker, da vi har observert en gradvis mykning av vevsseksjoner lagret i lengre perioder (figur 5).
AFM utstyrt med polarisasjonsmikroskopi gjør det mulig å nøyaktig lokalisere interesseområdet i leveren lobule struktur. Det har imidlertid også noen begrensninger som må vurderes når man tolker resultatene. Stivhetsverdiene oppnådd her ble målt ved romtemperatur. Vi antar at effekten av temperatur på de mekaniske egenskapene til bløtvev vil være liten; Dette kan imidlertid være en av årsakene til forskjeller mellom de rapporterte in vivo-verdiene av mekaniske egenskaper til levervev og verdiene i denne studien.
Videre tillater denne protokollen AFM-analyse av levervev i opptil 3 timer, noe som krever mild fiksering av vevet. Den milde fiksering av vevsseksjoner, samt fryse-tine-syklusen, vil mest sannsynlig påvirke de absolutte verdiene til Youngs modul. Dermed kan de rapporterte verdiene til Youngs moduli avvike fra in vivo-verdier . Ytterligere studier er nødvendig for å optimalisere protokollen for måling av absolutte verdier av Youngs modul fra leverseksjoner, som kan oppnås ved en annen metode for fiksering av levervev64.
Likevel observerte vi økende stivhet av kollagenrike områder i leveren til mus behandlet med CCl4 i 3 uker sammenlignet med 6 uker. Slike forandringer samsvarer med fibroseprogresjon ved langvarig skade (figur 4) og viser at relative forskjeller kan undersøkes mellom ulike behandlinger med presentert protokoll. Dette er i samsvar med observasjonene til Calò og medarbeidere, som viste at mildt fikserte leverseksjoner viser lignende forskjeller i stivhetsverdier mellom kollagenrike og kollagenfattige områder som i ferskt vev25.
Vi brukte SD-qp-BioT-TL-10 cantilever (teoretisk fjærkonstant ~ 0,09 N / m) modifisert med en 5,7 μm diameter sfærisk spiss for å minimere mekanisk forstyrrelse av levervevet under målinger. En 5,7 μm perle muliggjorde tilstrekkelig innrykk av prøven for å undersøke stivheten samtidig som den bevarte integriteten. En perle med mindre diameter kan brukes, etter flere optimaliseringer, for å få høyere oppløsning i stivhetskartene, men kan føre til ytterligere overestimering av Youngs modulverdier (for flere detaljer, se Crichton et al.65). Ved hjelp av det spesifiserte cantilever-perleensemblet var vi i stand til å karakterisere prøvestivhet i et bredt spekter, fra titalls enheter av Pa til ~ 100 kPa.
Sneddons modell ble brukt til å utlede Youngs modul fra kraftkurver, da den tillater analyse av dype innrykk med kolloidale sonder62. Sneddons modell, i motsetning til Hertz modell, lider ikke av begrensningen at kontaktradiusen må være mye mindre enn kuleradiusen. Det antas videre at prøvetykkelsen er flere ganger større enn innrykksdybden30,66. I denne studien var innrykket ~2 μm med en dråpestørrelse på 5,7 μm og en prøvetykkelse på 30 μm i kollagenrike områder; dermed var Sneddons modell passende. Andre modeller63 med tanke på adhesjonskraften mellom spiss og substrat kan brukes til forskjellige typer vev.
Analyse i AtomicJ implementerer korreksjoner for den endelige tykkelsen på prøvene for å minimere bidraget fra et substrat mens Youngs modul62,67 utledes. I analysen av de oppnådde kraftkurvene brukte vi et enkelt Poissons forhold på 0,45, som tidligere er anbefalt for bløtvevsorganer24. Denne tilnærmingen har ingen signifikant effekt på beregnede verdier av Youngs modul, da endringen i verdien av Poissons forhold fra 0,4 til 0,5 bare resulterer i en 0,893x reduksjon i Youngs modulverdier beregnet i henhold til Sneddons ligning. Gitt de mange forskjellene i Youngs modul mellom de forskjellige varighetene av CCl 4-behandlinger, er feilene som produseres ved å tilnærme Poissons forhold bare marginale.
