Name: facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-06-08T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

Vi vil gerne takke Tom Cheung (Hong Kong University of Science & Technology) for råd om MuSC-isolation. Dette arbejde blev finansieret af NIAMS-IRP gennem NIH-tilskud AR041126 og AR041164.

Alle udførte dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer godkendt af Animal Care and Use Committee (ACUC) ved National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases (NIAMS). Forskere, der udfører denne protokol, skal overholde deres lokale dyreetiske retningslinjer.
BEMÆRK: Denne protokol beskriver detaljeret, hvordan man isolerer FAP'er og MuSC'er fra bagben og skadede tibialis anterior (TA) muskler hos voksne han- og hunmus (3-6 måneder) og...

<ol>
	<li>Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+as+a+&amp;#34;mediator&amp;#34;+of+systemic+metabolism.">Muscle as a &amp;#34;mediator&amp;#34; of systemic metabolism.</a> Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).</li><li>Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+and+skeletal+muscle+regeneration.">Satellite cells and skeletal muscle regeneration.</a> Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).</li><li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells.">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).</li><li>Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+satellite+cell+contribution+to+uninjured+adult+muscle+fibers.">Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers.</a> Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).</li><li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+injury+activates+resident+fibro/adipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis.">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle.">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li><li>Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+roles+of+muscle-resident+fibro-adipogenic+progenitors+in+health,+regeneration,+neuromuscular+disorders,+and+aging.">Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging.</a> Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).</li><li>Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle.">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+progenitors+resident+in+the+skeletal+muscle+interstitium+exhibit+robust+BMP-dependent+osteogenic+activity+and+mediate+heterotopic+ossification.">Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).</li><li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+tissue-resident+PDGFR&#945;++fibro-adipogenic+progenitors+spontaneously+acquire+osteogenic+phenotype+in+an+altered+inflammatory+environment.">Murine tissue-resident PDGFR&#945;+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).</li><li>Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-adipogenic+progenitors+cross-talk+in+skeletal+muscle:+The+social+network.">Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).</li><li>Lemos, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nilotinib+reduces+muscle+fibrosis+in+chronic+muscle+injury+by+promoting+TNF-mediated+apoptosis+of+fibro/adipogenic+progenitors.">Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors.</a> Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).</li><li>Malecova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cellular+states+of+fibro-adipogenic+progenitors+during+myogenesis+and+muscular+dystrophy.">Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 9, 3670 (2018).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).</li><li>Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs):+Isolation+by+FACS+and+culture.">Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture.</a> Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).</li><li>Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+differentiation+of+fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs)+from+skeletal+muscle.">Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).</li><li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms.">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li><li>Contreras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+TGF-&#946;+and+PDGFR&#945;+signaling+pathways+regulates+the+fate+of+stromal+fibro-adipogenic+progenitors.">Cross-talk between TGF-&#946; and PDGFR&#945; signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors.</a> Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).</li><li>Holmes, C., Stanford, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Stem+cell+antigen-1:+Expression,+function,+and+enigma.">Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma.</a> Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).</li><li>Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HGFA+Is+an+injury-regulated+systemic+factor+that+induces+the+transition+of+stem+cells+into+GAlert.">HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert.</a> Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).</li><li>Garc&#237;a-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+maintains+a+genuine+muscle+stem-cell+quiescent+state+until+geriatric+age.">FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).</li><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterioration+and+variability+of+highly+purified+collagenase+blends+used+in+clinical+islet+isolation.">Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation.</a> Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).</li><li>Walls, P. L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+potential+for+bursting+bubbles+to+damage+suspended+cells.">Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li><li>Kafadar, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sca-1+expression+is+required+for+efficient+remodeling+of+the+extracellular+matrix+during+skeletal+muscle+regeneration.">Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration.</a> Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).</li></ol>

Etablering af effektive og reproducerbare protokoller til identifikation og isolering af rene voksne stamcellepopulationer er det første og mest kritiske skridt i retning af at forstå deres funktion. Isolerede FAP'er og MuSC'er kan bruges til at udføre multiomics-analyse i transplantationseksperimenter som en potentiel behandling af muskelsygdomme eller kan genetisk modificeres til sygdomsmodellering i stamcelleterapi. 
Protokollen, der er beskrevet her, giver standardiserede retningslinjer...

