Name: measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Agência de Bolsas da República Checa (18-02699S), pelo Projeto de Investigação Institucional da Academia Checa de Ciências (RVO 68378050) e pelo projeto MEYS CR NICR EXCELES (LX22NPO05102). CIISB, Consórcio da UE Instruct-CZ Centre of Instruct-ERIC, financiado pelo projeto de infraestruturas MEYS CR LM2018127 e pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional-Projeto "UP CIISB" (N.º. CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) apoiou financeiramente as medições na CF Nanobiotechnology, CEITEC MU. Também reconhecemos o Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praga, República Tcheca, apoiado pela MEYS (LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) e RVO: 68378050-KAV-NPUI, por seu apoio com a imagem de microscopia aqui apresentada.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

O protocolo apresentado fornece um método reprodutível passo-a-passo para a medição da AFM do tecido hepático normal e fibrótico do rato. A microscopia de polarização acoplada fornece alta precisão espacial e permite a visualização de fibras de colágeno devido à sua birrefringência. Além disso, uma descrição detalhada da análise das curvas de força obtidas é fornecida. A medição da rigidez da AFM pode ser realizada no nível celular, o que permite que as alterações locais nas propriedades mecânicas do tecido hepático devido ao desenvolvimento de doença fibrótica sejam monitoradas. A fibrose hepática não é um processo homogêneo que afeta todo o órgão. Pelo contrário, áreas de septos fibróticos ricos em colágeno são intercaladas com áreas de baixos ou nenhum depósito de colágeno. Assim, as alterações de rigidez são específicas do microambiente local e afetam apenas as células localmente em contato com áreas danificadas por lesões. Essa microescala de heterogeneidade de rigidez também é aparente nos detalhes dos mapas de módulos do AFM Young, onde pontos de alta rigidez margeiam as áreas de rigidez quase normal. Essa variação mostra que mesmo a área do tecido cicatricial do colágeno não é mecanicamente homogênea e requer que a medida da AFM seja caracterizada em nível celular (Figura 4).
O protocolo apresentado permite a mensuração da rigidez hepática por AFM independentemente da coleção hepática, pois todos os lobos hepáticos embutidos na OCT podem ser armazenados por um período prolongado a -80 °C. No entanto, uma vez que o tecido é seccionado, recomendamos medir as amostras dentro de ~ 2 semanas, pois observamos um amolecimento gradual das seções de tecido armazenadas por longos períodos de tempo (Figura 5).
O AFM equipado com microscopia de polarização permite localizar com precisão a área de interesse dentro da estrutura do lóbulo hepático. No entanto, também possui algumas limitações que precisam ser consideradas na interpretação dos resultados. Os valores de rigidez aqui obtidos foram medidos à temperatura ambiente. Assumimos que os efeitos da temperatura sobre as propriedades mecânicas dos tecidos moles serão pequenos; no entanto, esta pode ser uma das razões para diferenças entre os valores relatados in vivo de propriedades mecânicas dos tecidos hepáticos e os valores deste estudo.
Além disso, este protocolo permite a análise AFM do tecido hepático por até 3 h, o que requer uma fixação leve do tecido. A fixação leve das seções teciduais, bem como o ciclo de congelamento-descongelamento, provavelmente afetarão os valores absolutos do módulo de Young. Assim, os valores relatados dos módulos de Young podem diferir dos valores in vivo. Mais estudos são necessários para otimizar o protocolo de mensuração dos valores absolutos do módulo de Young a partir de cortes hepáticos, o que pode ser alcançado por um método diferente para fixação do tecido hepático64.
No entanto, observamos um aumento da rigidez de áreas ricas em colágeno nos fígados de camundongos tratados com CCl4 por 3 semanas em comparação com 6 semanas. Tais alterações correspondem à progressão da fibrose durante a lesão prolongada (Figura 4) e mostram que diferenças relativas podem ser investigadas entre os diferentes tratamentos utilizando o protocolo apresentado. Isso está de acordo com as observações de Calò et al., que mostraram que cortes hepáticos levemente fixos mostram diferenças semelhantes nos valores de rigidez entre áreas ricas em colágeno e sem colágeno como no tecido fresco25.
