Name: measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:00:00
Duration: 10 min 10 s
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Este trabajo fue apoyado por la Agencia de Subvenciones de la República Checa (18-02699S), el Proyecto de Investigación Institucional de la Academia Checa de Ciencias (RVO 68378050) y el proyecto MEYS CR NICR EXCELES (LX22NPO05102). CIISB, Instruct-CZ Centre of Instruct-ERIC EU consortium, financiado por el proyecto de infraestructura MEYS CR LM2018127 y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional-Proyecto "UP CIISB" (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) apoyó financieramente las mediciones en el CF Nanobiotechnology, CEITEC MU. También agradecemos a Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praga, República Checa, con el apoyo de MEYS (LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) y RVO: 68378050-KAV-NPUI, por su apoyo con las imágenes de microscopía presentadas en este documento.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

El protocolo presentado proporciona un método reproducible paso a paso para la medición de AFM de tejido hepático de ratón normal y fibrótico. La microscopía de polarización acoplada proporciona una alta precisión espacial y permite la visualización de las fibras de colágeno debido a su birrefringencia. Además, se proporciona una descripción detallada del análisis de las curvas de fuerza obtenidas. La medición de la rigidez de AFM se puede realizar a nivel celular, lo que permite controlar los cambios locales en las propiedades mecánicas del tejido hepático debido al desarrollo de la enfermedad fibrótica. La fibrosis hepática no es un proceso homogéneo que afecta a todo el órgano. Por el contrario, las áreas de septos fibróticos ricos en colágeno se intercalan con áreas de bajos o ningún depósito de colágeno. Por lo tanto, los cambios de rigidez son específicos del microambiente local y solo afectan a las células localmente en contacto con áreas dañadas por una lesión. Esta microescala de heterogeneidad de rigidez también es evidente en los detalles de los mapas de módulo de AFM Young, donde los puntos de alta rigidez bordean las áreas de rigidez casi normal. Esta variación muestra que incluso el área de tejido cicatricial de colágeno no es mecánicamente homogénea y requiere que la medición de AFM se caracterice a nivel celular (Figura 4).
El protocolo presentado permite las mediciones de la rigidez hepática por AFM independientemente de la colección hepática, ya que los lóbulos hepáticos enteros incrustados en OCT pueden almacenarse durante un período prolongado a -80 ° C. Sin embargo, una vez que se secciona el tejido, recomendamos medir las muestras dentro de ~ 2 semanas, ya que hemos observado un ablandamiento gradual de las secciones de tejido almacenadas durante períodos de tiempo más largos (Figura 5).
El AFM equipado con microscopía de polarización permite localizar con precisión el área de interés dentro de la estructura del lóbulo hepático. Sin embargo, también tiene algunas limitaciones que deben considerarse al interpretar los resultados. Los valores de rigidez obtenidos aquí se midieron a temperatura ambiente. Suponemos que los efectos de la temperatura sobre las propiedades mecánicas de los tejidos blandos serán pequeños; Sin embargo, esta podría ser una de las razones de las diferencias entre los valores in vivo informados de las propiedades mecánicas de los tejidos hepáticos y los valores de este estudio.
Además, este protocolo permite el análisis de AFM del tejido hepático durante un máximo de 3 h, lo que requiere una fijación leve del tejido. La fijación leve de las secciones de tejido, así como el ciclo de congelación-descongelación, probablemente afectarán los valores absolutos del módulo de Young. Por lo tanto, los valores reportados de los módulos de Young pueden diferir de los valores in vivo . Se necesitan más estudios para optimizar el protocolo para la medición de los valores absolutos del módulo de Young a partir de secciones hepáticas, lo que puede lograrse mediante un método diferente para la fijación del tejido hepático64.
No obstante, observamos un aumento de la rigidez de las áreas ricas en colágeno en los hígados de ratones tratados con CCl4 durante 3 semanas en comparación con 6 semanas. Tales cambios corresponden a la progresión de la fibrosis durante la lesión prolongada (Figura 4) y muestran que las diferencias relativas pueden ser probadas entre diferentes tratamientos utilizando el protocolo presentado. Esto está de acuerdo con las observaciones de Calò et al., quienes mostraron que las secciones hepáticas ligeramente fijas muestran diferencias similares en los valores de rigidez entre las áreas ricas en colágeno y carentes de colágeno que en el tejido fresco25.