Skeletmuskulaturen er det største væv i kroppen, der tegner sig for ~ 40% af voksen menneskelig vægt, og er ansvarlig for at opretholde kropsholdning, generere bevægelse, regulere basal energimetabolisme og kropstemperatur1. Skeletmuskulatur er et meget dynamisk væv og besidder en bemærkelsesværdig evne til at tilpasse sig en række stimuli, såsom mekanisk stress, metaboliske ændringer og daglige miljøfaktorer. Derudover regenererer skeletmuskulaturen som reaktion på akut skade, hvilket fører til fuldstændig restaurering af dets morfologi og funktioner2. Skeletmuskulaturens plasticitet er hovedsageligt afhængig af en population af hjemmehørende muskelstamceller (MuSC'er), også kaldet satellitceller, som er placeret mellem myofiberplasmamembranen og den basale lamina 2,3. Under normale forhold befinder MuSC'er sig i muskelnichen i en hvilende tilstand med kun få divisioner for at kompensere for cellulær omsætning og for at genopbygge stamcellepuljen4. Som reaktion på skade går MuSC'er ind i cellecyklussen, spredes og bidrager enten til dannelsen af nye muskelfibre eller vender tilbage til nichen i en selvfornyelsesproces 2,3. Ud over MuSC'er er homeostatisk vedligeholdelse og regenerering af skeletmusklen afhængig af støtte fra en population af muskelboende celler ved navn fibro-adipogene forfædre (FAP'er)5,6,7. FAP'er er mesenkymale stromale celler indlejret i muskelbindevævet og i stand til at differentiere langs fibrogen, adipogen, osteogen eller chondrogen afstamning 5,8,9,10. FAP'er yder strukturel støtte til MuSC'er, da de er en kilde til ekstracellulære matrixproteiner i muskelstamcelleniche. FAP'er fremmer også langsigtet vedligeholdelse af skeletmuskulaturen ved at udskille cytokiner og vækstfaktorer, der giver trofisk støtte til myogenese og muskelvækst 6,11. Ved akut muskelskade spredes FAP'er hurtigt for at producere en forbigående niche, der understøtter den regenererende muskels strukturelle integritet og giver et gunstigt miljø til at opretholde MuSCs spredning og differentiering på en parakrin måde5. Efterhånden som regenerering fortsætter, ryddes FAP'er fra den regenerative muskel ved apoptose, og deres antal vender gradvist tilbage til basalniveau12. Under forhold, der favoriserer kronisk muskelskade, tilsidesætter FAP'er imidlertid pro-apoptotisk signalering og akkumuleres i muskelnichen, hvor de differentierer sig til kollagenproducerende fibroblaster og adipocytter, hvilket fører til ektopiske fedtinfiltrater og fibrotisk ardannelse12,13.
På grund af deres multipotens og deres regenerative evner er FAP'er og MuSC'er blevet identificeret som potentielle mål inden for regenerativ medicin til behandling af skeletmuskelforstyrrelser. For at undersøge deres funktion og terapeutiske potentiale er det derfor vigtigt at etablere effektive og reproducerbare protokoller til isolering og kultur af FAP'er og MuSC'er.
Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) kan identificere forskellige cellepopulationer baseret på morfologiske egenskaber såsom størrelse og granularitet og tillader cellespecifik isolering baseret på brug af antistoffer rettet mod celleoverflademarkører. Hos voksne mus udtrykker MuSC'er vaskulære celleadhæsionsmolekyle 1 (VCAM-1, også kendt som CD106)14,15 og α7-Integrin 15, mens FAP'er udtrykker den blodpladeafledte vækstfaktorreceptor α (PDGFRα) og stamcelleantigenet 1 (Sca1 eller Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . I protokollen beskrevet her blev MuSC'er identificeret som CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, mens FAP'er blev identificeret som CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Alternativt blev PDGFRαEGFP-mus anvendt til at isolere FAP'er som CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- events18,19. Desuden sammenlignede vi overlapningen mellem det fluorescerende signal fra PDGFRα-GFP+ celler med celler identificeret ved overflademarkøren Sca1. Vores analyse viste, at alle GFP-ekspressive celler også var positive for Sca1, hvilket indikerer, at begge tilgange kan anvendes til identifikation og isolering af FAP'er. Endelig bekræftede farvning med specifikke markørantistoffer renheden af hver cellepopulation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G BD Needle 1 in. single use, sterile</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b)</td>
			<td>The University of British Columbia</td>
			<td>53-0010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD31 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSMelody Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD106 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J&#160; mouse (Female and Male)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>007669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution (1 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 40 &#181;m Cell Strainer, Blue, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Collagenase, Type II, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Dispase, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DMEM, high glucose, HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12430054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Horse Serum, New Zealand origin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse PDGF&#160;R alpha Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9624464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NCC0528893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)</td>
			<td>Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 Streptavidin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle

Fibro-adipogene stamceller (FAP'er) er en population af skeletmuskulaturboende mesenkymale stromale celler (MSC'er), der er i stand til at differentiere langs fibrogen, adipogen, osteogen eller chondrogen afstamning. Sammen med muskelstamceller (MuSC'er) spiller FAP'er en kritisk rolle i muskelhomeostase, reparation og regenerering, samtidig med at de aktivt vedligeholder og ombygger den ekstracellulære matrix (ECM). Under patologiske tilstande, såsom kronisk skade og muskeldystrofier, gennemgår FAP'er afvigende aktivering og differentierer sig til kollagenproducerende fibroblaster og adipocytter, hvilket fører til fibrose og intramuskulær fedtinfiltration. FAP'er spiller således en dobbelt rolle i muskelregenerering, enten ved at opretholde MuSC-omsætning og fremme vævsreparation eller bidrage til fibrotisk ardannelse og ektopiske fedtinfiltrater, som kompromitterer skeletmuskelvævets integritet og funktion. En korrekt rensning af FAP'er og MuSC'er er en forudsætning for at forstå disse cellers biologiske rolle under fysiologiske såvel som patologiske forhold. Her beskriver vi en standardiseret metode til samtidig isolering af FAP'er og MuSC'er fra lemmermuskler hos voksne mus ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Protokollen beskriver detaljeret den mekaniske og enzymatiske dissociation af mononukleerede celler fra hele lemmer muskler og skadet tibialis anterior (TA) muskler. FAP'er og MuSC'er isoleres efterfølgende ved hjælp af en halvautomatisk cellesorterer for at opnå rene cellepopulationer. Vi beskriver desuden en optimeret metode til dyrkning af hvilende og aktiverede FAP'er og MuSC'er, enten alene eller under samkulturforhold.

Denne protokol tillader isolering af ca. en million FAP'er og op til 350.000 MuSC'er fra uskadte bagben af voksne vildtypemus (3-6 måneder), svarende til et udbytte på 8% for FAP'er og 3% for MuSC'er af samlede begivenheder. Ved sortering af celler fra beskadiget TA 7 dage efter skade samles to til tre TA-muskler for at opnå op til 300.000 FAPs og 120.000 MuSC'er, hvilket svarer til et udbytte på henholdsvis 11% og 4%. Renhedsværdier efter sortering er normalt over 95% for FAP'er og MuSC'er.
<p class="jove_conte...

Watch this Scientific Journal Video about FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle

Den præcise identifikation af fibro-adipogene stamceller (FAP'er) og muskelstamceller (MuSC'er) er afgørende for at studere deres biologiske funktion under fysiologiske og patologiske forhold. Denne protokol giver retningslinjer for isolering, rensning og kultur af FAP'er og MuSC'er fra voksne musemuskler.

FACS-isolering og dyrkning af fibro-adipogene forfædre og muskelstamceller fra uforstyrret og skadet museskeletmuskel

Fibro-adipogenic progenitor cells (FAPs) are a population of skeletal muscle-resident mesenchymal stromal cells (MSCs) capable of differentiating along ...