Utilizamos o cantilever SD-qp-BioT-TL-10 (constante teórica de mola ~0,09 N/m) modificado com uma ponta esférica de 5,7 μm de diâmetro para minimizar a ruptura mecânica do tecido hepático durante as medições. Um talão de 5,7 μm permitiu o recuo suficiente da amostra para sondar sua rigidez, preservando sua integridade. Um grânulo com um diâmetro menor pode ser usado, após várias otimizações, para obter maior resolução nos mapas de rigidez, mas pode levar a uma maior superestimação dos valores do módulo de Young (para mais detalhes, ver Crichton et al.65). Usando o conjunto de contas de balanço especificado, fomos capazes de caracterizar a rigidez da amostra em uma ampla faixa, de dezenas de unidades de Pa a ~100 kPa.
O modelo de Sneddon foi utilizado para derivar o módulo de Young a partir de curvas de força, pois permite a análise de reentrâncias profundas com sondas coloidais62. O modelo de Sneddon, ao contrário do modelo de Hertz, não sofre da restrição de que o raio de contato deve ser muito menor do que o raio da esfera. Assume, ainda, que a espessura da amostra é várias vezes maior que a profundidade de recuo 30,66. No presente estudo, o recuo foi de ~2 μm com um tamanho de grânulo de 5,7 μm e uma espessura de amostra de 30 μm em áreas ricas em colágeno; assim, o modelo de Sneddon era apropriado. Outros modelos63 considerando a força de adesão entre ponta e substrato podem ser utilizados para diferentes tipos de tecidos.
A análise em AtomicJ implementa correções para a espessura finita das amostras para minimizar a contribuição de um substrato enquanto se deriva o módulo de Young62,67. Na análise das curvas de força obtidas, utilizou-se uma única razão de Poisson de 0,45, que já foi previamente recomendada para órgãos de partes moles24. Esta aproximação não tem um efeito significativo sobre os valores calculados do módulo de Young, uma vez que a mudança no valor da razão de Poisson de 0,4 para 0,5 resulta apenas em uma diminuição de 0,893x nos valores do módulo de Young calculados de acordo com a equação de Sneddon. Dadas as diferenças múltiplas no módulo de Young entre as diferentes durações dos tratamentos com CCl4, os erros produzidos pela aproximação da razão de Poisson são apenas marginais.
Utilizamos curvas de retirada para calcular os valores de rigidez, pois estávamos interessados na resposta elástica do tecido à carga fornecida pelo cantilever e não na resposta plástica ao recuo68. Devido à resposta viscoelástica do tecido mole, as curvas de retirada de ajuste podem superestimar o módulo de Young, o que deve ser mantido em mente. Além disso, observamos que a análise de dados com curvas de aproximação produz tendências semelhantes nos valores de rigidez entre as áreas fibrótica e de controle, embora os valores absolutos sejam correspondentemente menores (dados não mostrados).
Ao otimizar o protocolo, identificamos várias etapas críticas para a reprodutibilidade das medições. Primeiro, é importante garantir que o talão esteja aproximadamente no centro da ponta translúcida enquanto se conecta ao balanço. Isso evita possíveis desequilíbrios mecânicos durante o recuo. Em segundo lugar, durante a fixação hepática com PFA, é necessário seguir rigorosamente os limites de tempo para descongelamento e fixação. Alterar o tempo desta etapa pode afetar severamente as propriedades mecânicas das seções de tecido. Em terceiro lugar, o cantilever deve ser repetidamente calibrado com monitoramento contínuo e entrada de valores de temperatura simultânea para evitar que quaisquer artefatos ocorram em valores de rigidez devido a flutuações de temperatura. Por último, uma única secção de fígado não deve ser medida por mais de 3 h a partir da preparação, uma vez que a PBS sobreposta pode evaporar durante períodos mais longos. Os leitores podem consultar a tabela de solução de problemas (Tabela 3) para resolver problemas encontrados durante a medição do AFM, também discutida em extensão em Norman et al.46.
Tabela 3: Guia de solução de problemas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%203v2.xlsx" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
O protocolo apresentado permite a sondagem reprodutível de AFM do tecido hepático. Tem o potencial de revelar informações sobre o desenvolvimento e eventual regressão da doença hepática fibrótica em nível microscópico e pode contribuir para o desenvolvimento de terapias direcionadas a regiões de cicatrizes fibróticas formadas durante a progressão da doença hepática crônica.