Utilizamos el voladizo SD-qp-BioT-TL-10 (constante de resorte teórica ~0.09 N / m) modificado con una punta esférica de 5.7 μm de diámetro para minimizar la interrupción mecánica del tejido hepático durante las mediciones. Un cordón de 5,7 μm permitió una hendidura suficiente de la muestra para sondear su rigidez preservando su integridad. Se puede usar una cuenta con un diámetro más pequeño, después de varias optimizaciones, para obtener una mayor resolución en los mapas de rigidez, pero podría conducir a una mayor sobreestimación de los valores del módulo de Young (para más detalles, ver Crichton et al.65). Usando el conjunto de talón en voladizo especificado, pudimos caracterizar la rigidez de la muestra en un amplio rango, desde decenas de unidades de Pa hasta ~ 100 kPa.
El modelo de Sneddon se utilizó para derivar el módulo de Young a partir de curvas de fuerza, ya que permite el análisis de hendiduras profundas con sondas coloidales62. El modelo de Sneddon, a diferencia del modelo de Hertz, no sufre de la restricción de que el radio de contacto debe ser mucho menor que el radio de la esfera. Además, asume que el espesor de la muestra es varias veces mayor que la profundidad de hendidura30,66. En el presente estudio, la hendidura fue de ~2 μm con un tamaño de perla de 5,7 μm y un espesor de muestra de 30 μm en áreas ricas en colágeno; por lo tanto, el modelo de Sneddon era apropiado. Otros modelos63 considerando la fuerza de adhesión entre la punta y el sustrato pueden ser utilizados para diferentes tipos de tejidos.
El análisis en AtomicJ implementa correcciones para el espesor finito de las muestras para minimizar la contribución de un sustrato mientras deriva el módulo de Young62,67. En el análisis de las curvas de fuerza obtenidas, utilizamos una única relación de Poisson de 0,45, que ha sido previamente recomendada para órganos de tejidos blandos24. Esta aproximación no tiene un efecto significativo en los valores calculados del módulo de Young, ya que el cambio en el valor de la relación de Poisson de 0,4 a 0,5 resulta sólo en una disminución de 0,893x en los valores del módulo de Young calculados de acuerdo con la ecuación de Sneddon. Dadas las múltiples diferencias en el módulo de Young entre las diferentes duraciones de los tratamientos con CCl4, los errores producidos al aproximar la relación de Poisson son solo marginales.
Se utilizaron curvas de retirada para calcular los valores de rigidez, ya que estábamos interesados en la respuesta elástica del tejido a la carga proporcionada por el voladizo más que en la respuesta plástica a la hendidura68. Debido a la respuesta viscoelástica del tejido blando, el ajuste de curvas de retirada podría sobrestimar el módulo de Young, lo que debe tenerse en cuenta. Además, hemos observado que el análisis de datos con curvas de aproximación arroja tendencias similares en los valores de rigidez entre las áreas fibróticas y control, aunque los valores absolutos son correspondientemente más bajos (datos no mostrados).
Al optimizar el protocolo, identificamos varios pasos críticos para la reproducibilidad de las mediciones. Primero, es importante asegurarse de que la cuenta esté aproximadamente en el centro de la punta translúcida mientras se conecta al voladizo. Esto evita un posible desequilibrio mecánico durante la hendidura. En segundo lugar, durante la fijación hepática con PFA, es necesario seguir estrictamente los límites de tiempo para la descongelación y la fijación. Cambiar el tiempo de este paso podría afectar gravemente las propiedades mecánicas de las secciones de tejido. En tercer lugar, el voladizo debe calibrarse repetidamente con monitoreo continuo e ingreso de valores de temperatura concurrentes para evitar que ocurran artefactos en valores de rigidez debido a fluctuaciones de temperatura. Por último, una sola sección hepática no debe medirse durante más de 3 h desde la preparación, ya que el PBS superpuesto puede evaporarse durante períodos más largos. Los lectores pueden consultar la tabla de resolución de problemas (Tabla 3) para resolver los problemas encontrados durante la medición de AFM, también discutida en detalle en Norman et al.46.
Tabla 3: Guía de solución de problemas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%203v2.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
El protocolo presentado permite el sondeo reproducible de AFM del tejido hepático. Tiene el potencial de revelar información sobre el desarrollo y la eventual regresión de la enfermedad hepática fibrótica a nivel microscópico y puede contribuir al desarrollo de terapias dirigidas a las regiones cicatriciales fibróticas formadas durante la progresión de la enfermedad hepática crónica.

