Name: measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy at JoVE.com

Эта работа была поддержана Грантовым агентством Чешской Республики (18-02699S), Институциональным исследовательским проектом Чешской академии наук (RVO 68378050) и проектом MEYS CR NICR EXCELES (LX22NPO05102). CIISB, Instruct-CZ Центр консорциума Instruct-ERIC EU, финансируемый инфраструктурным проектом MEYS CR LM2018127 и Европейским фондом регионального развития-проектом «UP CIISB» (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) оказал финансовую поддержку измерениям в CF Nanobiotechnology, CEITEC MU. Мы также выражаем признательность Центру световой микроскопии, IMG CAS, Прага, Чешская Республика, при поддержке MEYS (LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) и RVO: 68378050-KAV-NPUI, за их поддержку с помощью микроскопической визуализации, представленной здесь.

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Представленный протокол обеспечивает пошаговый воспроизводимый метод измерения ОВМ нормальной и фиброзной ткани печени мыши. Связанная поляризационная микроскопия обеспечивает высокую пространственную точность и позволяет визуализировать коллагеновые волокна благодаря их двулучепреломлению. Далее приводится подробное описание анализа полученных силовых кривых. Измерение жесткости АСМ может быть выполнено на клеточном уровне, что позволяет контролировать местные изменения механических свойств ткани печени из-за развития фиброзного заболевания. Фиброз печени не является однородным процессом, затрагивающим весь орган. Напротив, области богатых коллагеном фиброзных перегородок перемежаются с областями с низкими или отсутствующими коллагеновыми отложениями. Таким образом, изменения жесткости специфичны для местного микроокружения и влияют только на клетки, локально контактирующие с областями, поврежденными травмой. Этот микромасштаб гетерогенности жесткости также очевиден в деталях карт модуля AFM Янга, где точки высокой жесткости граничат с областями почти нормальной жесткости. Это изменение показывает, что даже коллагеновая область рубцовой ткани не является механически однородной и требует, чтобы измерение AFM было охарактеризовано на клеточном уровне (рисунок 4).
Представленный протокол позволяет измерять жесткость печени с помощью AFM независимо от сбора печени, так как целые доли печени, встроенные в OCT, могут храниться в течение длительного периода при -80 °C. Однако, как только ткань разделена, мы рекомендуем измерять образцы в течение ~ 2 недель, поскольку мы наблюдали постепенное размягчение участков ткани, хранящихся в течение более длительных периодов времени (рисунок 5).
AFM, оснащенный поляризационной микроскопией, позволяет точно определить область интереса в структуре дольков печени. Тем не менее, он также имеет некоторые ограничения, которые необходимо учитывать при интерпретации результатов. Полученные здесь значения жесткости измерялись при комнатной температуре. Предположим, что влияние температуры на механические свойства мягких тканей будет небольшим; однако это может быть одной из причин различий между сообщенными in vivo значениями механических свойств тканей печени и значениями в этом исследовании.
Кроме того, этот протокол позволяет проводить АСМ-анализ ткани печени в течение 3 ч, что требует легкой фиксации ткани. Легкая фиксация участков тканей, а также цикл замораживания-оттаивания, скорее всего, повлияют на абсолютные значения модуля Юнга. Таким образом, сообщаемые значения модулей Юнга могут отличаться от значений in vivo . Необходимы дальнейшие исследования для оптимизации протокола измерения абсолютных значений модуля Юнга от срезов печени, что может быть достигнуто другим методом фиксации печеночной ткани64.
Тем не менее, мы наблюдали увеличение жесткости богатых коллагеном областей в печени мышей, получавших CCl4 в течение 3 недель по сравнению с 6 неделями. Такие изменения соответствуют прогрессированию фиброза во время длительного повреждения (рисунок 4) и показывают, что относительные различия могут быть исследованы между различными методами лечения с использованием представленного протокола. Это согласуется с наблюдениями Calò et al., которые показали, что умеренно фиксированные участки печени показывают аналогичные различия в значениях жесткости между областями, богатыми коллагеном и не имеющими коллагена, как и в свежих тканях25.