Vi brukte tilbaketrekningskurver for å beregne stivhetsverdier, da vi var interessert i vevets elastiske respons på belastningen fra utkrageren i stedet for i plastresponsen på innrykk68. På grunn av den viskoelastiske responsen til bløtvevet, kan passende tilbaketrekningskurver overvurdere Youngs modul, noe som bør huskes. Videre har vi observert at dataanalyse med tilnærmingskurver gir tilsvarende trender i stivhetsverdier mellom fibrotiske områder og kontrollområder, selv om absoluttverdiene er tilsvarende lavere (data ikke vist).
Mens vi optimaliserte protokollen, identifiserte vi flere trinn som er kritiske for reproduserbarheten av målingene. For det første er det viktig å sikre at perlen er omtrent i midten av den gjennomsiktige spissen mens den festes til utkrageren. Dette forhindrer mulig mekanisk ubalanse under innrykk. For det andre, under leverfiksering med PFA, er det nødvendig å følge tidsgrensene for tining og fiksering strengt. Endring av tidspunktet for dette trinnet kan ha alvorlig innvirkning på de mekaniske egenskapene til vevsseksjoner. For det tredje må utkragingen kalibreres gjentatte ganger med kontinuerlig overvåking og inntasting av samtidige temperaturverdier for å unngå artefakter som oppstår i stivhetsverdier på grunn av temperatursvingninger. Sist, en enkelt leverseksjon bør ikke måles i mer enn 3 timer fra forberedelse, da overlaid PBS kan fordampe over lengre perioder. Leserne kan se feilsøkingstabellen (tabell 3) for å løse problemer som oppstod under AFM-målingen, også diskutert i lengde i Norman et al.46.
Tabell 3: Feilsøkingsveiledning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%203v2.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Den presenterte protokollen tillater reproduserbar AFM-sondering av levervev. Det har potensial til å avsløre informasjon om utvikling og eventuell regresjon av fibrotisk leversykdom på mikroskopisk nivå og kan bidra til utvikling av terapier rettet mot fibrotiske arrregioner dannet under utviklingen av kronisk leversykdom.

Leveren er et viktig organ for å opprettholde homeostase i organismer 1,2. Kroniske leversykdommer står for ~ 2 millioner dødsfall over hele verden årlig3. De stammer oftest som virusinfeksjoner, autoimmune sykdommer, metabolske syndromer eller alkoholmisbruksrelaterte sykdommer og ledsages av progressiv leverfibrose. Leverskade fremkaller en inflammatorisk respons, noe som fører til aktivering av celler som deponerer ekstracellulær matriks (ECM) i en sårhelingsrespons. Imidlertid, i nærvær av en kronisk fornærmelse, danner overskytende ECM uløst arrvev i leveren, noe som fører til utvikling av leverfibrose, skrumplever, leverkarsinom og til slutt til leversvikt4.
Hepatocyttskade resulterer umiddelbart i økt leverstivhet 5,6. Dette påvirker direkte hepatocyttfunksjonen, aktiverer hepatiske stellatceller (HSC) og portalfibroblaster, og resulterer i transdifferensiering til kollagenavsettende myofibroblaster 7,8. Avsetningen av fibrøs ECM øker ytterligere leverstivheten, og skaper en selvforsterkende tilbakemeldingssløyfe av leverstivning og matriksproduserende celleaktivering.
Leverstivhet har dermed blitt en viktig parameter i leversykdomsprognosen. Endringen i biomekaniske vevsegenskaper kan oppdages tidligere enn fibrose kan diagnostiseres ved histologisk analyse. Derfor har ulike teknikker for måling av leverstivhet blitt utviklet i både forskning og kliniske applikasjoner. I kliniske omgivelser har forbigående elastografi (TE) 9,10,11,12,13 og magnetisk resonanselastografi (MRE)14,15,16,17,18 blitt ansatt for å ikke-invasivt diagnostisere tidlige stadier av leverskade ved å undersøke brutto leverstivhet 19.