El hígado es un órgano vital para mantener la homeostasis en los organismos 1,2. Las enfermedades hepáticas crónicas representan ~ 2 millones de muertes en todo el mundo anualmente3. Se originan más comúnmente como infecciones virales, trastornos autoinmunes, síndromes metabólicos o enfermedades relacionadas con el abuso de alcohol y se acompañan de fibrosis hepática progresiva. La lesión hepática provoca una respuesta inflamatoria, que conduce a la activación de las células que depositan la matriz extracelular (MEC) en una respuesta de curación de heridas. Sin embargo, en presencia de un insulto crónico, el exceso de ECM forma tejido cicatricial no resuelto dentro del hígado, lo que lleva al desarrollo de fibrosis hepática, cirrosis, carcinoma hepático y, en última instancia, a insuficiencia hepática4.
La lesión de hepatocitos resulta inmediatamente en un aumento de la rigidez hepática 5,6. Esto afecta directamente la función de los hepatocitos, activa las células estrelladas hepáticas (HSC) y los fibroblastos portales, y resulta en su transdiferenciación a miofibroblastos depositadores de colágeno 7,8. La deposición de ECM fibrosa aumenta aún más la rigidez hepática, creando un bucle de retroalimentación autoamplificante de rigidez hepática y activación celular productora de matriz.
La rigidez hepática se ha convertido, por lo tanto, en un parámetro importante en el pronóstico de la enfermedad hepática. El cambio en las propiedades biomecánicas del tejido se puede detectar antes de que la fibrosis se pueda diagnosticar mediante análisis histológico. Por lo tanto, se han desarrollado varias técnicas para la medición de la rigidez hepática tanto en investigación como en aplicaciones clínicas. En entornos clínicos, la elastografía transitoria (ET)9,10,11,12,13 y la elastografía por resonancia magnética (ERM)14,15,16,17,18 han sido empleadas para diagnosticar de forma no invasiva estadios precocedores del daño hepático mediante el examen de la rigidez hepática macroscópica 19.
En la ET, las ondas de ultrasonido de amplitud leve y baja frecuencia (50 Hz) se propagan a través del hígado, y se mide su velocidad, que luego se utiliza para calcular el módulo elásticotisular 13. Sin embargo, esta técnica no es útil para pacientes con ascitis, obesidad o espacios intercostales inferiores debido a la transmisión inadecuada de las ondas de ultrasonido a través de los tejidos que rodean el hígado9.
MRE se basa en la modalidad de resonancia magnética y utiliza ondas de corte mecánico de 20-200 Hz para apuntar al hígado. Luego se utiliza una secuencia específica de imágenes de resonancia magnética para rastrear las ondas dentro del tejido y calcular la rigidez del tejido16. Los valores de rigidez reportados con las técnicas TE y MRE se correlacionan bien con el grado de fibrosis hepática obtenido de biopsias de muestras de hígado humano clasificadas utilizando puntuaciones histológicas METAVIR20 (Tabla 1). TE y MRE también han sido adaptados para la medición de la rigidez hepática en modelos de roedores con fines de investigación21,22,23. Sin embargo, como ambos métodos derivan los valores de rigidez de la respuesta del tejido a las ondas de cizallamiento que se propagan, los valores obtenidos podrían no reflejar la rigidez mecánica absoluta del tejido.
Para una caracterización mecánica directa de hígados de roedores, Barnes et al. desarrollaron un ensayo modelo-gel-tejido (ensayo MGT) que involucra la incrustación de tejido hepático en gel de poliacrilamida24. Este gel está comprimido por una fuerza uniforme pulsada a partir de la cual se puede calcular el módulo de Young. El ensayo de MGT muestra una buena correlación con un ensayo de indentación adaptado tanto para hígados normales como fibróticos24 (Tabla 1).
Tabla 1: Valores de rigidez hepática a nivel de volumen. TE y MRE comparadas con mediciones mecánicas directas ex vivo de módulos elásticos hepáticos utilizando indentación y ensayos MGT para hígados de diferentes fuentes. La relación entre E y G viene dada por E = 2G (1 + v), donde v es la relación de Poisson de la muestra; F0 a F4 representan la puntuación de fibrosis en el sistema de puntuación METAVIR, con F0 denotando fibrosis baja o nula e hígados cirróticos F4. Abreviaturas: TE = elastografía transitoria; ERM = elastografía por resonancia magnética; MGT = modelo-gel-tejido; E = módulo elástico (de Young); G = módulo de corte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%201v2.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Uno de los principales inconvenientes de las mediciones genéricas de rigidez hepática es que no proporcionan una resolución a nivel celular de la heterogeneidad de rigidez en el hígado. Durante la progresión de la fibrosis, las áreas ricas en colágeno muestran mayor rigidez en comparación con el parénquima circundante25,26. Este gradiente de rigidez influye localmente en las células residentes y juega un papel importante en la conducción de la heterogeneidad de HSC27. Por lo tanto, los cambios en las propiedades mecánicas locales durante el desarrollo de la enfermedad hepática deben caracterizarse a nivel microscópico para comprender mejor la progresión de la fibrosis.