O fígado é um órgão vital para a manutenção da homeostase em organismos 1,2. As doenças hepáticas crônicas são responsáveis por ~ 2 milhões de mortes em todo o mundo anualmente3. Eles se originam mais comumente como infecções virais, distúrbios autoimunes, síndromes metabólicas ou doenças relacionadas ao abuso de álcool e são acompanhados por fibrose hepática progressiva. A lesão hepática provoca uma resposta inflamatória, o que leva à ativação de células depositando matriz extracelular (ECM) em uma resposta de cicatrização de feridas. No entanto, na presença de um insulto crônico, o excesso de MEC forma tecido cicatricial não resolvido dentro do fígado, levando ao desenvolvimento de fibrose hepática, cirrose, carcinoma hepático e, finalmente, à insuficiência hepática4.
A lesão de hepatócitos resulta imediatamente em aumento da rigidez hepática 5,6. Isso afeta diretamente a função dos hepatócitos, ativa as células estreladas hepáticas (HSCs) e os fibroblastos portais e resulta em sua transdiferenciação para miofibroblastos depositantes de colágeno 7,8. A deposição de ECM fibrosa aumenta ainda mais a rigidez hepática, criando um ciclo de feedback auto-amplificador de enrijecimento hepático e ativação celular produtora de matriz.
A rigidez hepática tornou-se, assim, um parâmetro importante no prognóstico da doença hepática. A alteração nas propriedades biomecânicas do tecido pode ser detectada mais cedo do que a fibrose pode ser diagnosticada por análise histológica. Portanto, várias técnicas para a medição da rigidez hepática foram desenvolvidas em pesquisas e aplicações clínicas. Em contextos clínicos, a elastografia transitória (TE)9,10,11,12,13 e a elastografia por ressonância magnética (MRE)14,15,16,17,18 têm sido empregadas para diagnosticar de forma não invasiva os estágios iniciais do dano hepático, examinando a rigidez hepática macroscópica 19.
Na TE, ondas ultrassonográficas de amplitude leve e baixa frequência (50 Hz) são propagadas pelo fígado, e sua velocidade é medida, que é então utilizada para o cálculo do módulo elástico tecidual13. No entanto, essa técnica não é útil para pacientes com ascite, obesidade ou espaços intercostais inferiores devido à transmissão inadequada das ondas ultrassonográficas através dos tecidos ao redor do fígado9.
A ERM é baseada na modalidade de ressonância magnética e usa ondas de cisalhamento mecânico de 20-200 Hz para atingir o fígado. Uma sequência específica de ressonância magnética é então utilizada para traçar as ondas dentro do tecido e calcular a rigidez tecidual16. Os valores de rigidez relatados com as técnicas de ET e ERM correlacionam-se bem com o grau de fibrose hepática obtido a partir de biópsias de amostras de fígado humano classificadas usando escores histológicos do METAVIR20 (Tabela 1). A ET e a ERM também foram adaptadas para a mensuração da rigidez hepática em modelos de roedores para fins de pesquisa21,22,23. No entanto, como ambos os métodos derivam os valores de rigidez da resposta do tecido às ondas de cisalhamento propagadoras, os valores obtidos podem não refletir a rigidez mecânica absoluta do tecido.
Para uma caracterização mecânica direta de fígados de roedores, Barnes et al. desenvolveram um ensaio modelo-gel-tecido (ensaio MGT) envolvendo a incorporação de tecido hepático em gel de poliacrilamida24. Este gel é comprimido por uma força uniforme pulsada a partir da qual o módulo de Young pode ser calculado. O ensaio de MGT mostra uma boa correlação com um ensaio de indentação adaptado para fígados normais e fibróticos24 (Tabela 1).
Tabela 1: Valores de rigidez hepática no nível do volume. TE e MRE em comparação com medições mecânicas ex vivo diretas de módulos elásticos hepáticos usando ensaios de recuo e MGT para fígados de diferentes fontes. A relação entre E e G é dada por E = 2G (1 + v), onde v é a razão de Poisson da amostra; F0 a F4 representam o escore de fibrose no sistema de pontuação METAVIR, com F0 denotando baixa ou nenhuma fibrose e F4 fígados cirróticos. Abreviaturas: TE = elastografia transitória; ERM = elastografia por ressonância magnética; MGT = modelo-gel-tecido; E = módulo elástico (de Young); G = módulo de cisalhamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%201v2.xlsx" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Uma das principais desvantagens das medições genéricas de rigidez hepática é que elas não fornecem resolução em nível celular da heterogeneidade da rigidez no fígado. Durante a progressão da fibrose, áreas ricas em colágeno apresentam maior rigidez em relação ao parênquima circundante25,26. Esse gradiente de rigidez influencia localmente as células residentes e desempenha um papel importante na condução da heterogeneidade do HSC27. Assim, as alterações nas propriedades mecânicas locais durante o desenvolvimento da doença hepática precisam ser caracterizadas em um nível microscópico para entender melhor a progressão da fibrose.