Мы использовали консоль SD-qp-BioT-TL-10 (теоретическая пружинная константа ~ 0,09 Н/м), модифицированную сферическим наконечником диаметром 5,7 мкм, чтобы свести к минимуму механическое разрушение ткани печени во время измерений. Шарик размером 5,7 мкм позволил достаточное углубление образца для проверки его жесткости при сохранении его целостности. Шарик с меньшим диаметром может быть использован после нескольких оптимизаций для получения более высокого разрешения в картах жесткости, но может привести к дальнейшей переоценке значений модуля Юнга (для получения более подробной информации см. Crichton et al.65). Используя указанный консольно-шариковый ансамбль, мы смогли охарактеризовать жесткость образца в широком диапазоне, от десятков единиц Па до ~100 кПа.
Модель Снеддона была использована для получения модуля Юнга из кривых силы, поскольку она позволяет анализировать глубокие углубления с коллоидными зондами62. Модель Снеддона, в отличие от модели Герца, не страдает от ограничения, что радиус контакта должен быть намного меньше радиуса сферы. Далее предполагается, что толщина образца в несколько раз превышает глубину отступа 30,66. В настоящем исследовании углубление составляло ~2 мкм при размере шарика 5,7 мкм и толщине образца 30 мкм в областях, богатых коллагеном; таким образом, модель Снеддона была уместной. Другие модели63, учитывающие силу адгезии между наконечником и подложкой, могут быть использованы для различных типов тканей.
Анализ в AtomicJ реализует поправки на конечную толщину образцов, чтобы минимизировать вклад подложки при получении модуля Юнга62,67. При анализе полученных силовых кривых мы использовали один коэффициент Пуассона 0,45, который ранее был рекомендован для органов мягких тканей24. Это приближение не оказывает существенного влияния на расчетные значения модуля Юнга, так как изменение значения коэффициента Пуассона от 0,4 до 0,5 приводит лишь к уменьшению в 0,893 раза значений модуля Юнга, рассчитанных по уравнению Снеддона. Учитывая многократные различия в модуле Юнга между различными длительностямиобработки CCl 4, ошибки, возникающие при аппроксимации соотношения Пуассона, являются лишь незначительными.
Мы использовали кривые вывода для расчета значений жесткости, так как нас интересовала упругая реакция ткани на нагрузку, обеспечиваемую консолью, а не пластическая реакция на отступ68. Из-за вязкоупругогого отклика мягких тканей кривые посадки могут переоценить модуль Юнга, что следует иметь в виду. Кроме того, мы заметили, что анализ данных с кривыми подхода дает аналогичные тенденции в значениях жесткости между фиброзной и контрольной областями, хотя абсолютные значения соответственно ниже (данные не показаны).
Оптимизируя протокол, мы определили несколько шагов, критически важных для воспроизводимости измерений. Во-первых, важно убедиться, что шарик находится примерно в центре полупрозрачного наконечника при прикреплении к консолью. Это предотвращает возможный механический дисбаланс во время углубления. Во-вторых, во время фиксации печени при ПФА необходимо строго соблюдать временные рамки оттаивания и фиксации. Изменение сроков этого этапа может серьезно повлиять на механические свойства срезов ткани. В-третьих, консольный станок должен быть многократно откалиброван с непрерывным мониторингом и вводом одновременных значений температуры, чтобы избежать каких-либо артефактов, возникающих в значениях жесткости из-за колебаний температуры. Наконец, один участок печени не следует измерять более 3 ч после приготовления, так как наложенный PBS может испаряться в течение более длительных периодов времени. Читатели могут обратиться к таблице устранения неполадок (таблица 3) для решения проблем, возникших во время измерения AFM, также обсуждаемой в Norman et al.46.
Таблица 3: Руководство по устранению неполадок. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%203v2.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Представленный протокол допускает воспроизводимое ОВМ-зондирование ткани печени. Он может раскрыть информацию о развитии и возможной регрессии фиброзного заболевания печени на микроскопическом уровне и может способствовать разработке методов лечения, нацеленных на фиброзные рубцовые области, образующиеся во время прогрессирования хронического заболевания печени.

