Name: measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Tjeckiens bidragsbyrå (18-02699S), den tjeckiska vetenskapsakademins institutionella forskningsprojekt (RVO 68378050) och MEYS CR-projektet NICR EXCELES (LX22NPO05102). CIISB, Instruct-CZ Centre of Instruct-ERIC EU consortium, finansierat av MEYS CR infrastrukturprojekt LM2018127 och Europeiska regionala utvecklingsfonden-Project "UP CIISB" (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) gav ekonomiskt stöd till mätningarna vid CF Nanobiotechnology, CEITEC MU. Vi erkänner också Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Prag, Tjeckien, som stöds av MEYS (LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) och RVO: 68378050-KAV-NPUI, för deras stöd med mikroskopiavbildningen som presenteras häri.

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Det presenterade protokollet tillhandahåller en steg-för-steg reproducerbar metod för AFM-mätning av normal och fibrotisk muslevervävnad. Kopplad polarisationsmikroskopi ger hög rumslig precision och möjliggör visualisering av kollagenfibrer på grund av deras birefringence. Vidare tillhandahålls en detaljerad beskrivning av analysen av de erhållna kraftkurvorna. AFM-styvhetsmätning kan utföras på cellnivå, vilket gör det möjligt att övervaka lokala förändringar i levervävnadens mekaniska egenskaper på grund av att utveckla fibrotisk sjukdom. Leverfibros är inte en homogen process som påverkar hela organet. Tvärtom varvas områden med kollagenrika fibrotiska septa med områden med låga eller inga kollagenavlagringar. Således är styvhetsförändringar specifika för den lokala mikromiljön och påverkar endast celler lokalt i kontakt med områden som skadats av skada. Denna mikroskala av styvhetsheterogenitet framgår också av detaljerna i AFM Youngs modulkartor, där punkter med hög styvhet gränsar till områdena med nästan normal styvhet. Denna variation visar att även kollagenärrvävnadsområdet inte är mekaniskt homogent och kräver att AFM-mätning karakteriseras på cellnivå (figur 4).
Det presenterade protokollet möjliggör mätningar av leverstyvhet av AFM oberoende av leveruppsamlingen, eftersom hela leverloberna inbäddade i OCT kan lagras under en längre period vid −80 °C. Men när vävnaden är snittad rekommenderar vi att du mäter proverna inom ~ 2 veckor eftersom vi har observerat en gradvis mjukning av vävnadssektioner som lagras under längre perioder (figur 5).
AFM utrustad med polarisationsmikroskopi gör det möjligt att exakt lokalisera intresseområdet inom leverlobulestrukturen. Det har dock också vissa begränsningar som måste beaktas vid tolkningen av resultaten. De styvhetsvärden som erhölls här mättes vid rumstemperatur. Vi antar att effekterna av temperatur på de mekaniska egenskaperna hos mjukvävnad kommer att vara små; Detta kan dock vara en av anledningarna till skillnader mellan de rapporterade in vivo-värdena för mekaniska egenskaper hos levervävnader och värdena i denna studie.
Dessutom tillåter detta protokoll AFM-analys av levervävnad i upp till 3 timmar, vilket kräver mild fixering av vävnaden. Den milda fixeringen av vävnadssektioner, liksom frys-upptiningscykeln, kommer sannolikt att påverka de absoluta värdena för Youngs modul. Således kan de rapporterade värdena för Youngs moduli skilja sig från in vivo-värden . Ytterligare studier behövs för att optimera protokollet för mätning av absoluta värden av Youngs modul från leversektioner, vilket kan uppnås med en annan metod för fixering av levervävnad64.
Icke desto mindre, Vi observerade ökande styvhet av kollagenrika områden i levern hos möss som behandlats med CCl4 för 3 veckor jämfört med 6 veckor. Sådana förändringar motsvarar fibrosprogression under långvarig skada (figur 4) och visar att relativa skillnader kan undersökas mellan olika behandlingar med hjälp av det presenterade protokollet. Detta överensstämmer med observationerna från Calò et al., som visade att milt fasta leversektioner visar liknande skillnader i styvhetsvärden mellan kollagenrika och kollagenfattiga områden som i färsk vävnad25.