AFM permite medir las propiedades mecánicas del tejido con alta resolución y alta sensibilidad de fuerza. AFM utiliza la punta de un voladizo para indentar la superficie de una muestra con fuerzas tan bajas como varios piconewtons, induciendo una deformación a nivel microscópico o nanoscópico basado en la geometría y el tamaño de la punta empleada. La respuesta de fuerza de la muestra a la deformación aplicada se mide entonces como la deflexión en el voladizo28. Las curvas de fuerza-desplazamiento se recogen de la aproximación y retracción del voladizo, que puede equiparse con modelos mecánicos de contacto apropiados para evaluar la rigidez local de la muestra29.
Además de medir la rigidez de un área determinada, AFM también puede proporcionar información topográfica sobre características específicas de la muestra, como la estructura de las fibras de colágeno30,31,32. Múltiples estudios han descrito la aplicación de AFM para medir la rigidez de varios tejidos sanos y enfermos, como la piel 32,33, pulmón 34,35, cerebro36, mamario37,38,39, cartílago 40 o corazón41,42,43,44 de muestras de pacientes y modelos de ratón. Además, la AFM también se ha utilizado in vitro para determinar la rigidez de células y andamios de proteínas extracelulares45,46,47.
La medición de las propiedades mecánicas de las muestras biológicas utilizando AFM no es trivial debido a su suavidad y fragilidad. Por lo tanto, varios estudios han estandarizado diferentes condiciones y entornos, que producen valores ampliamente fluctuantes de los módulos de Young (revisado por Mckee et al.48). Al igual que en otros tejidos blandos, los valores del módulo de Young hepático en diferentes grados de fibrosis hepática también muestran una amplia variación (Tabla 2). Las diferencias en los valores del módulo de Young surgen de diferencias en el modo de operación de AFM, punta en voladizo, método de preparación de muestras, grosor de la muestra, profundidad y fuerzas de indentación, entorno del tejido hepático durante la medición y método de análisis (Tabla 2).
Tabla 2: Valores de rigidez hepática a nivel celular. Los valores de rigidez hepática obtenidos mediante AFM describen las propiedades mecánicas del hígado a nivel celular. Abreviaturas: AFM = microscopía de fuerza atómica; E = módulo elástico (de Young); PFA = paraformaldehído; PBS = solución salina tamponada con fosfato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%202v2.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Este artículo describe un protocolo para la medición reproducible de los módulos de Young de áreas fibróticas ricas en colágeno en tejido hepático mediante AFM con una localización precisa proporcionada por el uso de microscopía de polarización. Administramos tetracloruro de carbono (CCl4) para inducir la deposición de colágeno de manera centrilobular49 en un modelo de ratón, imitando de manera confiable aspectos cruciales de la fibrosis hepática humana50. Las imágenes microscópicas polarizadas permiten la visualización del colágeno en el hígado debido a la birrefringencia de las fibras de colágeno51, lo que permite el posicionamiento preciso de la punta en voladizo sobre el área de interés deseada dentro del lóbulo hepático52.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >AFM head</td>
			<td >Bruker</td>
			<td >JPK nanowizard 3</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cameras</td>
			<td >Andor</td>
			<td >Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >The Imagingsource&#160;</td>
			<td >S/N:12310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cantilever</td>
			<td >SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors</td>
			<td>S/N:73750F05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryotome</td>
			<td >Leica&#160;</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epoxy resin glue (Long working time )</td>
			<td >Bison epoxy universal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Melamine beads; diameter, 5.7 um</td>
			<td >Microparticles, GmbH</td>
			<td>MF-R-5.7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td>&#160;IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrophobic&#160; slide marker</td>
			<td >SuperHT</td>
			<td>PAP PEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td >JPK nanowizard&#160; v6.1.151</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >AtomicJ v2.3.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost slides</td>
			<td >Thermoscientific</td>
			<td>ref no. J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >System</td>
			<td >Ubuntu 14.04.5 LTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibration isolation control unit</td>
			<td >Tablestable</td>
			<td>AVI-200-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy

El endurecimiento de la matriz ha sido reconocido como uno de los principales impulsores de la progresión de la fibrosis hepática. Tiene efectos profundos en varios aspectos del comportamiento celular, como la función celular, la diferenciación y la motilidad. Sin embargo, como estos procesos no son homogéneos en todo el órgano, se ha vuelto cada vez más importante comprender los cambios en las propiedades mecánicas de los tejidos a nivel celular.
Para poder monitorear el endurecimiento de las áreas ricas en colágeno dentro de los lóbulos hepáticos, este artículo presenta un protocolo para medir los módulos elásticos del tejido hepático con alta precisión espacial mediante microscopía de fuerza atómica (AFM). AFM es un método sensible con el potencial de caracterizar propiedades mecánicas locales, calculadas como módulo de Young (también conocido como elástico). La AFM junto con la microscopía de polarización se puede utilizar para localizar específicamente las áreas de desarrollo de la fibrosis en función de la birrefringencia de las fibras de colágeno en los tejidos. Usando el protocolo presentado, caracterizamos la rigidez de las áreas ricas en colágeno de hígados fibróticos de ratones y las áreas correspondientes en los hígados de ratones control.
Se observó un aumento prominente en la rigidez de las áreas positivas de colágeno con el desarrollo de fibrosis. El protocolo presentado permite un método altamente reproducible de medición de AFM, debido al uso de tejido hepático ligeramente fijo, que se puede utilizar para mejorar la comprensión de los cambios iniciados por la enfermedad en las propiedades mecánicas locales del tejido y su efecto sobre el destino de las células vecinas.

