Name: facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-06-08T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

نود أن نشكر توم تشيونغ (جامعة هونغ كونغ للعلوم والتكنولوجيا) على المشورة بشأن عزل MuSC. تم تمويل هذا العمل من قبل NIAMS-IRP من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة AR041126 و AR041164.

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات (ACUC) التابعة للمعهد الوطني لالتهاب المفاصل والعضلات والعظام والأمراض الجلدية (NIAMS). يجب على المحققين الذين يقومون بتنفيذ هذا البروتوكول الالتزام بالمبادئ التوجيهية المحلية لأ?...

<ol>
	<li>Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+as+a+&amp;#34;mediator&amp;#34;+of+systemic+metabolism.">Muscle as a &amp;#34;mediator&amp;#34; of systemic metabolism.</a> Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).</li><li>Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+and+skeletal+muscle+regeneration.">Satellite cells and skeletal muscle regeneration.</a> Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).</li><li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells.">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).</li><li>Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+satellite+cell+contribution+to+uninjured+adult+muscle+fibers.">Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers.</a> Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).</li><li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+injury+activates+resident+fibro/adipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis.">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle.">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li><li>Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+roles+of+muscle-resident+fibro-adipogenic+progenitors+in+health,+regeneration,+neuromuscular+disorders,+and+aging.">Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging.</a> Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).</li><li>Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle.">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+progenitors+resident+in+the+skeletal+muscle+interstitium+exhibit+robust+BMP-dependent+osteogenic+activity+and+mediate+heterotopic+ossification.">Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).</li><li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+tissue-resident+PDGFR&#945;++fibro-adipogenic+progenitors+spontaneously+acquire+osteogenic+phenotype+in+an+altered+inflammatory+environment.">Murine tissue-resident PDGFR&#945;+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).</li><li>Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-adipogenic+progenitors+cross-talk+in+skeletal+muscle:+The+social+network.">Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).</li><li>Lemos, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nilotinib+reduces+muscle+fibrosis+in+chronic+muscle+injury+by+promoting+TNF-mediated+apoptosis+of+fibro/adipogenic+progenitors.">Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors.</a> Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).</li><li>Malecova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cellular+states+of+fibro-adipogenic+progenitors+during+myogenesis+and+muscular+dystrophy.">Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 9, 3670 (2018).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).</li><li>Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs):+Isolation+by+FACS+and+culture.">Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture.</a> Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).</li><li>Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+differentiation+of+fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs)+from+skeletal+muscle.">Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).</li><li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms.">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li><li>Contreras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+TGF-&#946;+and+PDGFR&#945;+signaling+pathways+regulates+the+fate+of+stromal+fibro-adipogenic+progenitors.">Cross-talk between TGF-&#946; and PDGFR&#945; signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors.</a> Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).</li><li>Holmes, C., Stanford, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Stem+cell+antigen-1:+Expression,+function,+and+enigma.">Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma.</a> Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).</li><li>Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HGFA+Is+an+injury-regulated+systemic+factor+that+induces+the+transition+of+stem+cells+into+GAlert.">HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert.</a> Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).</li><li>Garc&#237;a-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+maintains+a+genuine+muscle+stem-cell+quiescent+state+until+geriatric+age.">FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).</li><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterioration+and+variability+of+highly+purified+collagenase+blends+used+in+clinical+islet+isolation.">Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation.</a> Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).</li><li>Walls, P. L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+potential+for+bursting+bubbles+to+damage+suspended+cells.">Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li><li>Kafadar, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sca-1+expression+is+required+for+efficient+remodeling+of+the+extracellular+matrix+during+skeletal+muscle+regeneration.">Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration.</a> Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).</li></ol>

إن إنشاء بروتوكولات فعالة وقابلة للتكرار لتحديد وعزل مجموعات الخلايا الجذعية البالغة النقية هو الخطوة الأولى والأكثر أهمية نحو فهم وظيفتها. يمكن استخدام FAPs المعزولة و MuSCs لإجراء تحليل متعدد الخلايا في تجارب الزرع كعلاج محتمل للأمراض العضلية أو يمكن تعديلها وراثيا لنمذجة المرض في العلاج ...