Vi använde SD-qp-BioT-TL-10 cantilever (teoretisk fjäderkonstant ~ 0,09 N / m) modifierad med en sfärisk spets på 5,7 μm diameter för att minimera mekanisk störning av levervävnaden under mätningar. En pärla på 5,7 μm möjliggjorde tillräcklig indragning av provet för att undersöka dess styvhet samtidigt som dess integritet bevarades. En pärla med mindre diameter kan efter flera optimeringar användas för att få högre upplösning i styvhetskartorna men kan leda till ytterligare överskattning av Youngs modulvärden (för mer information, se Crichton et al.65). Med hjälp av den angivna cantilever-pärlensemblen kunde vi karakterisera provstyvhet i ett brett spektrum, från tiotals enheter av Pa till ~ 100 kPa.
Sneddons modell användes för att härleda Youngs modul från kraftkurvor, eftersom den möjliggör analys av djupa indragningar med kolloidala sonder62. Sneddons modell, till skillnad från Hertz modell, lider inte av begränsningen att kontaktradien måste vara mycket mindre än sfärradien. Det förutsätter vidare att provtjockleken är flera gånger större än indragningsdjupet 30,66. I den aktuella studien var indragningen ~ 2 μm med en pärlstorlek på 5,7 μm och en provtjocklek på 30 μm i kollagenrika områden; således var Sneddons modell lämplig. Andra modeller63 med tanke på vidhäftningskraften mellan spets och substrat kan användas för olika typer av vävnader.
Analys i AtomicJ implementerar korrigeringar för provernas ändliga tjocklek för att minimera bidraget från ett substrat samtidigt som Youngs modul62,67 härleds. I analysen av de erhållna kraftkurvorna använde vi ett enda Poissons förhållande på 0,45, vilket tidigare har rekommenderats för mjukvävnadsorgan24. Denna approximation har ingen signifikant effekt på beräknade värden på Youngs modul, eftersom förändringen i värdet på Poissons förhållande från 0,4 till 0,5 endast resulterar i en minskning med 0,893x av Youngs modulvärden beräknade enligt Sneddons ekvation. Med tanke på de flerfaldiga skillnaderna i Youngs modul mellan de olika varaktigheterna av CCl4-behandlingar är de fel som produceras genom att approximera Poissons förhållande endast marginella.
Vi använde abstinenskurvor för att beräkna styvhetsvärden, eftersom vi var intresserade av vävnadens elastiska respons på belastningen som tillhandahålls av cantilever snarare än i plastsvaret på indragning68. På grund av den viskoelastiska responsen hos mjukvävnaden kan passande uttagskurvor överskatta Youngs modul, vilket bör hållas i åtanke. Dessutom har vi observerat att dataanalys med inflygningskurvor ger liknande trender i styvhetsvärden mellan fibrotiska och kontrollområden, även om de absoluta värdena är motsvarande lägre (data visas inte).
När vi optimerade protokollet identifierade vi flera steg som var kritiska för mätningarnas reproducerbarhet. För det första är det viktigt att se till att pärlan är ungefär i mitten av den genomskinliga spetsen medan den fästs på utskjutaren. Detta förhindrar eventuell mekanisk obalans under indragning. För det andra, under leverfixering med PFA, är det nödvändigt att strikt följa tidsgränserna för upptining och fixering. Att ändra tidpunkten för detta steg kan allvarligt påverka de mekaniska egenskaperna hos vävnadssektioner. För det tredje måste utskjutaren kalibreras upprepade gånger med kontinuerlig övervakning och inmatning av samtidiga temperaturvärden för att undvika att artefakter uppstår i styvhetsvärden på grund av temperaturfluktuationer. Slutligen bör en enda leversektion inte mätas längre än 3 timmar från beredningen, eftersom överlagrad PBS kan avdunsta under längre perioder. Läsare kan hänvisa till felsökningstabellen (tabell 3) för att lösa problem som uppstått under AFM-mätningen, som också diskuteras i längd i Norman et al.46.
Tabell 3: Felsökningsguide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%203v2.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>
Det presenterade protokollet möjliggör reproducerbar AFM-sondering av levervävnad. Det har potential att avslöja information om utveckling och eventuell regression av fibrotisk leversjukdom på mikroskopisk nivå och kan bidra till utvecklingen av terapier riktade mot fibrotiska ärrregioner som bildas under utvecklingen av kronisk leversjukdom.