I TE forplantes ultralydbølger med mild amplitude og lav frekvens (50 Hz) gjennom leveren, og deres hastighet måles, som deretter brukes til å beregne vevselastisk modul13. Imidlertid er denne teknikken ikke nyttig for pasienter med ascites, fedme eller lavere interkostale rom på grunn av feil overføring av ultralydbølgene gjennom vevet rundt leveren9.
MRE er basert på magnetisk resonans imaging modalitet og bruker 20-200 Hz mekaniske skjærbølger for å målrette leveren. En spesifikk magnetisk resonansavbildningssekvens brukes deretter til å spore bølgene inne i vevet og for å beregne vevsstivheten16. Stivhetsverdier rapportert med både TE- og MRE-teknikker korrelerer godt med graden av leverfibrose fra biopsier av humane leverprøver rangert ved histologisk METAVIR-skår20 (tab 1). TE og MRE er også tilpasset for måling av leverstivhet i gnagermodeller for forskningsformål21,22,23. Men da begge metodene avleder stivhetsverdiene fra vevets respons på de forplantende skjærbølgene, kan de oppnådde verdiene ikke gjenspeile vevets absolutte mekaniske stivhet.
For en direkte mekanisk karakterisering av gnagerlever utviklet Barnes og medarbeidere en modell-gel-vevsanalyse (MGT-analyse) som involverte innebygging av levervev i polyakrylamidgel24. Denne gelen komprimeres av en pulserende jevn kraft som Youngs modul kan beregnes fra. MGT-analysen viser god korrelasjon med en innrykksanalyse tilpasset både normal og fibrotisk lever24 (tab 1).
Tabell 1: Leverstivhetsverdier ved bulknivå. TE og MRE sammenlignet med direkte ex vivo mekaniske målinger av leverelastisk moduli ved bruk av innrykk og MGT-analyser for lever fra forskjellige kilder. Forholdet mellom E og G er gitt ved E = 2G (1 + v), hvor v er Poissons forhold til prøven; F0 til F4 representerer fibroseskår i METAVIR scoring system, med F0 som angir lav eller ingen fibrose og F4 cirrhotisk lever. Forkortelser: TE = forbigående elastografi; MRE = magnetisk resonans elastografi; MGT = modell-gel-vev; E = elastisk (Youngs) modul; G = skjærmodul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%201v2.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
En av de største ulempene med generiske leverstivhetsmålinger er at de ikke gir cellenivåoppløsning av stivhet heterogenitet i leveren. Under utviklingen av fibrose viser kollagenrike områder høyere stivhet sammenlignet med den omkringliggende parenchymen25,26. Denne stivhetsgradienten påvirker lokalt de bosatte cellene og spiller en viktig rolle i å drive HSC-heterogenitet27. Dermed må endringer i lokale mekaniske egenskaper under utvikling av leversykdom karakteriseres på mikroskopisk nivå for bedre å forstå fibroseprogresjon.
AFM gjør at de mekaniske egenskapene til vev kan måles med høy oppløsning og høy kraftfølsomhet. AFM bruker spissen av en utkrager for å rykke inn overflaten av en prøve med krefter så lave som flere piconewtons, og induserer en deformasjon på et mikroskopisk eller nanoskopisk nivå basert på geometrien og størrelsen på spissen som brukes. Kraftresponsen til prøven til den påførte belastningen måles deretter som avbøyningen i utkrageren28. Kraftforskyvningskurver hentes fra tilnærming og tilbaketrekning av utkrageren, som kan utstyres med passende kontaktmekaniske modeller for å evaluere den lokale stivheten til prøven29.