العضلات الهيكلية هي أكبر نسيج في الجسم ، وهو ما يمثل ~ 40 ٪ من وزن الإنسان البالغ ، وهي مسؤولة عن الحفاظ على الموقف ، وتوليد الحركة ، وتنظيم استقلاب الطاقة الأساسية ، ودرجة حرارة الجسم1. العضلات الهيكلية هي نسيج ديناميكي للغاية وتمتلك قدرة ملحوظة على التكيف مع مجموعة متنوعة من المحفزات ، مثل الإجهاد الميكانيكي ، والتغيرات الأيضية ، والعوامل البيئية اليومية. بالإضافة إلى ذلك ، تتجدد العضلات الهيكلية استجابة للإصابة الحادة ، مما يؤدي إلى استعادة كاملة لمورفولوجيتها ووظائفها2. تعتمد لدونة العضلات الهيكلية بشكل أساسي على مجموعة من الخلايا الجذعية العضلية المقيمة (MuSCs) ، والتي تسمى أيضا الخلايا الساتلية ، والتي تقع بين غشاء البلازما من الألياف العضلية والصفيحة القاعدية 2,3. في ظل الظروف العادية ، توجد MuSCs في مكان العضلات في حالة هادئة ، مع عدد قليل من الانقسامات للتعويض عن دوران الخلايا وتجديد مجموعة الخلايا الجذعية4. استجابة للإصابة ، تدخل MuSCs دورة الخلية ، وتتكاثر ، وتساهم إما في تكوين ألياف عضلية جديدة أو تعود إلى مكانتها في عملية تجديد ذاتي 2,3. بالإضافة إلى MuSCs ، تعتمد الصيانة الاستتبابية وتجديد العضلات الهيكلية على دعم مجموعة من الخلايا المقيمة في العضلات تسمى السلف الليفي الشحمي (FAPs) 5،6،7. FAPs هي خلايا لحمية وسيطة مدمجة في النسيج الضام العضلي وقادرة على التمييز على طول السلالة الليفية أو الشحمية أو العظمية أو الغضروفية5،8،9،10. توفر FAPs الدعم الهيكلي ل MuSCs لأنها مصدر لبروتينات المصفوفة خارج الخلية في مجال الخلايا الجذعية العضلية. كما تعزز FAPs الصيانة طويلة الأجل للعضلات الهيكلية عن طريق إفراز السيتوكينات وعوامل النمو التي توفر الدعم الغذائي لتكوين العضلات ونمو العضلات 6,11. عند الإصابة العضلية الحادة ، تتكاثر FAPs بسرعة لإنتاج مكانة عابرة تدعم السلامة الهيكلية للعضلات المجددة وتوفر بيئة مواتية للحفاظ على انتشار MuSCs والتمايز بطريقة باراكرين5. مع استمرار التجديد ، يتم مسح FAPs من العضلات التجديدية عن طريق موت الخلايا المبرمج ، وتعود أعدادها تدريجيا إلى المستوى القاعدي12. ومع ذلك ، في الظروف التي تفضل إصابة العضلات المزمنة ، تتجاوز FAPs الإشارات المؤيدة للاستماتة وتتراكم في مكانة العضلات ، حيث تتمايز إلى الخلايا الليفية المنتجة للكولاجين والخلايا الدهنية ، مما يؤدي إلى تسلل الدهون خارج الرحم وتشكيل ندبة ليفية12,13.
نظرا لتعدد قدراتها وقدراتها التجديدية ، تم تحديد FAPs و MuSCs كأهداف محتملة في الطب التجديدي لعلاج اضطرابات العضلات الهيكلية. لذلك ، للتحقيق في وظيفتها وإمكاناتها العلاجية ، من المهم إنشاء بروتوكولات فعالة وقابلة للتكرار لعزل وثقافة FAPs و MuSCs.
يمكن لفرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) تحديد مجموعات الخلايا المختلفة بناء على الخصائص المورفولوجية مثل الحجم والدقة ، ويسمح بالعزل الخاص بالخلية بناء على استخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد علامات سطح الخلية. في الفئران البالغة ، تعبر MuSCs عن جزيء التصاق الخلايا الوعائية 1 (VCAM-1 ، المعروف أيضا باسم CD106) 14,15 و α7-Integrin15 ، بينما تعبر FAPs عن مستقبلات عامل النمو المشتقة من الصفائح الدموية α (PDGFRα) ومستضد الخلايا الجذعية 1 (Sca1 أو Ly6A / E) 5,6,9,12,16,17 . في البروتوكول الموصوف هنا ، تم تحديد MuSCs على أنها CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ ، في حين تم تحديد FAPs على أنها CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. بدلا من ذلك ، تم استخدام الفئران PDGFRαEGFP لعزل FAPs مثل CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- الأحداث18,19. علاوة على ذلك ، قارنا التداخل بين إشارة الفلورسنت لخلايا PDGFRα-GFP + بالخلايا التي حددتها علامة السطح Sca1. أظهر تحليلنا أن جميع الخلايا المعبرة عن GFP كانت إيجابية أيضا ل Sca1 ، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام أي من النهجين لتحديد وعزل FAPs. وأخيرا ، أكد التلطيخ بأجسام مضادة محددة العلامة نقاء كل مجموعة خلايا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G BD Needle 1 in. single use, sterile</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b)</td>
			<td>The University of British Columbia</td>
			<td>53-0010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD31 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSMelody Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD106 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J&#160; mouse (Female and Male)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>007669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution (1 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 40 &#181;m Cell Strainer, Blue, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Collagenase, Type II, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Dispase, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DMEM, high glucose, HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12430054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Horse Serum, New Zealand origin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse PDGF&#160;R alpha Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9624464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NCC0528893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)</td>
			<td>Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 Streptavidin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle

الخلايا السلفية الليفية الشحمية (FAPs) هي مجموعة من الخلايا اللحمية الوسيطة المقيمة في العضلات الهيكلية (MSCs) القادرة على التمييز على طول السلالة الليفية أو الشحمية أو العظمية أو الغضرونية. جنبا إلى جنب مع الخلايا الجذعية العضلية (MuSCs) ، تلعب FAPs دورا حاسما في توازن العضلات وإصلاحها وتجديدها ، مع الحفاظ بنشاط على المصفوفة خارج الخلية (ECM) وإعادة تشكيلها. في الحالات المرضية ، مثل التلف المزمن والحثل العضلي ، تخضع FAPs لتنشيط شاذ وتتمايز إلى خلايا ليفية منتجة للكولاجين والخلايا الشحمية ، مما يؤدي إلى التليف وتسلل الدهون العضلية. وبالتالي ، تلعب FAPs دورا مزدوجا في تجديد العضلات ، إما عن طريق الحفاظ على دوران MuSC وتعزيز إصلاح الأنسجة أو المساهمة في تكوين ندبة ليفية وتسلل الدهون خارج الرحم ، مما يعرض سلامة ووظيفة الأنسجة العضلية الهيكلية للخطر. يعد التنقية المناسبة ل FAPs و MuSCs شرطا أساسيا لفهم الدور البيولوجي لهذه الخلايا في الظروف الفسيولوجية وكذلك في الحالات المرضية. هنا ، نصف طريقة موحدة للعزل المتزامن ل FAPs و MuSCs من عضلات الأطراف للفئران البالغة باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS). يصف البروتوكول بالتفصيل التفكك الميكانيكي والإنزيمي للخلايا أحادية النواة من عضلات الأطراف بأكملها وعضلات الظنبوب الأمامية (TA) المصابة. يتم عزل FAPs و MuSCs لاحقا باستخدام فارز خلايا شبه آلي للحصول على مجموعات خلايا نقية. بالإضافة إلى ذلك ، نصف طريقة محسنة لزراعة FAPs و MuSCs الهادئة والمنشطة ، إما بمفردها أو في ظروف الزراعة المشتركة.

يسمح هذا البروتوكول بعزل ما يقرب من مليون FAPs وما يصل إلى 350,000 MuSCs من الأطراف الخلفية غير المصابة للفئران البالغة من النوع البري (3-6 أشهر) ، أي ما يعادل عائدا قدره 8٪ ل FAPs و 3٪ ل MuSCs من إجمالي الأحداث. عند فرز الخلايا من TA التالفة بعد 7 أيام من الإصابة ، يتم تجميع اثنين إلى ثلاثة عضلات TA للحصول على ?...

Watch this Scientific Journal Video about FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle

يعد التحديد الدقيق للخلايا السلفية الليفية الدهنية المنشأ (FAPs) والخلايا الجذعية العضلية (MuSCs) أمرا بالغ الأهمية لدراسة وظيفتها البيولوجية في الحالات الفسيولوجية والمرضية. يوفر هذا البروتوكول إرشادات لعزل وتنقية وزراعة FAPs و MuSCs من عضلات الفئران البالغة.

FACS-عزل وثقافة السلف الليفي الأديبوجينيك والخلايا الجذعية العضلية من العضلات الهيكلية للفئران غير المضطربة والمصابة

Fibro-adipogenic progenitor cells (FAPs) are a population of skeletal muscle-resident mesenchymal stromal cells (MSCs) capable of differentiating along ...