Печень является жизненно важным органом для поддержания гомеостаза в организмах 1,2. Хронические заболевания печени составляют ~ 2 миллиона смертей во всем мире ежегодно3. Они возникают чаще всего как вирусные инфекции, аутоиммунные расстройства, метаболические синдромы или заболевания, связанные со злоупотреблением алкоголем, и сопровождаются прогрессирующим фиброзом печени. Повреждение печени вызывает воспалительную реакцию, которая приводит к активации клеток, откладывающих внеклеточный матрикс (ECM) в реакции заживления ран. Однако при наличии хронического инсульта избыток ECM образует неразрешенную рубцовую ткань внутри печени, что приводит к развитию фиброза печени, цирроза, карциномы печени и, в конечном счете, к печеночной недостаточности4.
Повреждение гепатоцитов сразу же приводит к увеличению жесткости печени 5,6. Это напрямую влияет на функцию гепатоцитов, активирует печеночные звездчатые клетки (ГСК) и портальные фибробласты и приводит к их трансдифференциации к коллагенопонавливающим миофибробластам 7,8. Отложение волокнистого ECM еще больше увеличивает жесткость печени, создавая самоусиливающуюся петлю обратной связи жесткости печени и активацию клеток, продуцирующих матрицу.
Таким образом, жесткость печени стала важным параметром в прогнозе заболеваний печени. Изменение биомеханических свойств тканей может быть обнаружено раньше, чем фиброз может быть диагностирован с помощью гистологического анализа. Поэтому различные методы измерения жесткости печени были разработаны как в исследовательском, так и в клиническом применении. В клинических условиях транзиторная эластография (ТЭ)9,10,11,12,13 и магнитно-резонансная эластография (МРЭ)14,15,16,17,18 были использованы для неинвазивной диагностики ранних стадий повреждения печени путем изучения грубой жесткости печени19.
В ТЭ ультразвуковые волны легкой амплитуды и низкой частоты (50 Гц) распространяются через печень, и измеряется их скорость, которая затем используется для расчета модуля упругоститканей 13. Однако этот метод не полезен для пациентов с асцитом, ожирением или нижними межреберными пространствами из-за неправильной передачи ультразвуковых волн через ткани, окружающие печень9.
MRE основана на методе магнитно-резонансной томографии и использует механические сдвиговые волны 20-200 Гц для нацеливания на печень. Затем специальная последовательность магнитно-резонансной томографии используется для отслеживания волн внутри ткани и расчета жесткости ткани16. Значения жесткости, представленные с помощью методов TE и MRE, хорошо коррелируют со степенью фиброза печени, полученной из биопсии образцов печени человека, ранжированных с использованием гистологических баллов METAVIR20 (таблица 1). TE и MRE также были адаптированы для измерения жесткости печени на моделях грызунов для исследовательских целей 21,22,23. Однако, поскольку оба метода получают значения жесткости из реакции ткани на распространяющиеся волны сдвига, полученные значения могут не отражать абсолютную механическую жесткость ткани.
Для прямой механической характеристики печени грызунов Barnes et al. разработали модельно-гель-тканевый анализ (MGT assay), включающий встраивание ткани печени в полиакриламидный гель24. Этот гель сжимается импульсной равномерной силой, из которой можно рассчитать модуль Юнга. Анализ MGT показывает хорошую корреляцию с анализом углубления, адаптированным как для нормальной, так и для фиброзной печени24 (таблица 1).
Таблица 1: Значения жесткости печени на объемном уровне. TE и MRE по сравнению с прямыми ex vivo механическими измерениями модулей эластичности печени с использованием анализов индументов и MGT для печени из разных источников. Отношение между E и G задается E = 2G (1 + v), где v — отношение Пуассона к выборке; От F0 до F4 представляют собой оценку фиброза в системе оценки METAVIR, при этом F0 обозначает низкий или отсутствующий фиброз и F4 цирротическую печень. Сокращения: TE = переходная эластография; MRE = магнитно-резонансная эластография; MGT = модель-гель-ткань; E = модуль упругости (Юнга); G = модуль сдвига. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%201v2.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Одним из основных недостатков общих измерений жесткости печени является то, что они не обеспечивают разрешение гетерогенности жесткости на клеточном уровне в печени. Во время прогрессирования фиброза богатые коллагеном участки демонстрируют более высокую ригидность по сравнению с окружающей паренхимой25,26. Этот градиент жесткости локально влияет на резидентные клетки и играет важную роль в управлении гетерогенностью HSC27. Таким образом, изменения местных механических свойств при развитии заболевания печени необходимо характеризовать на микроскопическом уровне, чтобы лучше понять прогрессирование фиброза.