I tillegg til å måle stivheten til et gitt område, kan AFM også gi topografisk informasjon om spesifikke egenskaper i prøven, for eksempel strukturen av kollagenfibre30,31,32. Flere studier har beskrevet anvendelsen av AFM for å måle stivheten til forskjellige sunne og syke vev, for eksempel hud 32,33, lunge 34,35, hjerne36, bryst37,38,39, brusk 40 eller hjerte41,42,43,44 fra både pasient- og musemodellprøver. Videre har AFM også blitt brukt in vitro for å bestemme stivheten til celler og ekstracellulære proteinstillaser45,46,47.
Måling av de mekaniske egenskapene til biologiske prøver ved bruk av AFM er ikke-triviell på grunn av deres mykhet og skjøthet. Dermed har ulike studier standardisert forskjellige forhold og innstillinger, noe som gir mye svingende verdier av Youngs moduli (gjennomgått av Mckee et al.48). I likhet med annet bløtvev viser også leveren Youngs modulverdier ved ulike grader av leverfibrose stor variasjon (tab 2). Forskjellene i Youngs modulverdier stammer fra forskjeller i modus for AFM-drift, utkragetips, prøveprepareringsmetode, prøvetykkelse, innrykksdybde og krefter, levervevsmiljø under måling og analysemetode (tabell 2).
Tabell 2: Leverstivhetsverdier på cellenivå. Leverstivhetsverdier oppnådd ved bruk av AFM beskriver leverens mekaniske egenskaper på mobilnivå. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; E = elastisk (Youngs) modul; PFA = paraformaldehyd; PBS = fosfatbufret saltvann. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%202v2.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Dette papiret beskriver en protokoll for reproduserbar måling av Youngs moduli av kollagenrike fibrotiske områder i levervev ved AFM med en presis lokalisering gitt ved bruk av polarisasjonsmikroskopi. Vi administrerte karbontetraklorid (CCl4) for å indusere kollagenavsetning på en sentrilobulær måte49 i en musemodell, som pålitelig etterligner viktige aspekter ved human leverfibrose50. Polariserte mikroskopiske bilder muliggjør visualisering av kollagen i leveren på grunn av birefringence av kollagenfibre51, noe som muliggjør nøyaktig posisjonering av utkragespissen over ønsket interesseområde i hepatisk lobule52.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >AFM head</td>
			<td >Bruker</td>
			<td >JPK nanowizard 3</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cameras</td>
			<td >Andor</td>
			<td >Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >The Imagingsource&#160;</td>
			<td >S/N:12310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cantilever</td>
			<td >SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors</td>
			<td>S/N:73750F05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryotome</td>
			<td >Leica&#160;</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epoxy resin glue (Long working time )</td>
			<td >Bison epoxy universal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Melamine beads; diameter, 5.7 um</td>
			<td >Microparticles, GmbH</td>
			<td>MF-R-5.7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td>&#160;IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrophobic&#160; slide marker</td>
			<td >SuperHT</td>
			<td>PAP PEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td >JPK nanowizard&#160; v6.1.151</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >AtomicJ v2.3.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost slides</td>
			<td >Thermoscientific</td>
			<td>ref no. J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >System</td>
			<td >Ubuntu 14.04.5 LTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibration isolation control unit</td>
			<td >Tablestable</td>
			<td>AVI-200-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy

Matrix stivning har blitt anerkjent som en av de viktigste driverne for progresjon av leverfibrose. Det har dype effekter på ulike aspekter av celleadferd som cellefunksjon, differensiering og motilitet. Men da disse prosessene ikke er homogene gjennom hele orgelet, har det blitt stadig viktigere å forstå endringer i de mekaniske egenskapene til vev på mobilnivå.
For å kunne overvåke avstivningen av kollagenrike områder i leverlappene, presenterer dette papiret en protokoll for måling av levervevselastisk moduli med høy romlig presisjon ved atomkraftmikroskopi (AFM). AFM er en sensitiv metode med potensial til å karakterisere lokale mekaniske egenskaper, beregnet som Youngs (også referert til som elastisk) modul. AFM kombinert med polarisasjonsmikroskopi kan brukes til å spesifikt lokalisere områdene av fibroseutvikling basert på birefringence av kollagenfibre i vev. Ved hjelp av den presenterte protokollen karakteriserte vi stivheten i kollagenrike områder fra fibrotiske muselever og tilsvarende områder i leveren til kontrollmus.