يصف هذا البروتوكول طريقة للعزل المتزامن للخلايا الشحمية الليفية والأسلاف والخلايا الجذعية العضلية باستخدام منشطات التألق للفرز. السكان النقيون لهذه الخلايا هم شرط أساسي لفهم دورها البيولوجي في الظروف الفسيولوجية والمرضية. باستخدام هذه التقنية ، تم تحديد فوربس والخلايا الجذعية العضلية وعزلها إما عن الإبط أو العضلات المصابة.وقد سمح لنا الإفلات من العقاب المليء بفوربس والخلايا الجذعية العضلية باستخدام هذه الخلايا لتقنيات مختلفة في اتجاه مجرى النهر مثل زرع السكرين وتحليل المزيج الطيني. للبدء ، ضع الفأر المقتول على وسادة تشريح ورشها بالإيثانول بنسبة 70٪ لتجنب التلوث ، استخدم الملقط لقرص مركز جلد بطن الفأر وقطع فتحة سنتيمتر واحد تقريبا أفقيا. أمسك حواف الجرح والقرص في الماوس عن طريق سحب الفتحة في الاتجاهين المعاكسين للكشف عن العضلات الموجودة تحتها ، وكشف جانب واحد من الطرف الخلفي في ذلك الوقت.قبل جمع العضلات، قم بإزالة الدهون بين العضلات بين أوتار الركبة في الطرف القريب من العضلة رباعية الرؤوس لتحسين عزل الخلايا السلفية الليفية الشحمية المنشأ والخلايا الجذعية العضلية. بعد ذلك ، دون الإضرار بالأنسجة ، استخدم ملقطا حادا لكسر اللفافة وتقشيرها لفضح عضلات الظنبوب الأمامية أو TA والباسطة الرقمية الطويلة أو EDL. قم بتشغيل الطرف الحاد من الملقط أسفل عضلات TA EDL لفصل العضلات عن الساق.قم بقطع الأوتار ، وربط TA EDL بالكاحل وأثناء حمله بالملقط ، قم بقص العضلات بمقص على طول الخط الطولي ل TA EDL. قطع الأوتار حول الركبة لفصل عضلات TA EDL بأكملها. ضع العضلات في طبق طوله ستة سنتيمترات محفوظ على الجليد.لعزل عضلات المعدة قطع جميع الأوتار في الكاحل وفصل العضلات عن الساق والشظية. قطع حول الركبة ونقل العضلات إلى الطبق. قشر اللفافة حول العضلة رباعية الرؤوس وافصلها عن عظم الفخذ عن طريق تشغيل الطرف الحاد من الملقط بين العضلات والعظام.قطع الأوتار حول الركبة وتقليم بقية العضلات عن طريق قطع على طول عظم الفخذ مع عقد العضلة رباعية الرؤوس مع ملقط في الطرف البعيد. ضع العضلات في طبق الستة سنتيمترات. افصل أوتار الركبة والعضلات المتبقية حول عظم الفخذ وانقلها إلى الطبق.اجمع عضلات الأطراف الخلفية في طبق محفوظ على الجليد. اغسل الشفط وسط من الطبق وأضف واحدا إلى ملليلترين من عازل تفكك العضلات للحفاظ على رطوبة العضلات. بعد ذلك ، قم بتقطيع العضلات جيدا استخدم مشرطا لتمزيق العضلات وتقطيعها إلى شرائح ثم استخدم المقص للحفاظ على قطع العضلات إلى قطع صغيرة لمدة دقيقة إلى دقيقتين حتى الحصول على عجينة ملاط من الأنسجة المفرومة جيدا.ثم انقل العضلات المفرومة إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على عازل تفكك العضلات. أغلق الأنابيب بفيلم مختبري واحتضنها في حمام مائي 37 درجة مئوية مع إثارة لمدة ساعة واحدة. بعد ساعة واحدة ، قم بإزالة الأنبوب من الخلاط واملأه إلى 50 ملليلتر مع وسط الغسيل ، وعكس الأنبوب بلطف مرتين لضمان الخلط.الطرد المركزي للخلايا في دوار دلو متأرجح عند 250 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. انقل 42 ملليلتر من supernatant إلى أنبوبين جديدين واترك ثمانية ملليلترات في الأنبوب الأصلي. املأ الأنابيب الجديدة التي تحتوي على 21 ملليلتر من supernatant حتى 50 ملليلتر بوسط غسيل.ثم الطرد المركزي للخلايا في 350 مرة G لمدة ثماني دقائق عند أربع درجات مئوية. شفط supernatant والحفاظ على الكريات على الجليد. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من الكولاجيناز اثنين من الأسهم وملليلتر واحد من الأسهم القائمة على ديس في الأنبوب الأصلي الذي يحتوي على ثمانية ملليلتر من العازلة لتفكك العضلات.