Levern är ett viktigt organ för att upprätthålla homeostas i organismer 1,2. Kroniska leversjukdomar står för ~ 2 miljoner dödsfall världen över årligen3. De har oftast sitt ursprung som virusinfektioner, autoimmuna störningar, metaboliska syndrom eller alkoholmissbruksrelaterade sjukdomar och åtföljs av progressiv leverfibros. Leverskada framkallar ett inflammatoriskt svar, vilket leder till aktivering av celler som deponerar extracellulär matris (ECM) i ett sårläkningssvar. Men i närvaro av en kronisk förolämpning bildar överskott av ECM olöst ärrvävnad i levern, vilket leder till utveckling av leverfibros, cirros, leverkarcinom och i slutändan till leversvikt4.
Hepatocytskada resulterar omedelbart i ökad leverstyvhet 5,6. Detta påverkar direkt hepatocytfunktionen, aktiverar leverstellatceller (HSC) och portalfibroblaster och resulterar i deras transdifferentiering till kollagendeponerande myofibroblaster 7,8. Avsättningen av fibrös ECM ökar ytterligare leverstyvheten, vilket skapar en självförstärkande återkopplingsslinga av leverförstyvning och matrisproducerande cellaktivering.
Leverstelhet har därmed blivit en viktig parameter i leversjukdomsprognosen. Förändringen i biomekaniska vävnadsegenskaper kan detekteras tidigare än fibros kan diagnostiseras genom histologisk analys. Därför har olika tekniker för mätning av leverstelhet utvecklats inom både forskning och kliniska tillämpningar. I kliniska miljöer har övergående elastografi (TE)9,10,11,12,13 och magnetisk resonanselastografi (MRE)14,15,16,17,18 använts för att icke-invasivt diagnostisera tidiga stadier av leverskador genom att undersöka grov leverstelhet 19.
I TE sprids ultraljudsvågor med mild amplitud och låg frekvens (50 Hz) genom levern och deras hastighet mäts, som sedan används för att beräkna vävnadselasticmodul13. Denna teknik är emellertid inte användbar för patienter med ascites, fetma eller lägre interkostala utrymmen på grund av felaktig överföring av ultraljudsvågorna genom vävnaderna som omger levern9.
MRE är baserad på magnetisk resonansavbildningsmodalitet och använder 20-200 Hz mekaniska skjuvvågor för att rikta in sig på levern. En specifik magnetisk resonansavbildningssekvens används sedan för att spåra vågorna inuti vävnaden och för att beräkna vävnadsstyvheten16. Styvhetsvärden som rapporterats med både TE- och MRE-tekniker korrelerar väl med graden av leverfibros erhållen från biopsier av humana leverprover rankade med hjälp av histologiska METAVIR-poäng20 (tabell 1). TE och MRE har också anpassats för mätning av leverstelhet i gnagarmodeller för forskningsändamål21,22,23. Men eftersom båda metoderna härleder styvhetsvärdena från vävnadens svar på de förökande skjuvvågorna, kanske de erhållna värdena inte återspeglar vävnadens absoluta mekaniska styvhet.
utvecklade en modell-gel-vävnadsanalys (MGT-analys) som involverade inbäddning av levervävnad i levervävnad i polyakrylamidgel24. Denna gel komprimeras av en pulserad likformig kraft från vilken Youngs modul kan beräknas. MGT-analysen visar en god korrelation med en indragningsanalys anpassad för både normala och fibrotiska lever24 (tabell 1).
Tabell 1: Leverstyvhetsvärden på bulknivå. TE och MRE jämfört med direkta ex vivo mekaniska mätningar av leverelastic moduli med hjälp av indragning och MGT-analyser för lever från olika källor. Förhållandet mellan E och G ges av E = 2G (1 + v), där v är Poissons förhållande mellan provet; F0 till F4 representerar fibrospoängen i METAVIR-poängsystemet, med F0 som betecknar låg eller ingen fibros och F4-cirrotiska lever. Förkortningar: TE = övergående elastografi; MRE = magnetisk resonans elastografi; MGT = modell-gel-vävnad; E = elastisk (Youngs) modul; G = skjuvmodul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%201v2.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>
En av de största nackdelarna med generiska leverstyvhetsmätningar är att de inte ger cellulär upplösning av styvhet heterogenitet i levern. Under utvecklingen av fibros visar kollagenrika områden högre styvhet jämfört med det omgivande parenkymet25,26. Denna styvhetsgradient påverkar lokalt de bosatta cellerna och spelar en viktig roll för att driva HSC-heterogenitet27. Således måste förändringar i lokala mekaniska egenskaper under leversjukdomsutveckling karakteriseras på mikroskopisk nivå för att bättre förstå fibrosprogression.