En fremtredende økning i stivheten i kollagenpositive områder ble observert med fibroseutvikling. Den presenterte protokollen tillater en svært reproduserbar metode for AFM-måling, på grunn av bruk av mildt fast levervev, som kan brukes til å fremme forståelsen av sykdomsinitierte endringer i lokale vevsmekaniske egenskaper og deres effekt på skjebnen til naboceller.

Mildt faste, 30 μm tykke leverseksjoner oppnådd fra kontrollmus og fra mus med mild eller avansert fibrose (indusert ved injeksjon av CCl4 i henholdsvis 3 uker eller 6 uker,49) ble undersøkt med AFM som beskrevet i denne protokollen. Kollagenfibre nær sentrale vener ble valgt for måling av stivhetskart. Områder nær de sentrale venene, som tilsvarer områdene der kollagenfibre i CCl 4-behandlede dyr vanligvis dannes, ble analysert i kontrolllever (figur 4A). Fordelingen av Youngs moduli var reproduserbar på tvers av forskjellige kontrolllever og kollagenrike områder innenfor en enkelt leverseksjon (figur 4B: venstre fiolinplott).
I CCl 4-behandlede dyr viste stivhetskart tilsvarende pericentralområdene av kollagenavsetninger signifikant høyere verdier av Youngs moduli sammenlignet med ekvivalente områder hos kontrollmus (figur 4B: 1,9 kPa vs. 2,6 kPa median Youngs modulverdier for kontroll vs. 3 ukers CCl 4-behandlet mus; p = 0,07; 1,9 kPa vs. 5,1 kPa median Youngs modulverdier for kontroll vs. 6 uker CCl4 -behandlet mus; p = 0,02). Videre var det en signifikant økning i verdiene av Youngs moduli med lengre CCl 4-behandling (figur 4B; 2,6 kPa vs. 5,1 kPa median Youngs modulverdier for 3 uker vs. 6 ukers CCl4-behandlet mus; p = 0,04). Dette viser en gradvis avstivning av kollagenavsetninger med fibroseprogresjon og at AFM-målinger reflekterer fibrogenesen.
For å evaluere effekten av langvarig lagring av OCT-innebygde leverseksjoner på de mekaniske egenskapene til kollagenfibre, målte vi stivheten til kollagenfibre i seksjoner av CCl 4-behandlede mus, som ble lagret ved -80 ° C i 2 uker eller 3 måneder på lysbildet etter kutting (figur 5). AFM-målinger viste signifikant lavere verdier av Youngs moduli i kollagenrike områder for seksjoner lagret i 3 måneder sammenlignet med de som ble oppnådd fra seksjoner målt innen 2 uker etter prøveseksjonering (figur 5; 4,7 kPa vs. 3,6 kPa median Youngs modulverdier i 2 uker vs. 3 måneders lagring; p < 0,001). Det er derfor viktig å måle de mekaniske egenskapene til levervevet kort tid etter at seksjonene er fremstilt fra de OCT-innebygde leverlappene.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig04.jpg"> Figur 4: AFM-målinger viser progressiv avstivning av kollagenrike områder som korrelerer med langvarig CCl4-behandling. (A) Leverseksjoner fra kontrollmus og mus behandlet med CCl4 i 3 uker eller 6 uker ble brukt til å måle de mekaniske egenskapene til kollagenrike områder. De boksede områdene av leverseksjoner vist i de polariserte mikroskopibildene (venstre) er kollagenrike skanneområder (eller tilsvarende regioner i kontrollleveren) valgt for AFM-målinger (30 μm x 100 μm, 10 piksler x 36 piksler). Youngs modulkart med fargeskalaer som tilsvarer disse boksede områdene vises til høyre, inkludert histogrammer av Youngs modulverdier fra disse kartene; innfelte spredningsdiagrammer viser verdier >10 kPa for hver betingelse. Avstivningen av leveren visualiseres som en gradvis høyreforskyvning i histogramfordelingen og en høyere frekvens av punkter i det innfelte spredningsplottet. Skalalinje = 20 μm. (B) Fiolinplott viser fordelingen av elastisk moduli fra tre områder målt for hver tilstand (venstre) og oppsummerte elastiske modulverdier fra alle tre kartene (høyre). Fiolinplott viser medianen (rød linje), 25. persentil og 75. persentil (svarte linjer); Prikker representerer middelverdiene for individuelle kart fra område 1-3. De presenterte p-verdiene ble beregnet ved hjelp av en Student t-test utført på gjennomsnitt. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; CCl4 = karbontetraklorid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig05.jpg"> Figur 5: Utvidet lagring av leverseksjoner fører til en reduksjon i stivhet i kollagenrike områder. Leverseksjoner (tilberedt fra mus behandlet med CCl4 i 2 uker) lagret ved -80 °C i 2 uker eller 3 måneder ble brukt til å måle Youngs modul. Polariserte mikroskopibilder (til venstre) med bokser som indikerer de kollagenrike områdene som brukes til AFM-måling (30 μm x 100 μm, 10 piksler x 36 piksler). Tilsvarende Youngs modulkart med fargeskalaer (høyre). Histogrammer viser Youngs modulverdier samlet inn fra 4-6 områder i hver prøve; innfelte spredningsgrafer viser verdier >10 kPa for hver betingelse. Skala bar = 20 μm. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; CCl4 = karbontetraklorid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Supplerende figur S1: Metode for å modifisere cantilever med en melaminharpiks mikroperle. (A) Tegnet skjematisk illustrerer festingen av en sfærisk perle til spissen av utkrageren. For en trinnvis beskrivelse, se seksjon 2, del 1, Vedlegg av en 5.7 μm perle til AFM cantilever tip. (B) Mikroskopibilde av en sfærisk 5,7 μm perle festet til utkragespissen vist fra topp (venstre) og lateral visning (høyre). Skala barer = 20 μm. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; RT = romtemperatur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%201.pdf" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende figur S2: Dataanalyse i AtomicJ. (A) Sekvensen av trinn som skal følges for å åpne stivhetskart i AtomicJ. Et enkelt venstreklikk på prosesskraftkurvene og kartene (x) åpner behandlingsassistenten. Filer kan lastes til behandlingsassistenten ved å klikke på legg til (y) og velge de nødvendige filene. Klikk på neste (z) for å gå videre til neste trinn. (B) Parametere for kurvetilpasning, passende kontaktmekanikkmodell og AFM-innstillinger som brukes under måling. Trinn 1-11 refererer til tilsvarende underpunkter beskrevet i protokoll trinn 3, avsnitt 5, Dataanalyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary_fig_2.pdf" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende figur S3: Oversikt over analyserte data i AtomicJ. Forhåndsvisningen av analyserte data viser stivhetskart (øvre venstre vindu), kraftkurver (øvre høyre vindu) og rådata (nedre vindu). Forkortelse: AFM = atomkraftmikroskopi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%203.pdf" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy at JoVE.com

Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

Vi presenterer en protokoll for å måle elastisk moduli av kollagenrike områder i normal og syk lever ved hjelp av atomkraftmikroskopi. Samtidig bruk av polarisasjonsmikroskopi gir høy romlig presisjon for lokalisering av kollagenrike områder i leverseksjonene.