باستخدام ماصة مصلية سعة خمسة ملليلتر ، أعد تعليق الكريات 10 مرات دون انسداد. أخرج المحلول نحو جدار الأنبوب ، وتجنب فقاعات التكوين. أغلق الأنابيب بفيلم مختبري واحتضنها في حمام مائي 37 درجة مئوية مع الإثارة لمدة 30 دقيقة.بعد 30 دقيقة ، قم بإزالة الأنبوب من شفط الاهتزاز وإخراج تعليق العضلات 10 مرات من خلال حقنة 10 ملليلتر بإبرة قياس 20 ، واملأ كل أنبوب يصل إلى 50 ملليلتر بوسط غسيل وعكس الأنبوب. ثم جهاز طرد مركزي بسرعة 250 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ونقل السوبرناتانت إلى أنبوب جديد. ترك ثمانية ملليلتر في الأنبوب الأصلي.املأ الأنبوب الجديد حتى 50 ملليلتر بوسط غسيل ، وقم مرة أخرى بالطرد المركزي للخلايا بسرعة 350 مرة G لمدة ثماني دقائق عند أربع درجات مئوية. إزالة supernatant والحفاظ على بيليه على الجليد. ضع مصفاة خلايا نايلون 40 ميكرون في الأنبوب المخروطي الأصلي سعة 50 ملليلتر الذي يحتوي على ثمانية ملليلترات من وسط الغسيل وقم بترطيب المصفاة مسبقا بواحد إلى ملليلتر من وسط الغسيل.أثناء حمل المصفاة ، استخدم ماصة 10 ملليلتر لإعادة تعليق الكريات بلطف. قم بتصفية التعليق من خلال مصفاة الخلية مرة أخرى إلى نفس الأنبوب لتقليل فقدان الخلية. قم بتصفية كريات الأنبوب الأخرى مرة أخرى إلى الأنبوب الأصلي عن طريق إضافة أربعة إلى خمسة ملليلترات من وسط الغسيل إلى كل أنبوب لإعادة تعليق الكريات ونقل المحلول إلى المصفاة الذاتية الموضوعة في الأنبوب الأصلي.بعد جمع جميع الكريات في أنبوب 50 ملليلتر الأصلي شطف المصفاة الذاتية مع أربعة إلى خمسة ملليلترات أخرى من وسط الغسيل. استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لجمع كل السائل من الجانب السفلي من المصفاة الذاتية. املأ كل أنبوب بوسط غسيل يصل إلى 50 ملليلتر وعكس الأنبوب.جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 250 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة السوبرناتانت على الفور دون إزعاج الكريات وأعد تعليق الكريات في 600 ميكرولتر من وسط الغسيل. انقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة مليلترين.أضف الأجسام المضادة CD 31 APC CD 45 APC SCA واحد المحيط الهادئ الأزرق VCAM واحد البيوتين وألفا سبعة Integrin PE في أنبوب اثنين ملليمترات تحتوي على تعليق الخلية. اخلطي الخلايا بلطف واحتضنيها في شاكر دوار عند أربع درجات مئوية لمدة 45 دقيقة لحمايتها من الضوء. بعد الحضانة ، املأ جميع الأنابيب حتى ملليلترين بوسط الغسيل وأجهزة الطرد المركزي عند 250 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.قم بإزالة السوبرناتانت وأعد تعليق الكريات في 300 ميكرولتر من وسط الغسيل. بعد ذلك ، أضف الجسم المضاد للستربتافيدين إلى الأنابيب واحتضن الخلايا في شاكر دوار عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، املأ الأنابيب التي تحتوي على جسم مضاد للستربتافيدين إلى ملليلترين مع وسط الغسيل.ثم ، الطرد المركزي للأنابيب وشفط supernatant تماما. بعد الغسيل الثاني ، أعد تعليق الخلايا في الأنبوب التجريبي في 500 ميكرولتر من وسط الغسيل. قبل البلل غطاء مصفاة الخلية من أنبوب سفلي دائري من البوليسترين سعة خمسة ملليلتر مع 200 ميكرولتر من وسط الغسيل.انقل تعليق الخلية من الأنبوب التجريبي إلى الأنبوب السفلي المستدير من البوليسترين سعة خمسة ملليلتر واسمح له بالتصفية حسب الجاذبية. اطبع أنبوبي الملليلتر اللذين يحتويان على تعليق العينة التجريبي مع 300 ميكرولتر من وسط الغسيل ومرره عبر نفس غطاء المصفاة. استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر لجمع كل السائل من الجانب السفلي من مصفاة الخلية.