Denne protokol beskriver en metode til samtidig isolering af fibro adipogene, forfædre og muskelstamceller ved hjælp af fluorescensaktivatorer til sortering. Rene populationer af disse celler er en forudsætning for at forstå deres biologiske rolle i fysiologiske og patologiske forhold. Ved hjælp af denne teknik blev Forbes og muskelstamceller identificeret og isoleret fra enten armhule eller skadet muskel.Den høje fyldte straffrihed for Forbes og muskelstamceller har gjort det muligt for os at bruge disse celler til forskellige downstream-teknikker såsom saccharintransplantation og mudial mixanalyse. Til at begynde med skal du placere den aflivede museliggende på en dissektionspude og sprøjte den med 70% ethanol For at undgå forurening skal du bruge tang til at klemme midten af musemavehuden og skære cirka en centimeter åbning vandret. Tag fat i sårkanterne og disken i musen ved at trække åbningen i de modsatte retninger for at afdække musklerne nedenunder, udsæt den ene side af bagbenet ad gangen.Før du samler muskler, Fjern intermuskulært fedt mellem hamstrings i den proksimale ende af quadriceps for at forbedre isoleringen af fibro adipogene stamceller og muskelstamceller. Dernæst, uden at beskadige vævet, skal du bruge skarpe tang til at bryde og skrælle fasciaen af for at udsætte de underliggende tibialis anterior eller TA og extensor digitorum longus eller EDL muskler. Kør den skarpe spids af tangen under TA EDL-musklerne for at løsne musklerne fra skinnebenet.Afskær senerne, fastgør TA EDL til anklen, og mens du holder den med tang, skal du trimme musklerne med en saks langs TA EDL's langsgående linje. Skær senerne omkring knæet for at løsne hele TA EDL-musklerne. Placer musklerne i en seks centimeter skål, der holdes på is.At isolere gastrocnemius muskler skære alle sener ved anklen og løsne musklerne fra skinnebenet og fibulaen. Skær rundt om knæet og overfør musklerne til skålen. Skræl fasciaen omkring quadriceps af og adskil den fra lårbenet ved at køre den skarpe spids af tangen mellem muskel og knogle.Skær senerne rundt om knæet og trim resten af musklen ved at skære langs lårbenet, mens du holder quadriceps med tang i den distale ende. Placer musklerne i skålen på seks centimeter. Fjern hamstrings og resterende muskler omkring lårbenet og overfør dem til skålen.Saml bagbensmusklerne i en skål, der holdes på is. Aspirer vaskemedium fra skålen og tilsæt en til to milliliter muskeldissociationsbuffer for at holde musklerne fugtige. Derefter hakkemuskler grundigt Brug en skalpel til at rive og skære musklen i stykker, og brug derefter en saks til at fortsætte med at skære musklen i små stykker i et til to minutter, indtil du får en gyllepasta af godt hakket væv.Overfør derefter de hakkede muskler til det koniske rør, der indeholder muskeldissociationsbuffer. Forsegl rørene med laboratoriefilm og inkuber i et 37 grader Celsius vandbad med omrøring i en time. Efter en time skal du fjerne røret fra rysteren og fylde det til 50 ml Med vaskemedium skal du forsigtigt vende røret to gange for at sikre blanding.Centrifuger cellerne i en svingende spand rotor ved 250 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius. Overfør 42 ml supernatant til to nye rør og lad otte milliliter stå i det originale rør. Fyld de nye rør, der indeholder 21 ml supernatant op til 50 ml med vaskemedium.Centrifuger derefter cellerne ved 350 gange G i otte minutter ved fire grader Celsius. Aspirer supernatanten og hold pellets på is. Derefter tilsættes en milliliter collagenaser to lager og en milliliter dis-baseret lager i det originale rør indeholdende otte milliliter muskeldissociationsbuffer.Ved hjælp af en fem milliliter serologisk pipette resuspend pellet 10 gange uden tilstopning. Skub opløsningen ud mod rørets væg, og undgå dannelsesboblerne. Forsegl rørene med laboratoriefilm og inkuber i et 37 grader Celsius vandbad med omrøring i 30 minutter.Efter 30 minutter fjernes røret fra rysterens aspirat og skubber muskelsuspensionen 10 gange gennem en 10 milliliter sprøjte med en 20 gauge nål, fyld hvert rør op til 50 ml med vaskemedium og inverter røret. Centrifuger derefter ved 250 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius og overfør supernatanten til et nyt rør. Efterlader otte milliliter i det originale rør.Fyld det nye rør op til 50 ml med vaskemedium, centrifuger cellerne igen ved 350 gange G i otte minutter ved fire grader Celsius. Fjern supernatanten og hold pelleten på is. Anbring en 40 mikron