Måling av leverstivhet ved bruk av atomkraftmikroskopi kombinert med polarisasjonsmikroskopi

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

Vår protokoll gir et skille mellom kollagenrike og kollagenfattige områder i leverseksjonene. Det kan dermed brukes til å studere prosessene for fibrogenese i større detaljer. Den største fordelen med teknikken ligger i bruk av polariserende mikroskopi for å lokalisere kollagenrike områder i leverseksjonene.Våre protokoller kan gi god innsikt i utviklingen av leverfibrose, og det kan også tas i bruk for andre bløtvev som lunger etter visse optimaliseringer. For å begynne med, fjern de frosne leverseksjonene fra minus 80 grader Celsius, og tine dem ved romtemperatur i to minutter. Fest seksjonene med iskaldt 4% paraformaldehyd i PBS i 10 minutter ved fire grader Celsius, etterfulgt av vask fem ganger med PBS.Etter siste vask, tørk overflødig PBS rundt leverseksjonen ved hjelp av vev, og merk en grense på omtrent to til fire centimeter rundt leverseksjonen med en hydrofob markørpenn. Dekk prøven med PBS, legg deretter prøven på AFM-trinnet, og dekk den med AFM-hodet. I atomkraftmikroskopien eller AFM-programvaren, gå til oppsettfanen og merk av for automatisk lagring for automatisk lagring av alle filer.Angi deretter filnavnet og katalogen for lagring av målefilene ved å gå til oppsettfanen og klikke på lagringsinnstillinger. Tilnærm vevsoverflaten med AFM-utkrageren ved å slå på laseren og klikke på tilnærmingstasten. Etter at tilnærmingen er fullført, trekk inn utkragespissen ved å klikke på tilbaketrekningstasten en gang, som trekker utkrageren til den øverste enden av piezo-serien.Juster om nødvendig detektoren ved hjelp av knotter på AFM-hodet. Slå av laseren. Tipset er nå i fokus for målet.Deretter legger du over mikroskopets optiske felt med AFM-målekart ved å klikke på tilbehørsfanen og velge optisk kalibrering med direkte overlegg. I det påfølgende vinduet klikker du neste for å ta en serie bilder av utkrageren som skanner et bestemt område. Klikk neste igjen for å gå til neste vindu.I det første bildet klikker du på midten av spissen av utkrageren manuelt for å skildre spissposisjonen i programvaren. Sirkelen som viser spissposisjonen kan manipuleres i størrelse ved å indikere radiusen for å øke nøyaktigheten. Klikk kalibrer for å oppdage utkragespissposisjonen i alle bilder automatisk.Bekreft nøyaktigheten av tipsdeteksjonen ved å gå gjennom bildene. Klikk neste, og fullfør deretter for å fullføre det optiske overlegget. Deretter flytter du scenen for å plassere et kollagenrikt område inne i den grønne boksen, synlig i datavisningsfanen, ved hjelp av det polariserte bildet.Velg det kollagenrike området ved å definere området under rutenettfanen, og deretter lage et rektangel på datavisningsfanen ved å trykke lenge på venstre museknapp inne i den angitte grønne boksen. Klikk på bekreft nytt skanneområde for å angi det valgte området som et måleområde. Angi parametrene for tilbakemeldingssløyfen.Sett jeg gevinst på 50 hertz og P gevinst på 0,001. Sett deretter settpunktet på en nano Newton. Velg den relative settpunktverdien i henhold til de studerte materialenes mekaniske egenskaper og utkragerens stivhet.Angi en rettferdig grunnlinje for å tilpasse kraftkurvene riktig. Velg deretter lengden på utkragebevegelsen i Z-aksen i henhold til overflatetopografien til prøven. Sett Z-bevegelse til konstant varighet.Angi forlengingstiden til ett sekund med forsinkelser for forlengelse og tilbaketrekking som null. Sett samplingsfrekvens til 5.000 hertz. Merk en hake foran Z lukket sløyfe for automatisk å justere avstanden mellom prøven og utkragespissen under målinger.Koble deretter fra den motoriserte scenekontrollen ved å fjerne merket for Engage-knappen. Slå på laseren og nærme prøven med utkrageren. Klikk på start skanning for å samle kraftavstandskurver.Analyser de innsamlede