O AFM permite que as propriedades mecânicas do tecido sejam medidas com alta resolução e alta sensibilidade à força. O AFM usa a ponta de um cantilever para recuar a superfície de uma amostra com forças tão baixas quanto vários piconewtons, induzindo uma deformação em um nível microscópico ou nanoscópico com base na geometria e no tamanho da ponta empregada. A resposta de força da amostra à deformação aplicada é então medida como a deflexão no cantilever28. As curvas de força-deslocamento são coletadas a partir da aproximação e retração do balanço, que pode ser equipado com modelos mecânicos de contato apropriados para avaliar a rigidez local da amostra29.
Além de medir a rigidez de uma determinada área, o AFM também pode fornecer informações topográficas sobre características específicas da amostra, como a estrutura das fibras de colágeno30,31,32. Vários estudos descreveram a aplicação de AFM para medir a rigidez de vários tecidos saudáveis e doentes, como pele 32,33, pulmão 34,35, cérebro36, mamário37,38,39, cartilagem 40 ou coração41,42,43,44 de amostras de modelos de pacientes e camundongos. Além disso, a AFM também tem sido utilizada in vitro para determinar a rigidez de células e andaimes proteicos extracelulares45,46,47.
A medição das propriedades mecânicas de amostras biológicas usando AFM não é trivial devido à sua suavidade e fragilidade. Assim, vários estudos padronizaram diferentes condições e configurações, que produzem valores amplamente flutuantes dos módulos de Young (revisados por Mckee et al.48). Semelhante a outros tecidos moles, os valores do módulo hepático de Young em diferentes graus de fibrose hepática também apresentam extensa variação (Tabela 2). As diferenças nos valores do módulo de Young decorrem de diferenças no modo de operação do AFM, ponta do cantilever, método de preparação da amostra, espessura da amostra, profundidade e forças de recuo, ambiente do tecido hepático durante a medição e método de análise (Tabela 2).
Tabela 2: Valores de rigidez hepática a nível celular. Os valores de rigidez hepática obtidos usando AFM descrevem as propriedades mecânicas do fígado no nível celular. Abreviaturas: AFM = microscopia de força atômica; E = módulo elástico (de Young); PFA = paraformaldeído; PBS = solução salina tamponada com fosfato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%202v2.xlsx" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Este trabalho descreve um protocolo para a medida reprodutível dos módulos de Young de áreas fibróticas ricas em colágeno no tecido hepático por AFM com uma localização precisa fornecida pelo uso de microscopia de polarização. Administramos tetracloreto de carbono (CCl4) para induzir a deposição de colágeno de forma centrolobular49 em um modelo de camundongo, imitando de forma confiável aspectos cruciais da fibrose hepática humana50. Imagens microscópicas polarizadas possibilitam a visualização do colágeno no fígado devido à birrefringência das fibras colágenas51, o que permite o posicionamento preciso da ponta do cantilever sobre a área de interesse desejada dentro do lóbulo hepático52.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >AFM head</td>
			<td >Bruker</td>
			<td >JPK nanowizard 3</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cameras</td>
			<td >Andor</td>
			<td >Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >The Imagingsource&#160;</td>
			<td >S/N:12310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cantilever</td>
			<td >SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors</td>
			<td>S/N:73750F05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryotome</td>
			<td >Leica&#160;</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epoxy resin glue (Long working time )</td>
			<td >Bison epoxy universal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Melamine beads; diameter, 5.7 um</td>
			<td >Microparticles, GmbH</td>
			<td>MF-R-5.7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td>&#160;IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrophobic&#160; slide marker</td>
			<td >SuperHT</td>
			<td>PAP PEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td >JPK nanowizard&#160; v6.1.151</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >AtomicJ v2.3.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost slides</td>
			<td >Thermoscientific</td>
			<td>ref no. J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >System</td>
			<td >Ubuntu 14.04.5 LTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibration isolation control unit</td>
			<td >Tablestable</td>
			<td>AVI-200-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy

O enrijecimento da matriz tem sido reconhecido como um dos principais impulsionadores da progressão da fibrose hepática. Tem efeitos profundos em vários aspectos do comportamento celular, como a função celular, diferenciação e motilidade. No entanto, como esses processos não são homogêneos em todo o órgão, tornou-se cada vez mais importante entender as mudanças nas propriedades mecânicas dos tecidos no nível celular.
Para poder monitorar o enrijecimento de áreas ricas em colágeno dentro dos lobos hepáticos, este trabalho apresenta um protocolo para a medição de módulos elásticos do tecido hepático com alta precisão espacial por microscopia de força atômica (AFM). AFM é um método sensível com o potencial de caracterizar propriedades mecânicas locais, calculadas como módulo de Young (também referido como elástico). A AFM associada à microscopia de polarização pode ser usada para localizar especificamente as áreas de desenvolvimento de fibrose com base na birrefringência das fibras colágenas nos tecidos. Usando o protocolo apresentado, caracterizamos a rigidez de áreas ricas em colágeno de fígados fibróticos de camundongos e áreas correspondentes nos fígados de camundongos controle.
Um aumento proeminente na rigidez das áreas positivas para colágeno foi observado com o desenvolvimento de fibrose. O protocolo apresentado permite um método altamente reprodutível de medição da AFM, devido ao uso de tecido hepático levemente fixo, que pode ser usado para aprofundar a compreensão das mudanças iniciadas pela doença nas propriedades mecânicas do tecido local e seu efeito sobre o destino das células vizinhas.