AFM gör att vävnadens mekaniska egenskaper kan mätas med hög upplösning och hög kraftkänslighet. AFM använder spetsen på en cantilever för att dra in ytan på ett prov med krafter så låga som flera piconewtons, vilket inducerar en deformation på mikroskopisk eller nanoskopisk nivå baserat på geometrin och storleken på den använda spetsen. Provets kraftrespons på den applicerade töjningen mäts sedan som avböjningen i utskjutande28. Kraftförskjutningskurvor samlas in från inflygningen och indragningen av cantileveren, som kan utrustas med lämpliga kontaktmekanikmodeller för att utvärdera provets lokala styvhet29.
Förutom att mäta styvheten i ett visst område kan AFM också ge topografisk information om specifika egenskaper i provet, såsom strukturen hos kollagenfibrer30,31,32. Flera studier har beskrivit tillämpningen av AFM för att mäta styvheten hos olika friska och sjuka vävnader, såsom hud 32,33, lunga 34,35, hjärna36, bröst37,38,39, brosk 40 eller hjärta41,42,43,44 från både patient- och musmodellprover. Dessutom har AFM också använts in vitro för att bestämma styvheten hos celler och extracellulära proteinställningar45,46,47.
Mätningen av de mekaniska egenskaperna hos biologiska prover med AFM är nontrivial på grund av deras mjukhet och bräcklighet. Således har olika studier standardiserat olika förhållanden och inställningar, vilket ger mycket fluktuerande värden på Youngs moduli (granskad av Mckee et al.48). I likhet med andra mjuka vävnader visar lever Youngs modulvärden vid olika grader av leverfibros också omfattande variation (tabell 2). Skillnaderna i Youngs modulvärden härrör från skillnader i läget för AFM-drift, utskjutande spets, provberedningsmetod, provtjocklek, indragningsdjup och krafter, levervävnadsmiljö under mätning och analysmetod (tabell 2).
Tabell 2: Leverstyvhetsvärden på cellnivå. Leverstyvhetsvärden erhållna med AFM beskriver leverns mekaniska egenskaper på cellnivå. Förkortningar: AFM = atomkraftsmikroskopi; E = elastisk (Youngs) modul; PFA = paraformaldehyd; PBS = fosfatbuffrad saltlösning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%202v2.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>
Detta dokument beskriver ett protokoll för reproducerbar mätning av Youngs moduli av kollagenrika fibrotiska områden i levervävnad av AFM med en exakt lokalisering som tillhandahålls genom användning av polarisationsmikroskopi. Vi administrerade koltetraklorid (CCl4) för att inducera kollagenavsättning på ett centrilobulärt sätt49 i en musmodell, vilket på ett tillförlitligt sätt efterliknade viktiga aspekter av mänsklig leverfibros50. Polariserade mikroskopiska bilder möjliggör visualisering av kollagen i levern på grund av birefringens av kollagenfibrer51, vilket möjliggör exakt positionering av cantileverspetsen över det önskade intresseområdet inom leverlobule52.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >AFM head</td>
			<td >Bruker</td>
			<td >JPK nanowizard 3</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cameras</td>
			<td >Andor</td>
			<td >Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >The Imagingsource&#160;</td>
			<td >S/N:12310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cantilever</td>
			<td >SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors</td>
			<td>S/N:73750F05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryotome</td>
			<td >Leica&#160;</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epoxy resin glue (Long working time )</td>
			<td >Bison epoxy universal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Melamine beads; diameter, 5.7 um</td>
			<td >Microparticles, GmbH</td>
			<td>MF-R-5.7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td>&#160;IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrophobic&#160; slide marker</td>
			<td >SuperHT</td>
			<td>PAP PEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td >JPK nanowizard&#160; v6.1.151</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >AtomicJ v2.3.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost slides</td>
			<td >Thermoscientific</td>
			<td>ref no. J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >System</td>
			<td >Ubuntu 14.04.5 LTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibration isolation control unit</td>
			<td >Tablestable</td>
			<td>AVI-200-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of liver stiffness using atomic force microscopy coupled with polarization microscopy