dataene ved hjelp av åpen kildekode-programvaren AtomicJ. Last kraftkurvene inn i programmet ved å klikke på prosesskraftkurvene og kartikonet. Deretter legger du til kartene som skal analyseres i behandlingsassistenten ved å klikke på legg til-knappen.Etter at kartene er lastet inn, klikker du på neste. Angi behandlingsinnstillingene i neste vindu. Hvis du vil estimere kontaktpunktet mellom prøven og utkrageren automatisk ved hjelp av et sett med passende kurveparametere, bruker du automatisk estimering av kontaktpunktet.Bestem kontaktpunktet mellom utkrageren og prøven ved hjelp av den klassiske fokuserte rutenettmetoden. Velg estimeringsmetoden som modelluavhengig metode for å gi den beste bestemmelsen av kontaktpunktet basert på kvaliteten på de målte kraftkurvene, som må bestemmes empirisk under optimalisering av dataanalyse. Tilpass kraftinnrykkskurven ved hjelp av en klassisk modell som klassisk L to for modelltilpasning.Sett passformen til modellen til tilbaketrekningskurven. Sett Poissons forhold til 0,45 som anbefalt for bløtvev som leveren. Angi kurvens passform ved hjelp av en grunnlinjegrad på tre og en kontaktgrad på én.Endre graden av polynomtilpasning basert på skalaen for avvik fra kurvene fra modellen. Velg modellen som brukes til å passe tilbaketrekningskurvene som Sneddon-modellen. Fyll ut radiusen til den sfæriske spissen til 2,9 mikrometer.Last fjærkonstanten og invOLS fra datafilene ved å aktivere innlesing, og klikk deretter på fullfør. Etter dataanalyse, gå gjennom kraftkurvene. Ekskluder kraftkurvene der utkrageren nærmet seg overflaten av leverseksjonen feil.Disse kurvene har høy støy og avvikende former. Etter dette kan dataene kopieres eller eksporteres. I denne studien ble mildt faste leverseksjoner oppnådd fra kontrollmusene og musene med mild og avansert fibrose indusert ved injeksjon av karbontetraklorid undersøkt med AFM.Områder nær de sentrale venene som tilsvarer områdene der kollagenfibre i karbontetrakloridmus vanligvis dannes, ble analysert i kontrolllever. Fordelingen av Youngs moduli var reproduserbar over forskjellige regioner i kontrolllever og kollagenrike områder innenfor en enkelt leverseksjon. I karbontetrakloridbehandlede mus viste stivhetskart som tilsvarer pericentralområdene av kollagenavsetninger signifikant høyere verdier av Youngs moduli sammenlignet med ekvivalente områder i kontrollmus.Videre var det en betydelig økning i verdiene av Youngs moduli med lengre behandling. Effekten av langvarig lagring av leverseksjoner på de mekaniske egenskapene til kollagenfibre ble også vurdert. AFM-målinger viste signifikant lavere verdier av Youngs moduli i kollagenrike områder for seksjoner lagret i tre måneder, sammenlignet med de som ble oppnådd innen to uker.Tiden for fiksering av leverseksjonen bestemmer i stor grad de mekaniske egenskapene til leverseksjonen. Vi anbefaler at tidsbestemte intervaller angitt i protokollen må følges nøye. Etter visse optimaliseringer i protokollen kan den gitte metoden brukes til bløtvev som viser betydelig kollagenavsetning, som kan påvises ved polariserende mikroskopi.Den gitte teknikken gir forskerne en enhetlig og praktisk protokoll for å studere levermekanisme over sunn og sykdom.

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Prøvepreparering for mikroskopi av enkeltvirionakroskopi og superoppløselig fluorescensavbildning

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klonal Sporing av Hematopoetiske Stem og stamceller Preget av fem Fluorescent Proteiner bruker Confocal og multiphoton Mikros

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Måle Stivhet<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mus Aorta Bruke Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Påvisning av ligand-aktiverte G-protein-koblet reseptor Internalisering ved hjelp av konfokal mikroskopi

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...