AFM позволяет измерять механические свойства ткани с высоким разрешением и высокой чувствительностью к силе. AFM использует наконечник консольного аппарата для отступа поверхности образца с силами до нескольких пиконьютонов, вызывая деформацию на микроскопическом или наноскопическом уровне на основе геометрии и размера используемого наконечника. Затем силовая реакция образца на приложенную деформацию измеряется как отклонение в консольном устройстве28. Кривые смещения силы собираются из приближения и втягивания консольного аппарата, который может быть оснащен соответствующими моделями контактной механики для оценки локальной жесткости образца29.
В дополнение к измерению жесткости данной области, AFM может также предоставлять топографическую информацию о конкретных особенностях в образце, таких как структура коллагеновых волокон 30,31,32. Многочисленные исследования описывали применение AFM для измерения жесткости различных здоровых и больных тканей, таких как кожа32,33, легкие34,35, мозг36, молочныежелезы 37,38,39, хрящ40 или сердце 41,42,43,44 из образцов модели пациентки и мыши. Кроме того, AFM также использовался in vitro для определения жесткости клеток и внеклеточных белковых каркасов 45,46,47.
Измерение механических свойств биологических образцов с помощью ОВМ является нетривиальным из-за их мягкости и хрупкости. Таким образом, различные исследования стандартизировали различные условия и настройки, которые дают широко колеблющиеся значения модулей Юнга (обзор Mckee et al.48). Подобно другим мягким тканям, значения модуля юнга печени при различных степенях фиброза печени также показывают обширные вариации (таблица 2). Различия в значениях модуля Юнга обусловлены различиями в режиме работы АСМ, консольном наконечнике, методе пробоподготовки, толщине образца, глубине и силах углубления, среде тканей печени при измерении и методе анализа (таблица 2).
Таблица 2: Значения жесткости печени на клеточном уровне. Значения жесткости печени, полученные с помощью AFM, описывают механические свойства печени на клеточном уровне. Сокращения: AFM = атомно-силовая микроскопия; E = модуль упругости (Юнга); PFA = параформальдегид; PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%202v2.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
В данной работе описан протокол воспроизводимого измерения модулей Юнга богатых коллагеном фиброзных участков в ткани печени методом AFM с точной локализацией, обеспечиваемой использованием поляризационной микроскопии. Мы ввели тетрахлорметан (CCl4), чтобы индуцировать осаждение коллагена центрилобальным способом49 в мышиной модели, надежно имитируя важнейшие аспекты фиброза печени человека50. Поляризованные микроскопические изображения позволяют визуализировать коллаген в печени за счет двулучепреломления коллагеновых волокон51, что позволяет точно позиционировать консольный наконечник над желаемой областью интереса в пределах печеночной дольки52.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >AFM head</td>
			<td >Bruker</td>
			<td >JPK nanowizard 3</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cameras</td>
			<td >Andor</td>
			<td >Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >The Imagingsource&#160;</td>
			<td >S/N:12310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cantilever</td>
			<td >SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors</td>
			<td>S/N:73750F05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryotome</td>
			<td >Leica&#160;</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epoxy resin glue (Long working time )</td>
			<td >Bison epoxy universal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Melamine beads; diameter, 5.7 um</td>
			<td >Microparticles, GmbH</td>
			<td>MF-R-5.7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td>&#160;IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrophobic&#160; slide marker</td>
			<td >SuperHT</td>
			<td>PAP PEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td >JPK nanowizard&#160; v6.1.151</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >AtomicJ v2.3.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost slides</td>
			<td >Thermoscientific</td>
			<td>ref no. J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >System</td>
			<td >Ubuntu 14.04.5 LTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibration isolation control unit</td>
			<td >Tablestable</td>
			<td>AVI-200-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy

Жесткость матрицы была признана одним из ключевых факторов прогрессирования фиброза печени. Он оказывает глубокое влияние на различные аспекты поведения клеток, такие как функция клеток, дифференцировка и подвижность. Однако, поскольку эти процессы не однородны по всему органу, становится все более важным понимать изменения механических свойств тканей на клеточном уровне.
Чтобы иметь возможность контролировать жесткость богатых коллагеном областей в долях печени, в этой статье представлен протокол измерения модулей упругости тканей печени с высокой пространственной точностью с помощью атомно-силовой микроскопии (AFM). AFM является чувствительным методом с потенциалом для характеристики локальных механических свойств, рассчитанных как модуль Юнга (также называемый упругим). AFM в сочетании с поляризационной микроскопией может быть использован для конкретного определения местоположения областей развития фиброза на основе двулучепреломления коллагеновых волокон в тканях. Используя представленный протокол, мы охарактеризовали жесткость богатых коллагеном участков фиброзной печени мыши и соответствующих участков в печени контрольных мышей.
Заметное увеличение жесткости коллаген-положительных участков наблюдалось при развитии фиброза. Представленный протокол допускает высоковоспроизводимый метод измерения ОВМ, благодаря использованию умеренно фиксированной ткани печени, который может быть использован для дальнейшего понимания инициированных болезнью изменений механических свойств местной ткани и их влияния на судьбу соседних клеток.