Matrisförstyvning har erkänts som en av de viktigaste drivkrafterna för utvecklingen av leverfibros. Det har djupgående effekter på olika aspekter av cellbeteende såsom cellfunktion, differentiering och rörlighet. Men eftersom dessa processer inte är homogena i hela organet har det blivit allt viktigare att förstå förändringar i vävnadernas mekaniska egenskaper på cellulär nivå.
För att kunna övervaka förstyvningen av kollagenrika områden i leverloberna presenterar detta papper ett protokoll för mätning av levervävnadselastiska moduler med hög rumslig precision med atomkraftsmikroskopi (AFM). AFM är en känslig metod med potential att karakterisera lokala mekaniska egenskaper, beräknad som Youngs (även kallad elastisk) modul. AFM i kombination med polarisationsmikroskopi kan användas för att specifikt lokalisera områdena för fibrosutveckling baserat på birefringens av kollagenfibrer i vävnader. Med hjälp av det presenterade protokollet karakteriserade vi styvheten hos kollagenrika områden från fibrotiska muslever och motsvarande områden i levern hos kontrollmöss.
En framträdande ökning av styvheten hos kollagenpositiva områden observerades med fibrosutveckling. Det presenterade protokollet möjliggör en mycket reproducerbar metod för AFM-mätning, på grund av användningen av milt fixerad levervävnad, som kan användas för att främja förståelsen av sjukdomsinitierade förändringar i lokala vävnadsmekaniska egenskaper och deras effekt på ödet för angränsande celler.