Cortes hepáticos levemente fixos de 30 μm de espessura obtidos de camundongos controle e de camundongos com fibrose leve ou avançada (induzida pela injeção de CCl4 por 3 semanas ou 6 semanas, respectivamente49) foram sondados com AFM, conforme descrito neste protocolo. Fibras colágenas próximas às veias centrais foram selecionadas para a mensuração dos mapas de rigidez. Áreas próximas às veias centrais, que correspondem às áreas onde geralmente se formam fibras colágenas em animais tratados com CCl4, foram analisadas em fígados controle (Figura 4A). A distribuição dos módulos de Young foi reprodutível em diferentes fígados controle e áreas ricas em colágeno dentro de uma única seção hepática (Figura 4B: gráfico de violino esquerdo).
Em animais tratados com CCl 4, os mapas de rigidez correspondentes às áreas pericentrais dos depósitos de colágeno mostraram valores significativamente mais altos dos módulos de Young em comparação com áreas equivalentes em camundongos controle (Figura 4B: 1,9 kPa vs. 2,6 kPa mediana dos valores do módulo de Young para controle vs. 3 semanas de camundongo tratado com CCl 4; p = 0,07; 1,9 kPa vs. 5,1 kPa mediana dos valores do módulo Young para controle vs. 6 semanas CCl4 -rato tratado; p = 0,02). Além disso, houve um aumento significativo nos valores dos módulos de Young com o tratamento CCl 4 mais longo (Figura 4B; 2,6 kPa vs. 5,1 kPa mediana dos valores do módulo de Young para camundongo tratado com CCl4 semanas vs. 3 semanas vs.6 semanas; p = 0,04). Isso mostra um enrijecimento gradual dos depósitos de colágeno com progressão da fibrose e que as medições de AFM refletem a fibrogênese.
Para avaliar o efeito do armazenamento prolongado de cortes hepáticos embebidos em OCT sobre as propriedades mecânicas das fibras colágenas, medimos a rigidez das fibras colágenas em cortes de camundongos tratados com CCl4, que foram armazenados a -80 °C por 2 semanas ou 3 meses na lâmina após o corte (Figura 5). As medidas de AFM mostraram valores significativamente mais baixos de módulos de Young em áreas ricas em colágeno para seções armazenadas por 3 meses em comparação com aquelas obtidas de seções medidas dentro de 2 semanas após o corte da amostra (Figura 5; 4,7 kPa vs. 3,6 kPa mediana dos valores do módulo de Young por 2 semanas vs. 3 meses de armazenamento; p < 0,001). Assim, é importante medir as propriedades mecânicas do tecido hepático logo após as seções serem preparadas a partir dos lobos hepáticos incorporados à OCT.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig04.jpg"> Figura 4: As medidas de AFM revelam enrijecimento progressivo de áreas ricas em colágeno, correlacionando-se com o tratamento prolongado com CCl4. (A) Seções hepáticas de camundongos controle e camundongos tratados com CCl4 por 3 semanas ou 6 semanas foram usadas para medir as propriedades mecânicas de áreas ricas em colágeno. As áreas encaixotadas das seções hepáticas mostradas nas imagens de microscopia polarizada (à esquerda) são áreas de varredura ricas em colágeno (ou regiões correspondentes no fígado controle) selecionadas para medições de AFM (30 μm x 100 μm, 10 pixels x 36 pixels). Os mapas de módulo de Young com escalas de cores correspondentes a essas áreas encaixotadas são mostrados à direita, incluindo histogramas dos valores de módulo de Young a partir desses mapas; gráficos de dispersão embutidos mostram valores >10 kPa para cada condição. O enrijecimento do fígado é visualizado como um deslocamento gradual para a direita na distribuição do histograma e uma maior frequência de pontos no gráfico de dispersão inserido. Barra de escala = 20 μm. (B) Os gráficos de violino mostram a distribuição dos módulos elásticos a partir de três áreas medidas para cada condição (esquerda) e valores resumidos de módulos elásticos de todos os três mapas (direita). Os gráficos para violino mostram a mediana (linha vermelha),percentil 25 e percentil 75 (linhas pretas); os pontos representam os valores médios de mapas individuais das áreas 1-3. Os valores de p apresentados foram calculados por meio do teste t de Student realizado em médias. Abreviaturas: AFM = microscopia de força atômica; CCl4 = tetracloreto de carbono. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig04large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig05.jpg"> Figura 5: O armazenamento prolongado de seções hepáticas leva a uma diminuição na rigidez das áreas ricas em colágeno. Seções hepáticas (preparadas a partir de camundongos tratados com CCl4 por 2 semanas) armazenadas a -80 °C por 2 semanas ou 3 meses foram usadas para medir o módulo de Young. Imagens de microscopia polarizada (à esquerda) com caixas indicando as áreas ricas em colágeno usadas para medição de AFM (30 μm x 100 μm, 10 pixels x 36 pixels). O módulo de Young correspondente mapeia com escalas de cores (à direita). Os histogramas mostram os valores do módulo de Young coletados de 4-6 áreas em cada amostra; gráficos de dispersão embutidos mostram valores >10 kPa para cada condição. Barra de escala = 20 μm. Abreviaturas: AFM = microscopia de força atômica; CCl4 = tetracloreto de carbono. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig05large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar S1: Método para modificar o cantilever com um microcordão de resina de melamina. (A) O esquema desenhado ilustra a fixação de um grânulo esférico à ponta do balanço. Para uma descrição gradual, consulte a Seção 2, Parte 1, Anexação de um talão de 5,7 μm à ponta do cantilever AFM. (B) Imagem microscópica de um grânulo esférico de 5,7 μm ligado à ponta do cantilever mostrada de cima (esquerda) e vista lateral (direita). Barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: AFM = microscopia de força atômica; RT = temperatura ambiente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%201.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura Suplementar S2: Análise dos dados em AtomicJ. (A) A sequência de passos a serem seguidos para a abertura de mapas de rigidez em AtomicJ. Um único clique com o botão esquerdo do mouse nas curvas de força do processo e nos mapas (x) abre o assistente de processamento. Os arquivos podem ser carregados no assistente de processamento clicando em adicionar (y) e selecionando os arquivos necessários. Clique em Avançar (z) para prosseguir para a próxima etapa. (B) Parâmetros para ajuste da curva, modelo de mecânica de contato apropriado e configurações de AFM usadas durante a medição. As etapas 1 a 11 referem-se aos subpontos correspondentes detalhados na etapa 3 do protocolo, Seção 5, Análise de dados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary_fig_2.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura Suplementar S3: Esboço dos dados analisados em AtomicJ. A visualização dos dados analisados mostra mapas de rigidez (janela superior esquerda), curvas de força (janela superior direita) e dados brutos (janela inferior). Abreviação: AFM = microscopia de força atômica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%203.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy at JoVE.com

Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

Apresentamos um protocolo para medir os módulos elásticos de áreas ricas em colágeno em fígado normal e doente usando microscopia de força atômica. O uso simultâneo da microscopia de polarização fornece alta precisão espacial para localizar áreas ricas em colágeno nas seções do fígado.

Medição da rigidez hepática usando microscopia de força atômica acoplada à microscopia de polarização

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

Nosso protocolo fornece uma distinção entre colágeno rico e colágeno sem áreas nas seções do fígado. Pode, portanto, ser usado para estudar os processos de fibrogênese nos maiores detalhes. A principal vantagem da técnica reside no uso de microscopia polarizadora para localizar áreas ricas em colágeno nas seções do fígado.Nossos protocolos podem fornecer uma grande visão sobre o desenvolvimento da fibrose hepática, e também pode ser adotado para outros tecidos moles, como os pulmões, após certas otimizações. Para começar, remova as seções de fígado congeladas de menos 80 graus Celsius e descongele-as à temperatura ambiente por dois minutos. Fixar as seções com paraformaldeído gelado a 4% em PBS por 10 minutos a quatro graus Celsius, seguido de lavagem cinco vezes com PBS.Após a última lavagem, limpe o excesso de PBS ao redor da seção do fígado usando tecido e marque um limite de aproximadamente dois por quatro centímetros ao redor da seção do fígado com uma caneta marcador hidrofóbica. Cubra a amostra com PBS, carregue a amostra no estágio AFM e cubra-a com a cabeça AFM. Na microscopia de força atômica ou no software AFM, vá para a guia de configuração e marque um tick no salvamento automático para salvar automaticamente todos os arquivos.Em seguida, especifique o nome do arquivo e o diretório para salvar os arquivos de medição indo para a guia de configuração e clicando em salvar configurações. Aproxime-se da superfície do tecido com o cantilever AFM ligando o laser e clicando na tecla de aproximação. Após a conclusão da abordagem, retraia a ponta do cantilever clicando na tecla de retração uma vez, o que retrai o cantilever para a extremidade superior da faixa piezo.Se necessário, realinhe o detector usando botões na cabeça do AFM. Desligue o laser. A dica agora está no foco do objetivo.Em seguida, sobreponha o campo óptico do microscópio com mapas de medição AFM clicando na guia acessórios e selecionando a calibração óptica de sobreposição direta. Na janela seguinte, clique em Avançar para tirar uma série de imagens do cantilever digitalizando uma área específica. Clique em Avançar novamente para ir para a próxima janela.Na primeira imagem, clique no centro da ponta do cantilever manualmente para representar a posição da ponta no software. O círculo que representa a posição da ponta pode ser manipulado em tamanho, indicando seu raio para aumentar a precisão. Clique em calibrar para detectar a posição da ponta do cantilever em todas as imagens automaticamente.Confirme a precisão da detecção de pontas passando pelas imagens. Clique em Avançar e em Concluir para concluir a sobreposição óptica. Em seguida, mova o palco para posicionar uma área rica em colágeno dentro da caixa verde, visível na guia do visualizador de dados, usando a imagem polarizada.Selecione a área rica em colágeno definindo a área sob a guia de grade e, em seguida, fazendo um retângulo na guia do visualizador de dados usando um longo pressionar no botão esquerdo do mouse dentro da caixa verde especificada. Clique em confirmar nova região de varredura para definir a área selecionada como uma área de medição. Defina os parâmetros do loop de feedback.Definir eu ganho a 50 hertz e P ganho a 0,001. Em seguida, defina o ponto de ajuste em um nano Newton. Selecione o valor relativo do ponto de ajuste de acordo com as propriedades mecânicas dos materiais estudados e a rigidez do balanço.Especifique uma linha de base justa para ajustar as curvas de força corretamente. Em seguida, selecione o comprimento do movimento do cantilever no eixo Z de acordo com a topografia da superfície da amostra. Defina o movimento Z para duração constante.Defina o tempo de extensão para um segundo com atrasos de extensão e retração como zero. Defina a taxa de amostragem em 5.000 hertz. Marque um tick na frente do circuito fechado Z para ajustar automaticamente a distância entre a amostra e a ponta do cantilever durante as medições.Em seguida, desengate o controle de palco motorizado desmarcando o botão de engate. Ligue o laser e aproxime-se da amostra com o balanço. Clique em iniciar a varredura para coletar curvas de distância de força.Analise os dados adquiridos usando o software de código aberto AtomicJ. Carregue as curvas de força no programa clicando no ícone de curvas de força do processo e mapas. Em seguida, no assistente de processamento, adicione os mapas a serem