ختم مع غطاء ، وترك أنابيب على الجليد وحمايتها من الضوء. تظهر هنا استراتيجية البوابة المعتمدة لعزل السلف الشحمي الليفي والخلايا الجذعية العضلية. يعبر PD GFR alpha E G F P في الفئران المراسلة عن جين الاندماج H two B E G F P من موضع PD G FFR ألفا الداخلي ، مما يسمح بوضع علامات فعالة ومحددة على سلالة PD G GFR ألفا.تم تأكيد نقاء مجموعات الخلايا المعزولة من خلال التلطيخ المناعي للسلف الليفي الدهني الإيجابي GFP والخلايا الجذعية العضلية مع الأجسام المضادة PAC-seven. لم يعبر السلف الليفي الدهني الإيجابي GFP عن علامة PAC-seven ، في حين تفاعلت الخلايا الجذعية العضلية مع هذا الجسم المضاد. كانت جميع الخلايا المعبرة عن GFP إيجابية ل SCA one وسلبية ل CD 31 و CD 45 VCAM one و alpha seven integrin.يتم عرض السلف الليفي الشحمي المنشأ والخلايا الجذعية العضلية المعزولة من الفئران المصابة بالحقن العضلي بدون سم بعد سبعة أيام من الإصابة. كما يتم تنشيط الخلايا الجذعية العضلات زيادة في حجم الخلايا. من المهم ضبط معلمات F SCA و SS CA وتوسيع البوابة لتشمل تلك الخلايا في المركز.يظهر هنا تحديد كمية السلف الليفي الشحمي المنشأ والخلايا الجذعية العضلية في عضلات TA غير المصابة وبعد سبعة أيام من الإصابة. وعلى الرغم من أن الذروة والانتشار لوحظا بين اليومين الثاني والثالث، إلا أن المعدل المنخفض للخلايا المتكاثرة لا يزال ملحوظا بعد سبعة أيام من الإصابة. يعد إجراء فرم العضلات المناسب أمرا بالغ الأهمية لإطلاق خلية واحدة.علاوة على ذلك ، يتم تحقيق عزل الخلايا أحادية النوكليوتيد عن طريق تشغيل التعليق إلى حقنة 10 ملليلتر بإبرة قياس 20. ستساعد هذه التقنية العلماء على دراسة النسخ البيولوجي والملف الجيني لفوربس والخلايا الجذعية العضلية في حالة طبيعية وخلال المراحل الأعمق من تجديد العضلات.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

العزلة والكمية Immunocytochemical توصيف الخلايا عضلي الابتدائية والخلايا الليفية من العضلات الهيكلية البشرية

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

فيفو السابقين الثقافة من بلعومي الأقواس لدراسة القلب والعضلات الأسلاف ومكانها المناسب

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

عن طريق عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية لارتفاع صفيحة ميكروسكوبية الإنتاجية قياسات الجهاز التنفسي

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

تحريض الحاد الهيكل العظمي تجديد العضلات التي Cardiotoxin حقن

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

إعداد والثقافة من الخلايا عضلي السلائف / Myoblasts الابتدائية من العضلات الهيكلية من الكبار والمسنين البشر

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

تقييم الضرر الناجم عن الشيخوخة و في فيفو إعادة برمجة في العضلات الهيكلية

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

العزلة، والثقافة، وتمايز الخلايا اللحمية في النخاع العظمى وفروعه اوستيوكلاست من الفئران

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

تطبيق التحفيز المزمن لدراسة التعديلات المظهرية الهيكل العظمى والعضلات الهوس الفئران التي يسببها النشاط

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

تحديد خلايا الهيكل العظمى والعضلات الأقمار الصناعية قبل الفلورة مع Pax7 والأجسام المضادة لامينين

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...