Milt fixerade, 30 μm tjocka leversektioner erhållna från kontrollmöss och från möss med mild eller avancerad fibros (inducerad genom injektion av CCl4 i 3 veckor respektive 6 veckor,respektive 49) undersöktes med AFM enligt beskrivningen i detta protokoll. Kollagenfibrer nära centrala vener valdes för mätning av styvhetskartor. Områden nära de centrala venerna, som motsvarar de områden där kollagenfibrer i CCl4-behandlade djur vanligtvis bildas, analyserades i kontrolllever (figur 4A). Fördelningen av Youngs moduli var reproducerbar över olika kontrolllever och kollagenrika områden inom en enda leversektion (figur 4B: vänster fiolplott).
I CCl 4-behandlade djur visade styvhetskartor som motsvarade pericentralområdena i kollagenavlagringar signifikant högre värden för Youngs moduli jämfört med motsvarande områden hos kontrollmöss (figur 4B: 1,9 kPa jämfört med 2,6 kPa median Youngs modulvärden för kontroll jämfört med 3 veckors CCl 4-behandlad mus; p = 0,07; 1,9 kPa jämfört med 5,1 kPa median Youngs modulvärden för kontroll jämfört med 6 veckor CCl4 -behandlad mus; p = 0,02). Dessutom skedde en signifikant ökning av värdena för Youngs moduli med längre CCl 4-behandling (figur 4B; 2,6 kPa jämfört med 5,1 kPa median Youngs modulvärden för 3 veckor jämfört med 6 veckors CCl4-behandlad mus; p = 0,04). Detta visar en gradvis förstyvning av kollagenavlagringar med fibrosprogression och att AFM-mätningar återspeglar fibrogenesen.
För att utvärdera effekten av långvarig lagring av OCT-inbäddade leversektioner på de mekaniska egenskaperna hos kollagenfibrer mätte vi styvheten hos kollagenfibrer i sektioner av CCl4-behandlade möss, som lagrades vid −80 ° C i 2 veckor eller 3 månader på bilden efter skärning (Figur 5). AFM-mätningar visade signifikant lägre värden på Youngs moduli i kollagenrika områden för sektioner lagrade i 3 månader jämfört med de som erhållits från sektioner uppmätta inom 2 veckor efter provsnittning (figur 5; 4,7 kPa jämfört med 3,6 kPa median Youngs modulvärden i 2 veckor jämfört med 3 månaders lagring; p < 0,001). Således är det viktigt att mäta de mekaniska egenskaperna hos levervävnaden strax efter att sektionerna har framställts från de OCT-inbäddade leverloberna.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig04.jpg"> Figur 4: AFM-mätningar visar progressiv förstyvning av kollagenrika områden som korrelerar med långvarig CCl4-behandling. (A) Leversektioner från kontrollmöss och möss som behandlats med CCl4 i 3 veckor eller 6 veckor användes för att mäta de mekaniska egenskaperna hos kollagenrika områden. De boxade områdena av leversektioner som visas i de polariserade mikroskopibilderna (vänster) är kollagenrika skanningsområden (eller motsvarande regioner i kontrollleveren) valda för AFM-mätningar (30 μm x 100 μm, 10 pixlar x 36 pixlar). Youngs modulkartor med färgskalor som motsvarar dessa boxade områden visas till höger, inklusive histogram av Youngs modulvärden från dessa kartor; infällda punktdiagram visar värden >10 kPa för varje villkor. Förstyvningen av levern visualiseras som en gradvis högerförskjutning i histogramfördelningen och en högre frekvens av punkter i det infällda spridningsdiagrammet. Skalstreck = 20 μm. (B) Fioldiagram visar fördelningen av elastisk moduli från tre områden uppmätta för varje tillstånd (vänster) och sammanfattade elastiska modulivärden från alla tre kartorna (höger). Fioldiagram visar median (röd linje), 25: e percentilen och 75:e percentilen (svarta linjer); Prickar representerar medelvärdena för enskilda kartor från områdena 1-3. De presenterade p-värdena beräknades med hjälp av en Students t-test utfört på medel. Förkortningar: AFM = atomkraftsmikroskopi; CCl4 = koltetraklorid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig05.jpg"> Figur 5: Utökad lagring av leversektioner leder till en minskning av styvheten i kollagenrika områden. Leversektioner (framställda från möss behandlade med CCl4 i 2 veckor) lagrade vid −80 °C i 2 veckor eller 3 månader användes för att mäta Youngs modul. Polariserade mikroskopibilder (vänster) med rutor som anger de kollagenrika områden som används för AFM-mätning (30 μm x 100 μm, 10 pixlar x 36 pixlar). Motsvarande Youngs modulkartor med färgskalor (höger). Histogram visar Youngs modulvärden som samlats in från 4-6 områden i varje prov; infällda punktdiagram visar värden >10 kPa för varje villkor. Skalstreck = 20 μm. Förkortningar: AFM = atomkraftsmikroskopi; CCl4 = koltetraklorid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Kompletterande figur S1: Metod för att modifiera fribärande medel med en mikropärla av melaminharts. (A) Ritad schematisk illustrerar fästningen av en sfärisk pärla på spetsen av cantilever. För en stegvis beskrivning, se avsnitt 2, del 1, Fastsättning av en 5,7 μm pärla på AFM cantilever spets. (B) Mikroskopibild av en sfärisk 5,7 μm pärla fäst vid utskjutande spets som visas uppifrån (vänster) och sidovy (höger). Skalstänger = 20 μm. Förkortningar: AFM = atomkraftsmikroskopi; RT = rumstemperatur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%201.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande figur S2: Dataanalys i AtomicJ. (A) Den sekvens av steg som ska följas för att öppna styvhetskartor i AtomicJ. Ett enda vänsterklick på processkraftskurvorna och kartorna (x) öppnar bearbetningsassistenten. Filer kan laddas till bearbetningsassistenten genom att klicka på lägg till (y) och välja önskade filer. Klicka på nästa (z) för att gå vidare till nästa steg. (B) Parametrar för kurvmontering, lämplig kontaktmekanikmodell och AFM-inställningar som används under mätningen. Steg 1-11 hänvisar till motsvarande underpunkter som beskrivs i protokollsteg 3, avsnitt 5, Dataanalys. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary_fig_2.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande figur S3: Översikt över analyserade data i AtomicJ. Förhandsgranskningen av analyserade data visar styvhetskartor (övre vänstra fönstret), kraftkurvor (övre högra fönstret) och rådata (nedre fönstret). Förkortning: AFM = atomkraftsmikroskopi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%203.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy at JoVE.com

Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

Vi presenterar ett protokoll för att mäta den elastiska modulen i kollagenrika områden i normal och sjuk lever med hjälp av atomkraftsmikroskopi. Samtidig användning av polarisationsmikroskopi ger hög rumslig precision för lokalisering av kollagenrika områden i leversektionerna.

Mätning av leverstyvhet med hjälp av atomkraftsmikroskopi i kombination med polarisationsmikroskopi

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

Vårt protokoll ger en skillnad mellan kollagenrika och kollagen som saknar områden i leversektionerna. Det kan således användas för att studera processerna för fibrogenes i de större detaljerna. Den största fördelen med tekniken ligger i användningen av polariserande mikroskopi för att lokalisera kollagenrika områden i leversektionerna.Våra protokoll kan ge stor insikt i utvecklingen av leverfibros, och det kan också antas för andra mjuka vävnader som lungor efter vissa optimeringar. För att börja, ta bort de frysta leversektionerna från minus 80 grader Celsius och tina dem vid rumstemperatur i två minuter. Fixa sektionerna med iskall 4% paraformaldehyd i PBS i 10 minuter vid fyra grader Celsius, följt av tvätt fem gånger med PBS.Efter den sista tvätten, torka av överskottet av PBS runt leversektionen med vävnad och markera en gräns på cirka två gånger fyra centimeter runt leversektionen med en hydrofob markörpenna. Täck provet med PBS, ladda sedan provet på AFM-steget och täck det med AFM-huvudet. I atomkraftmikroskopin eller AFM-programvaran, gå till installationsfliken och markera ett fält på autosave för att automatiskt spara alla filer.Ange sedan filnamnet och katalogen för att spara mätfilerna genom att gå till installationsfliken och klicka på spara inställningar. Närma dig vävnadsytan med AFM-utskjutaren genom att slå på lasern och klicka på inflygningsknappen. När tillvägagångssättet är klart, dra tillbaka cantilever-spetsen genom att klicka på retraktionsknappen en gång, vilket drar tillbaka cantilever till den övre änden av piezoområdet.Om det behövs, justera detektorn med hjälp av vred på AFM-huvudet. Stäng av lasern. Tipset är nu i fokus för målet.Lägg sedan över mikroskopets optiska fält med AFM-mätkartor genom att klicka på tillbehörsfliken och välja optisk kalibrering med direkt överlägg. I det efterföljande fönstret klickar du på nästa för att ta en serie bilder av cantilever som skannar ett specifikt område. Klicka på nästa igen för att gå till nästa fönster.I den första bilden klickar du på mitten av spetsen på cantilever manuellt för att visa spetspositionen i programvaran. Cirkeln som visar spetspositionen kan manipuleras i storlek genom att ange dess radie för att öka noggrannheten. Klicka på kalibrera för att automatiskt upptäcka den utskjutande spetspositionen i alla bilder.Bekräfta noggrannheten i tipsdetekteringen genom att gå igenom bilderna. Klicka på Nästa och slutför sedan för att avsluta det optiska överlägget. Flytta sedan scenen för att placera ett kollagenrikt område inuti den gröna rutan, synlig på datavisarfliken, med hjälp av den polariserade bilden.Välj det kollagenrika området genom att definiera området under rutnätsfliken och sedan skapa en rektangel på datavisarfliken med ett långt tryck på vänster musknapp inuti den angivna gröna rutan. Klicka på bekräfta ny skanningsregion för att ställa in det valda området som ett mätområde. Ställ in parametrarna för återkopplingsslingan.Set I gain på 50 hertz och P gain på 0,001. Ställ sedan in börvärdet på en nano Newton. Välj det relativa börvärdesvärdet enligt de studerade materialens mekaniska egenskaper och utskjutande styvhet.Ange en rättvis baslinje för att passa kraftkurvorna korrekt. Välj sedan längden på cantilever-rörelsen i Z-axeln enligt provets yttopografi. Ställ in Z-rörelsen på konstant varaktighet.Ställ in förlängningstiden till en sekund med förlängnings- och indragningsfördröjningar som noll. Ställ in samplingsfrekvensen på 5 000 hertz. Markera ett fält framför Z closed loop för att automatiskt justera avståndet mellan provet och cantileverspetsen under mätningarna.Koppla sedan bort den motoriserade stegkontrollen genom att avmarkera inkopplingsknappen. Slå på lasern och närma dig provet med cantilever. Klicka på startskanning för att samla kraftavståndskurvor.Analysera förvärvade data med hjälp av programvaran AtomicJ med öppen källkod. Ladda kraftkurvorna i programmet genom att klicka på processkraftskurvorna och kartikonen. Lägg sedan till kartorna som ska analyseras i bearbetningsassistenten genom att klicka på