analisados clicando no botão Adicionar.Depois que os mapas forem carregados, clique em Avançar. Especifique as configurações de processamento na próxima janela. Para estimar o ponto de contacto entre a amostra e o cantilever automaticamente utilizando um conjunto de parâmetros de curva de ajuste, utilize a estimativa automática do ponto de contacto.Determine o ponto de contato entre o cantilever e a amostra pelo método clássico de grade focalizada. Selecione o método de estimação como o método independente do modelo para obter a melhor determinação do ponto de contato com base na qualidade das curvas de força medidas, que precisa ser determinada empiricamente durante a otimização da análise dos dados. Ajuste a curva de recuo de força usando um modelo clássico como L dois clássico para ajuste do modelo.Defina o ajuste do modelo para a curva de retirada. Defina a proporção de Poisson como 0,45, conforme recomendado para tecidos moles, como o fígado. Defina o ajuste da curva usando um grau de linha de base de três e um grau de contato de um.Alterar o grau de ajuste polinomial com base na escala de desvios das curvas do modelo. Selecione o modelo usado para ajustar as curvas de retirada como o modelo de Sneddon. Preencha o raio da ponta esférica até 2,9 micrômetros.Carregue a constante de mola e o invOLS dos arquivos de dados habilitando a leitura e clique em concluir. Após a análise dos dados, percorra as curvas de força. Exclua as curvas de força em que o cantilever se aproximou da superfície da seção do fígado incorretamente.Essas curvas têm alto ruído e formas aberrantes. Depois disso, os dados podem ser copiados ou exportados. Neste estudo, cortes hepáticos levemente fixos obtidos dos camundongos controle e camundongos com fibrose leve e avançada induzida pela injeção de tetracloreto de carbono foram sondados com AFM.Áreas próximas às veias centrais correspondentes às áreas onde as fibras colágenas em camundongos tetracloreto de carbono geralmente se formam foram analisadas em fígados controle. A distribuição dos módulos de Young foi reprodutível em diferentes regiões em fígados controle e áreas ricas em colágeno dentro de uma única seção hepática. Em camundongos tratados com tetracloreto de carbono, os mapas de rigidez correspondentes às áreas pericentrais dos depósitos de colágeno mostraram valores significativamente mais altos dos módulos de Young em comparação com áreas equivalentes em camundongos controle.Além disso, houve um aumento significativo nos valores dos módulos de Young com o tratamento mais longo. O efeito do armazenamento prolongado de cortes hepáticos sobre as propriedades mecânicas das fibras colágenas também foi avaliado. As medidas de AFM mostraram valores significativamente menores de módulos de Young em áreas ricas em colágeno para seções armazenadas por três meses, em comparação com aquelas obtidas dentro de duas semanas.O tempo de fixação da seção do fígado determina grandemente as propriedades mecânicas da seção do fígado. Recomendamos que os intervalos cronometrados indicados no protocolo sejam rigorosamente seguidos. Após certas otimizações no protocolo, o método dado pode ser usado para quaisquer tecidos moles que apresentem deposição significativa de colágeno, que é detectável por microscopia polarizadora.A técnica dada fornece aos pesquisadores um protocolo unificado e conveniente para estudar o mecanismo do fígado em toda a saúde e doença.

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Biologia

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Electrosoldável célula visualizado com microscopia de fluorescência

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

Resposta celular ao vivo para Estimulação mecânicas estudadas por Microscopia de Força Atômica e Óptica Integrada

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

Em Quantificação in vivo de proteínas G Interações Receptor Acoplado usando espectral Resolvido Microscopia de dois fótons

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Micro-Mecânica Caracterização do tecido pulmonar Usando Microscopia de Força Atômica

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

Metas de identificação de microRNAs humanos com o Sistema de ensaio de luciferase lightswitch usando 3&#39;UTR repórter-Constrói e um microRNA em células aderentes Mimic

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Preparação da amostra para microscopia da força atômica de virion único e imagem de fluorescência de super-resolução

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Medindo a rigidez<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aortas Usando Microscopia de Força Atômica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Detecção de activados por ligandos L acoplado a proteína do receptor de internalização por Microscopia Confocal

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...