Secciones hepáticas levemente fijas, de 30 μm de espesor obtenidas de ratones control y de ratones con fibrosis leve o avanzada (inducida por inyección de CCl4 durante 3 semanas o 6 semanas, respectivamente49) se probaron con AFM como se describe en este protocolo. Se seleccionaron fibras de colágeno cercanas a las venas centrales para la medición de mapas de rigidez. Las áreas cercanas a las venas centrales, que corresponden a las áreas donde generalmente se forman las fibras de colágeno en animales tratados con CCl4, se analizaron en hígados control (Figura 4A). La distribución de los módulos de Young fue reproducible a través de diferentes hígados de control y áreas ricas en colágeno dentro de una sola sección hepática (Figura 4B: diagrama de violín izquierdo).
En animales tratados con CCl 4, los mapas de rigidez correspondientes a las áreas pericentrales de los depósitos de colágeno mostraron valores significativamente más altos de los módulos de Young en comparación con las áreas equivalentes en ratones control (Figura 4B: 1.9 kPa vs. 2.6 kPa mediana de los valores del módulo de Young para el control vs. 3 semanas de ratón tratado con CCl 4; p = 0.07; 1.9 kPa vs. 5.1 kPa mediana Valores del módulo de Young para control vs. 6 semanas CCl4 -ratón tratado; p = 0,02). Además, hubo un aumento significativo en los valores de los módulos de Young con un tratamiento más prolongado con CCl 4 (Figura 4B; 2,6 kPa vs. 5,1 kPa mediana de los valores del módulo de Young para 3 semanas vs. 6 semanas CCl4-tratado ratón; p = 0,04). Esto muestra un endurecimiento gradual de los depósitos de colágeno con progresión de la fibrosis y que las mediciones de AFM reflejan la fibrogénesis.
Para evaluar el efecto del almacenamiento prolongado de secciones hepáticas incrustadas en OCT sobre las propiedades mecánicas de las fibras de colágeno, medimos la rigidez de las fibras de colágeno en secciones de ratones tratados con CCl4, que se almacenaron a -80 ° C durante 2 semanas o 3 meses en el portaobjetos después del corte (Figura 5). Las mediciones de AFM mostraron valores significativamente más bajos de los módulos de Young en áreas ricas en colágeno para secciones almacenadas durante 3 meses en comparación con las obtenidas de secciones medidas dentro de las 2 semanas posteriores a la sección de la muestra (Figura 5; 4.7 kPa vs. 3.6 kPa mediana de los valores del módulo de Young para 2 semanas vs. 3 meses de almacenamiento; p < 0.001). Por lo tanto, es importante medir las propiedades mecánicas del tejido hepático poco después de que las secciones se preparan a partir de los lóbulos hepáticos incrustados en OCT.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig04.jpg"> Figura 4: Las mediciones de AFM revelan rigidez progresiva de las áreas ricas en colágeno que se correlacionan con el tratamiento prolongado con CCl4. (A) Se utilizaron secciones hepáticas de ratones control y ratones tratados con CCl4 durante 3 semanas o 6 semanas para medir las propiedades mecánicas de las áreas ricas en colágeno. Las áreas en caja de las secciones hepáticas que se muestran en las imágenes de microscopía polarizada (izquierda) son áreas de exploración ricas en colágeno (o regiones correspondientes en el hígado de control) seleccionadas para mediciones de AFM (30 μm x 100 μm, 10 píxeles x 36 píxeles). Los mapas del módulo de Young con escalas de color correspondientes a estas áreas en caja se muestran a la derecha, incluidos los histogramas de los valores del módulo de Young de estos mapas; los gráficos de dispersión de inserción muestran valores >10 kPa para cada condición. La rigidez del hígado se visualiza como un desplazamiento gradual hacia la derecha en la distribución del histograma y una mayor frecuencia de puntos en el diagrama de dispersión de recuadro. Barra de escala = 20 μm. (B) Los diagramas de violín muestran la distribución de los módulos elásticos de tres áreas medidas para cada condición (izquierda) y los valores de módulos elásticos resumidos de los tres mapas (derecha). Los diagramas de violín muestran la mediana (línea roja), el percentil 25 yel percentil 75 (líneas negras); Los puntos representan los valores medios de los mapas individuales de las áreas 1-3. Los valores p presentados se calcularon mediante una prueba t de Student realizada en medias. Abreviaturas: AFM = microscopía de fuerza atómica; CCl4 = tetracloruro de carbono. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig05.jpg"> Figura 5: El almacenamiento prolongado de secciones hepáticas conduce a una disminución de la rigidez de las áreas ricas en colágeno. Se utilizaron secciones hepáticas (preparadas a partir de ratones tratados con CCl4 durante 2 semanas) almacenadas a -80 °C durante 2 semanas o 3 meses para medir el módulo de Young. Imágenes de microscopía polarizada (izquierda) con cuadros que indican las áreas ricas en colágeno utilizadas para la medición de AFM (30 μm x 100 μm, 10 píxeles x 36 píxeles). Mapas de módulo de Young correspondientes con escalas de color (derecha). Los histogramas muestran los valores del módulo de Young recogidos de 4-6 áreas en cada muestra; Los gráficos de dispersión insertados muestran valores >10 kPa para cada condición. Barra de escala = 20 μm. Abreviaturas: AFM = microscopía de fuerza atómica; CCl4 = tetracloruro de carbono. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura suplementaria S1: Método para modificar el voladizo con una microperla de resina de melamina. (A) El esquema dibujado ilustra la fijación de una cuenta esférica a la punta del voladizo. Para obtener una descripción paso a paso, consulte la Sección 2, Parte 1, Fijación de un cordón de 5,7 μm a la punta en voladizo AFM. (B) Imagen microscópica de una cuenta esférica de 5,7 μm unida a la punta en voladizo que se muestra desde la vista superior (izquierda) y lateral (derecha). Barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: AFM = microscopía de fuerza atómica; RT = temperatura ambiente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%201.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria S2: Análisis de datos en AtomicJ. (A) La secuencia de pasos a seguir para abrir mapas de rigidez en AtomicJ. Un solo clic izquierdo en las curvas de fuerza de proceso y los mapas (x) abre el asistente de procesamiento. Los archivos se pueden cargar en el asistente de procesamiento haciendo clic en agregar (y) y seleccionando los archivos requeridos. Haga clic en siguiente (z) para continuar con el siguiente paso. (B) Parámetros para el ajuste de curvas, modelo de mecánica de contacto apropiado y ajustes de AFM utilizados durante la medición. Los pasos 1-11 se refieren a los subpuntos correspondientes detallados en el paso 3 del protocolo, Sección 5, Análisis de datos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary_fig_2.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria S3: Esquema de los datos analizados en AtomicJ. La vista previa de los datos analizados muestra mapas de rigidez (ventana superior izquierda), curvas de fuerza (ventana superior derecha) y datos sin procesar (ventana inferior). Abreviatura: AFM = microscopía de fuerza atómica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%203.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy at JoVE.com

Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

Presentamos un protocolo para medir los módulos elásticos de áreas ricas en colágeno en hígado normal y enfermo utilizando microscopía de fuerza atómica. El uso simultáneo de microscopía de polarización proporciona una alta precisión espacial para localizar áreas ricas en colágeno en las secciones hepáticas.

Medición de la rigidez hepática mediante microscopía de fuerza atómica junto con microscopía de polarización

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

Nuestro protocolo proporciona una distinción entre áreas ricas en colágeno y áreas que carecen de colágeno en las secciones del hígado. Por lo tanto, se puede utilizar para estudiar los procesos de fibrogénesis con mayor detalle. La principal ventaja de la técnica radica en el uso de microscopía polarizadora para localizar áreas ricas en colágeno en las secciones hepáticas.Nuestros protocolos pueden proporcionar una gran información sobre el desarrollo de la fibrosis hepática, y también se puede adoptar para otros tejidos blandos como los pulmones después de ciertas optimizaciones. Para comenzar, retire las secciones de hígado congeladas de menos 80 grados centígrados y descongélelas a temperatura ambiente durante dos minutos. Arregle las secciones con paraformaldehído al 4% frío en PBS durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, seguido de lavar cinco veces con PBS.Después del último lavado, limpie el exceso de PBS alrededor de la sección hepática con pañuelo de papel y marque un límite de aproximadamente dos por cuatro centímetros alrededor de la sección hepática con un rotulador hidrófobo. Cubra la muestra con PBS, luego cargue la muestra en la etapa AFM y cúbrala con el cabezal AFM. En el software de microscopía de fuerza atómica o AFM, vaya a la pestaña de configuración y marque una marca en el guardado automático para guardar automáticamente todos los archivos.Luego especifique el nombre del archivo y el directorio para guardar los archivos de medición yendo a la pestaña de configuración y haciendo clic en guardar la configuración. Acérquese a la superficie del tejido con el voladizo AFM encendiendo el láser y haciendo clic en la tecla de aproximación. Una vez completada la aproximación, retraiga la punta en voladizo haciendo clic en la tecla de retracción una vez, lo que retrae el voladizo hasta el extremo superior del rango piezoeléctrico.Si es necesario, vuelva a alinear el detector utilizando perillas en el cabezal AFM. Apague el láser. La punta está ahora en el foco del objetivo.A continuación, superponga el campo óptico del microscopio con mapas de medición AFM haciendo clic en la pestaña de accesorios y seleccionando la calibración óptica de superposición directa. En la ventana siguiente, haga clic en siguiente para tomar una serie de imágenes del voladizo escaneando un área específica. Haga clic en siguiente de nuevo para ir a la siguiente ventana.En la primera imagen, haga clic en el centro de la punta del voladizo manualmente para representar la posición de la punta en el software. El círculo que representa la posición de la punta se puede manipular en tamaño indicando su radio para aumentar la precisión. Haga clic en calibrar para detectar automáticamente la posición de la punta en voladizo en todas las imágenes.Confirme la precisión de la detección de puntas revisando las imágenes. Haga clic en siguiente y, a continuación, finalice para finalizar la superposición óptica. A continuación, mueva el escenario para colocar un área rica en colágeno dentro del cuadro verde, visible en la pestaña del visor de datos, utilizando la imagen polarizada.Seleccione el área rica en colágeno definiendo el área en la pestaña de cuadrícula y luego haciendo un rectángulo en la pestaña del visor de datos presionando prolongadamente el botón izquierdo del mouse dentro del cuadro verde especificado. Haga clic en confirmar nueva región de escaneo para establecer el área seleccionada como área de medición. Establezca los parámetros del bucle de retroalimentación.Establece la ganancia I en 50 hercios y la ganancia P en 0.001. Luego establezca el punto de ajuste en un nano Newton. Seleccione el valor relativo del punto de ajuste de acuerdo con las propiedades mecánicas de los materiales estudiados y la rigidez del voladizo.Especifique una línea base justa para ajustar correctamente las curvas de fuerza. A continuación, seleccione la longitud del movimiento en voladizo en el eje Z de acuerdo con la topografía de la superficie de la muestra. Establezca el movimiento Z en duración constante.Establezca el