Умеренно фиксированные участки печени толщиной 30 мкм, полученные от контрольных мышей и у мышей с легким или прогрессирующим фиброзом (индуцированные инъекцией CCl4 в течение 3 недель или 6 недель, соответственно49), исследовали с помощью ОВМ, как описано в этом протоколе. Коллагеновые волокна вблизи центральных вен были выбраны для измерения карт жесткости. Области, близкие к центральным венам, которые соответствуют областям, где обычно образуются коллагеновые волокна у животных, обработанных CCl4, были проанализированы в контрольной печени (рисунок 4A). Распределение модулей Юнга было воспроизводимым по различным контрольным печенкам и богатым коллагеном областям в пределах одного участка печени (рисунок 4B: левый скрипичный график).
У животных, обработанных CCl4, карты жесткости, соответствующие перицентральным областям отложений коллагена, показали значительно более высокие значения модулей Юнга по сравнению с эквивалентными областями у контрольных мышей (Рисунок 4B: 1,9 кПа против 2,6 кПа медианных значений модуля Юнга для контроля по сравнению с 3 неделями CCl4-обработанной мышью; p = 0,07; 1,9 кПа против 5,1 кПа медианных значений модуля Юнга для контроля против 6 недель CCl4 - обработанная мышь; p = 0,02). Кроме того, наблюдалось значительное увеличение значений модулей Юнга при более длительном лечении CCl4 (Рисунок 4B; 2,6 кПа против 5,1 кПа медианных значений модуля Юнга за 3 недели против 6 недель CCl4-обработанной мыши; p = 0,04). Это показывает постепенное жесткость отложений коллагена с прогрессированием фиброза и то, что измерения AFM отражают фиброгенез.
Чтобы оценить влияние длительного хранения ОКТ-встроенных участков печени на механические свойства коллагеновых волокон, мы измерили жесткость коллагеновых волокон в секциях мышей, обработанных CCl4, которые хранились при −80 °C в течение 2 недель или 3 месяцев на слайде после резки (рисунок 5). Измерения AFM показали значительно более низкие значения модулей Юнга в богатых коллагеном областях для участков, хранящихся в течение 3 месяцев, по сравнению с теми, которые были получены из секций, измеренных в течение 2 недель после секционирования образца (рисунок 5; 4,7 кПа против 3,6 кПа медианных значений модуля Юнга в течение 2 недель против 3 месяцев хранения; p < 0,001). Таким образом, важно измерить механические свойства ткани печени вскоре после того, как срезы получены из ОКТ-встроенных долей печени.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig04.jpg"> Рисунок 4: Измерения AFM показывают прогрессирующую жесткость областей, богатых коллагеном, коррелирующих с длительным лечением CCl4 . (A) Участки печени контрольных мышей и мышей, получавших CCl4 в течение 3 недель или 6 недель, использовались для измерения механических свойств областей, богатых коллагеном. Коробочные области участков печени, показанные на поляризованных микроскопических изображениях (слева), представляют собой богатые коллагеном области сканирования (или соответствующие области в контрольной печени), выбранные для измерений AFM (30 мкм x 100 мкм, 10 пикселей x 36 пикселей). Справа показаны карты модуля Юнга с цветовыми шкалами, соответствующими этим коробочным областям, включая гистограммы значений модуля Юнга из этих карт; Точечные диаграммы врезок показывают значения >10 кПа для каждого условия. Жесткость печени визуализируется как постепенное смещение вправо в распределении гистограммы и более высокая частота точек на шкале рассеяния вставки. Шкала = 20 мкм. (B) Скрипичные графики показывают распределение модулей упругости из трех областей, измеренных для каждого условия (слева) и суммированные значения модулей упругости из всех трех карт (справа). Скрипичные графики показывают медиану (красная линия),25-й процентиль и 75-й процентиль (черные линии); точки представляют собой средние значения отдельных карт из районов 1-3. Представленные p-значения были рассчитаны с использованием t-теста студента, выполненного на средних. Сокращения: AFM = атомно-силовая микроскопия; CCl4 = тетрахлорметан. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig05.jpg"> Рисунок 5: Длительное хранение участков печени приводит к снижению жесткости участков, богатых коллагеном. Срезы печени (приготовленные из мышей, получавших CCl4 в течение 2 недель), хранимые при -80 °C в течение 2 недель или 3 месяцев, использовались для измерения модуля Юнга. Изображения поляризованной микроскопии (слева) с полями, указывающими богатые коллагеном области, используемые для измерения AFM (30 мкм x 100 мкм, 10 пикселей x 36 пикселей). Соответствующие карты модуля Юнга с цветовыми шкалами (справа). Гистограммы показывают значения модуля Юнга, собранные из 4-6 областей в каждом образце; Точечные диаграммы врезок показывают значения >10 кПа для каждого условия. Шкала бар = 20 мкм. Сокращения: AFM = атомно-силовая микроскопия; CCl4 = тетрахлорметан. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Дополнительный рисунок S1: Способ модификации консольного аппарата микрошарикой из меламиновой смолы. (A) Нарисованная схема иллюстрирует прикрепление сферической бусины к кончику консольного аппарата. Для пошагового описания см. Раздел 2, Часть 1, Прикрепление шарика 5,7 мкм к консольному наконечнику AFM. (B) Микроскопическое изображение сферической бусины размером 5,7 мкм, прикрепленной к консольному наконечнику, показанное сверху (слева) и сбоку (справа). Шкала стержней = 20 мкм. Сокращения: AFM = атомно-силовая микроскопия; RT = комнатная температура. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%201.pdf" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительный рисунок S2: Анализ данных в AtomicJ. (A) Последовательность шагов, которые необходимо выполнить для открытия карт жесткости в AtomicJ. Один щелчок левой кнопкой мыши по кривым силы процесса и картам (x) открывает помощника по обработке. Файлы можно загрузить в помощник по обработке , нажав на добавить (y) и выбрав необходимые файлы. Нажмите на следующий (z), чтобы перейти к следующему шагу. (B) Параметры для подгонки кривых, соответствующая модель контактной механики и настройки AFM, используемые во время измерения. Шаги 1-11 относятся к соответствующим подпунктам, подробно описанным в протоколе шаг 3, раздел 5, анализ данных. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary_fig_2.pdf" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительный рисунок S3: Описание анализируемых данных в AtomicJ. Предварительный просмотр проанализированных данных показывает карты жесткости (верхнее левое окно), кривые силы (верхнее правое окно) и необработанные данные (нижнее окно). Аббревиатура: AFM = атомно-силовая микроскопия. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%203.pdf" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy at JoVE.com

Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

Представлен протокол измерения модулей упругости богатых коллагеном участков в нормальной и больной печени с помощью атомно-силовой микроскопии. Одновременное использование поляризационной микроскопии обеспечивает высокую пространственную точность локализации богатых коллагеном участков в отделах печени.

Измерение жесткости печени с помощью атомно-силовой микроскопии в сочетании с поляризационной микроскопией

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

Наш протокол проводит различие между областями, богатыми коллагеном, и областями, в которых отсутствует коллаген, в отделах печени. Таким образом, его можно использовать для более детального изучения процессов фиброгенеза. Основное преимущество методики заключается в использовании поляризационной микроскопии для локализации богатых коллагеном участков в отделах печени.Наши протоколы могут дать отличное представление о развитии фиброза печени, а также могут быть приняты для других мягких тканей, таких как легкие, после определенных оптимизаций. Для начала удалите замороженные участки печени от минус 80 градусов по Цельсию, и разморозьте их при комнатной температуре в течение двух минут. Зафиксируйте участки ледяным холодным 4%-ным параформальдегидом в PBS в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия с последующей промывкой пять раз PBS.После последней промывки протрите избыток PBS вокруг участка печени с помощью ткани и отметьте границу примерно два на четыре сантиметра вокруг раздела печени гидрофобной маркерной ручкой. Накройте образец PBS, затем загрузите образец на ступень AFM и накройте его головкой AFM. В программном обеспечении атомно-силовой микроскопии или AFM перейдите на вкладку настройки и отметьте галочку при автосохранении, чтобы автоматически сохранить все файлы.Затем укажите имя файла и каталог для сохранения файлов измерений, перейдя на вкладку настройки и нажав на сохранение настроек. Подойдите к поверхности ткани с помощью консольного устройства AFM, включив лазер и нажав на клавишу подхода. После того, как подход будет завершен, втяните консольный наконечник, щелкнув по клавише втягивания один раз, которая втягивает консоль в верхний конец пьезодиапазона.При необходимости перестройте детектор с помощью ручек на головке AFM. Выключите лазер. Подсказка теперь находится в центре внимания цели.Затем наложите на оптическое поле микроскопа карты измерений AFM, щелкнув вкладку «Аксессуары» и выбрав прямую оптическую калибровку. В последующем окне щелкните далее, чтобы сделать серию изображений консольного сканера определенной области. Нажмите кнопку Далее еще раз, чтобы перейти к следующему окну.На первом изображении нажмите на центр наконечника консольного устройства вручную, чтобы отобразить положение наконечника в программном обеспечении. Кругом, изображающим положение наконечника, можно манипулировать по размеру, указывая его радиус для повышения точности. Нажмите кнопку «Калибровка», чтобы автоматически определить положение кончика консольного наконечника на всех изображениях.Подтвердите точность обнаружения наконечников, просмотрев изображения. Нажмите кнопку Далее, а затем завершите, чтобы завершить оптическое наложение. Затем переместите рабочую область, чтобы расположить богатую коллагеном область внутри зеленого поля, видимого на вкладке средства просмотра данных, используя поляризованное изображение.Выберите область, богатую коллагеном, определив область под вкладкой сетки, а затем создав прямоугольник на вкладке средства просмотра данных, используя длительное нажатие левой кнопки мыши внутри указанного зеленого поля. Нажмите на подтверждение новой области сканирования, чтобы установить выбранную область в качестве области измерения. Задайте параметры цикла обратной связи.Установите I на 50 герц и P на 0,001. Затем установите заданное значение в один нано Ньютон. Выберите относительное значение заданного значения в соответствии с механическими свойствами исследуемых материалов и жесткостью консольного аппарата.Укажите только базовую линию, чтобы она правильно соответствовала кривым силы. Затем выберите длину консольного движения по оси Z в соответствии с топографией поверхности образца. Установите для движения Z постоянную продолжительность.Установите время продления на одну секунду с задержками расширения и втягивания равными нулю. Установите частоту дискретизации на уровне 5 000 герц. Отметьте галочку перед замкнутым контуром Z, чтобы автоматически отрегулировать расстояние между образцом и консольным наконечником во время измерений.Затем отключите моторизованное управление ступенью, сняв флажок кнопки включения. Включите лазер и подойдите к образцу с помощью кантилевера. Нажмите на начать сканирование, чтобы собрать кривые расстояния силы.Анализируйте полученные данные с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом AtomicJ. Загрузите кривые силы в программу, щелкнув по значку кривых силы процесса и карт. Затем в помощнике по обработке добавьте карты для анализа, нажав на кнопку добавить.