knappen Lägg till.När kartorna har laddats klickar du på nästa. Ange bearbetningsinställningarna i nästa fönster. För att uppskatta kontaktpunkten mellan provet och utskjutaren automatiskt med hjälp av en uppsättning anpassningskurvparametrar, använd den automatiska uppskattningen av kontaktpunkten.Bestäm kontaktpunkten mellan cantilever och provet med den klassiska fokuserade rutnätmetoden. Välj uppskattningsmetoden som modelloberoende metod för att ge den bästa bestämningen av kontaktpunkten baserat på kvaliteten på de uppmätta kraftkurvorna, som måste bestämmas empiriskt under optimeringen av dataanalys. Anpassa kraftindragningskurvan med en klassisk modell som klassisk L två för modellpassning.Ställ in modellens passform på uttagskurvan. Ställ in Poissons förhållande som 0.45 som rekommenderas för mjuka vävnader som levern. Ställ in kurvans passform med en baslinjegrad på tre och en kontaktgrad på en.Ändra graden av polynompassning baserat på skalan av avvikelser från kurvorna från modellen. Välj den modell som används för att passa uttagskurvorna som Sneddon-modellen. Fyll i sfärisk spetss radie till 2,9 mikrometer.Ladda fjäderkonstanten och invOLS från datafilerna genom att aktivera inläsning och klicka sedan på slutför. Efter dataanalys, gå igenom kraftkurvorna. Uteslut kraftkurvorna där utskjutande närmar sig ytan av leversektionen felaktigt.Dessa kurvor har högt brus och avvikande former. Därefter kan data kopieras eller exporteras. I denna studie undersöktes milt fixerade leversektioner erhållna från kontrollmössen och möss med mild och avancerad fibros inducerad genom injektion av koltetraklorid med AFM.Områden nära de centrala venerna som motsvarar de områden där kollagenfibrer i koltetrakloridmöss vanligtvis bildas analyserades i kontrolllever. Fördelningen av Youngs moduli var reproducerbar över olika regioner i kontrolllever och kollagenrika områden inom en enda leversektion. Hos koltetrakloridbehandlade möss visade styvhetskartor motsvarande de pericentrala områdena i kollagenavlagringar signifikant högre värden av Youngs moduli jämfört med motsvarande områden hos kontrollmöss.Dessutom var det en signifikant ökning av värdena för Youngs moduli med längre behandling. Effekten av långvarig lagring av leversektioner på de mekaniska egenskaperna hos kollagenfibrer bedömdes också. AFM-mätningar visade signifikant lägre värden på Youngs moduli i kollagenrika områden för sektioner lagrade i tre månader, jämfört med de som erhållits inom två veckor.Tiden för fixering av leversektionen bestämmer i hög grad de mekaniska egenskaperna hos leversektionen. Vi rekommenderar att tidsbestämda intervall som anges i protokollet måste följas strikt. Efter vissa optimeringar i protokollet kan den givna metoden användas för alla mjuka vävnader som visar signifikant kollagenavsättning, vilket kan detekteras genom polariserande mikroskopi.Den givna tekniken ger forskarna ett enhetligt och bekvämt protokoll för att studera levermekanism över friska och sjukdomar.

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse avbildning av Mitos Efter siRNA Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell elektrosvetsade visualiseras med fluorescensmikroskopi

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

Levande cell Svar på mekanisk stimulering studerats av integrerad optisk och atomkraftsmikroskopi

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Kvantifiering av G Tillsammans Interaktioner protein receptor med spektralt korrigerats inom två-photon Mikroskopi

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Mikromekaniska Karakterisering av lungvävnad Använda atomkraftsmikroskopi

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

Identifiera mål om mänskliga mikroRNA med lightswitch luciferas analyssystem med 3&#39;UTR-reporter Konstruerar och ett mikroRNA Mimic i Vidhäftande Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Provberedning för single virion atomic force mikroskopi och superupplösning fluorescensavbildning

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klon Spårning av hematopoetiska stam och progenitorceller märkta med fem fluorescerande proteiner med hjälp Konfokal och multifoton mikroskopi

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Mätning av styvheten hos<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mus Aorta Använda atomkraftsmikroskopi

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Detektering av ligand-aktiverade G-proteinkopplade receptorer Interna genom konfokalmikroskopi

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...