tiempo de extensión a un segundo con retrasos de extensión y retracción como cero. Establezca la frecuencia de muestreo en 5, 000 hertzios. Marque una marca delante del bucle cerrado Z para ajustar automáticamente la distancia entre la muestra y la punta en voladizo durante las mediciones.A continuación, desconecte el control de escenario motorizado anulando la selección del botón de activación. Encienda el láser y acérquese a la muestra con el voladizo. Haga clic en iniciar escaneo para recopilar curvas de distancia de fuerza.Analice los datos adquiridos utilizando el software de código abierto AtomicJ. Cargue las curvas de fuerza en el programa haciendo clic en el icono de curvas y mapas de fuerza de proceso. Luego, en el asistente de procesamiento, agregue los mapas a analizar haciendo clic en el botón agregar.Después de cargar los mapas, haga clic en siguiente. Especifique la configuración de procesamiento en la siguiente ventana. Para estimar automáticamente el punto de contacto entre la muestra y el voladizo utilizando un conjunto de parámetros de curva de ajuste, utilice la estimación automática del punto de contacto.Determine el punto de contacto entre el voladizo y la muestra mediante el método clásico de cuadrícula enfocada. Seleccione el método de estimación como el método independiente del modelo para obtener la mejor determinación del punto de contacto en función de la calidad de las curvas de fuerza medidas, que debe determinarse empíricamente durante la optimización del análisis de datos. Ajuste la curva de indentación de fuerza utilizando un modelo clásico como L dos clásico para el ajuste del modelo.Ajuste el modelo a la curva de retirada. Establezca la proporción de Poisson en 0.45 como se recomienda para tejidos blandos como el hígado. Ajuste la curva utilizando un grado de referencia de tres y un grado de contacto de uno.Cambiar el grado de ajuste polinómico en función de la escala de desviaciones de las curvas del modelo. Seleccione el modelo utilizado para ajustar las curvas de retirada como el modelo de Sneddon. Rellene el radio de la punta esférica a 2,9 micrómetros.Cargue la constante de resorte e invOLS desde los archivos de datos habilitando la lectura, luego haga clic en finalizar. Después del análisis de datos, vaya a través de las curvas de fuerza. Excluya las curvas de fuerza donde el voladizo se acercó incorrectamente a la superficie de la sección hepática.Estas curvas tienen mucho ruido y formas aberrantes. Después de esto, los datos se pueden copiar o exportar. En este estudio, las secciones hepáticas ligeramente fijas obtenidas de los ratones control y ratones con fibrosis leve y avanzada inducida por la inyección de tetracloruro de carbono se probaron con AFM.Las áreas cercanas a las venas centrales correspondientes a las áreas donde generalmente se forman las fibras de colágeno en ratones con tetracloruro de carbono se analizaron en hígados de control. La distribución de los módulos de Young fue reproducible a través de diferentes regiones en hígados de control y áreas ricas en colágeno dentro de una sola sección hepática. En ratones tratados con tetracloruro de carbono, los mapas de rigidez correspondientes a las áreas pericentrales de los depósitos de colágeno mostraron valores significativamente más altos de los módulos de Young en comparación con las áreas equivalentes en ratones control.Además, hubo un aumento significativo en los valores de los módulos de Young con un tratamiento más prolongado. También se evaluó el efecto del almacenamiento prolongado de secciones hepáticas sobre las propiedades mecánicas de las fibras de colágeno. Las mediciones de AFM mostraron valores significativamente más bajos de los módulos de Young en áreas ricas en colágeno para secciones almacenadas durante tres meses, en comparación con las obtenidas en dos semanas.El tiempo de fijación de la sección hepática determina en gran medida las propiedades mecánicas de la sección hepática. Recomendamos que se sigan estrictamente los intervalos cronometrados establecidos en el protocolo. Después de ciertas optimizaciones en el protocolo, el método dado se puede utilizar para cualquier tejido blando que muestre una deposición significativa de colágeno, que es detectable por microscopía polarizada.La técnica dada proporciona a los investigadores un protocolo unificado y conveniente para estudiar el mecanismo del hígado a través de sanos y enfermedades.

Research

JoVE Journal

Biology

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Investigación

Biología

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