После загрузки карт нажмите далее. Укажите параметры обработки в следующем окне. Для автоматической оценки точки контакта между образцом и консолью с помощью набора параметров кривой подгонки используйте автоматическую оценку точки контакта.Определите точку контакта между консолью и образцом классическим методом сфокусированной сетки. Выбрать метод оценки в качестве модельно-независимого метода, чтобы получить наилучшее определение точки контакта на основе качества измеряемых кривых силы, которое необходимо эмпирически определить при оптимизации анализа данных. Подойдите к кривой отступа силы, используя классическую модель в качестве классической L two для подгонки модели.Установите подгонку модели к кривой вывода. Установите коэффициент Пуассона равным 0,45, как рекомендуется для мягких тканей, таких как печень. Установите подгонку кривой, используя базовую степень три и степень контакта единицы.Изменение степени подгонки полиномов на основе масштаба отклонений кривых от модели. Выберите модель, используемую для соответствия кривым вывода в качестве модели Снеддона. Заполните радиус сферического наконечника до 2,9 микрометров.Загрузите константу пружины и invOLS из файлов данных, включив чтение, затем нажмите «Готово». После анализа данных пройдитесь по силовым кривым. Исключите силовые кривые, где консольно приблизилась к поверхности отдела печени неправильно.Эти кривые имеют высокий уровень шума и аберрантные формы. После этого данные можно скопировать или экспортировать. В этом исследовании умеренно фиксированные участки печени, полученные от контрольных мышей и мышей с легким и прогрессирующим фиброзом, вызванным инъекцией тетрахлорметана, были исследованы с помощью AFM.Области, близкие к центральным венам, соответствующие областям, где обычно образуются коллагеновые волокна у мышей с тетрахлорметаном, были проанализированы в контрольной печени. Распределение модулей Юнга было воспроизводимым в разных областях в контрольной печени и областях, богатых коллагеном, в пределах одного участка печени. У мышей, получавших тетрахлорметан, карты жесткости, соответствующие перицентральным областям коллагеновых отложений, показали значительно более высокие значения модулей Юнга по сравнению с эквивалентными областями у контрольных мышей.Более того, наблюдалось значительное увеличение значений модулей Юнга при более длительном лечении. Также оценивалось влияние длительного хранения участков печени на механические свойства коллагеновых волокон. Измерения AFM показали значительно более низкие значения модулей Юнга в богатых коллагеном областях для участков, хранящихся в течение трех месяцев, по сравнению с теми, которые были получены в течение двух недель.Время фиксации сечения печени во многом определяет механические свойства печеночного отдела. Мы рекомендуем строго соблюдать временные интервалы, указанные в протоколе. После определенных оптимизаций в протоколе данный метод может быть использован для любых мягких тканей, демонстрирующих значительное отложение коллагена, которое обнаруживается с помощью поляризационной микроскопии.Данная методика предоставляет исследователям единый и удобный протокол для изучения механизма печени при здоровых и больных.

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Покадровый Визуализация Митоз После трансфекции миРНК

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Сотовые Электромуфтовая Визуализированные с флуоресцентной микроскопии

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

Живая клеточного ответа на механическое раздражение Учился по комплексному Оптические и атомно-силовой микроскопии

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

В естественных условиях Количественная оценка G белком рецептор взаимодействий с использованием спектрально Решено Двухфотонное микроскопии

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Микро-механические характеристики легочной ткани с помощью атомно-силовой микроскопии

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

Определение целей по правам микроРНК с Пробирной LightSwitch люциферазы системы с помощью 3&#39;UTR-репортер Формирует и микроРНК Mimic в прилипшие клетки

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Подготовка образцов для одной микроскопии атомной силы Virion и флуоресценции супер-разрешения

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

В естественных условиях клоновых Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников оцениваться пятью флуоресцентных белков с помощью конфокальной и многофотонной микроскопии

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Измерение Жесткость<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Аорте при помощи мыши атомно-силовой микроскопии

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Обнаружение Лиганда-активированный G-белками рецепторы интернализации с помощью конфокальной микроскопии

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...