nyloncellesi i det originale 50 ml koniske rør indeholdende otte milliliter vaskemedium og forvæd silen med en til to milliliter vaskemedium.Mens du holder silen, skal du bruge en 10 milliliter pipette til at resuspendere pelleten forsigtigt. Filtrer suspensionen gennem cellesilen tilbage i det samme rør for at minimere celletab. Filtrer de andre rørpiller tilbage i det originale rør ved at tilføje fire til fem milliliter vaskemedium til hvert rør for at resuspendere pellets og overføre opløsningen til selvsien placeret i det originale rør.Efter opsamling af alle pellets i det originale 50 milliliter rør skylles selvsilen med yderligere fire til fem milliliter vaskemedium. Brug en 1000 mikroliter pipette til at opsamle al væsken fra undersiden af selvsilen. Fyld hvert rør med vaskemedium op til 50 ml og vend røret om.Centrifuger røret ved 250 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius. Fjern supernatanten med det samme uden at forstyrre pelleten, og suspender pelleten i 600 mikroliter vaskemedium. Overfør suspensionen til et to milliliter mikrocentrifugerør.Tilsæt antistoffer CD 31 APC CD 45 APC SCA en Pacific Blue VCAM en biotin og alfa syv Integrin PE i et to millimeter rør indeholdende cellesuspension. Bland og inkuber cellerne forsigtigt i en roterende ryster ved fire grader Celsius i 45 minutter for at beskytte dem mod lys. Efter inkubation fyldes alle rør op til to milliliter med vaskemedium og centrifuge ved 250 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius.Fjern supernatanten og suspender pelleten i 300 mikroliter vaskemedium. Derefter tilsættes streptavidinantistof i rør og inkuberes cellerne i en roterende ryster ved fire grader Celsius i 20 minutter. Efter inkubation fyldes rør indeholdende streptavidinantistof til to milliliter med vaskemedium.Centrifuger derefter rørene og aspirer supernatanten fuldstændigt. Efter den anden vask resuspenderes cellerne i forsøgsrøret i 500 mikroliter vaskemedium. Forvåd en cellesihætte af et fem milliliter polystyren rundt bundrør med 200 mikroliter vaskemedium.Overfør cellesuspensionen fra forsøgsrøret til det fem milliliter polystyren runde bundrør, og lad det filtrere efter tyngdekraften. Udskriv de to milliliter rør, der indeholder den eksperimentelle prøvesuspension med 300 mikroliter vaskemedium, og før det gennem den samme silhætte. Brug en 200 mikroliter pipette til at opsamle al væsken fra undersiden af cellesien.Forsegl med en hætte, lad rør ligge på is og beskyt dem mod lys. Gating-strategien, der er vedtaget til isolering af fibro adipogen stamfader og muskelstamceller, er vist her. PD GFR alpha E G F P knock in reporter mus udtrykker H to B E G F P fusionsgenet fra det endogene PD G FFR alpha locus, hvilket muliggør effektiv og specifik mærkning af PD G GFR alpha-slægten.Renheden af de isolerede cellepopulationer blev bekræftet ved immunfarvning af co-kultur GFP-positiv fibro adipogen stamfader og muskelstamceller med PAC-syv antistoffer. GFP-positiv fibro adipogen stamfader udtrykte ikke PAC-syv-markøren, mens muskelstamceller reagerede med dette antistof. Alle GFP-ekspressionsceller var positive for SCA en og negative for CD 31, CD 45 VCAM en og alfa syv integrin.Den fibro adipogene stamfader og muskelstamceller isoleret fra mus skadet med intramuskulære injektioner af intet toksin syv dage efter skade er vist. Da muskelstamceller aktiveres en stigning i cellulær størrelse. Det er vigtigt at justere F SCA- og SS CA-parametrene og udvide porten til at omfatte disse celler i midten.Kvantificering af fibro adipogenic stamfader og muskelstamceller i uskadte og syv dage efter skade TA muskler er vist her. Selvom toppen og spredningen blev observeret mellem dag to og tre, var en lav grad af prolifererende celler stadig mærkbar syv dage efter skaden. Udførelse af korrekt muskelhakning er af afgørende betydning for at frigive en enkelt celle.Desuden opnås mononukleotidcelleisolering ved at køre suspensionen til en 10 milliliter sprøjte med en 20 gauged nål. Denne teknik vil hjælpe forskere med at studere den biologiske transkriptionelle og epigenomiske profil af Forbes og muskelstamceller i normal tilstand og i de dybere stadier af muskelregenerering.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolering og kvantitativ Immuncytokemisk karakterisering af primære myogene celler og fibroblaster fra human skeletmuskel

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Kultur Faryngeal Arches at studere hjerte og Muskel Progenitorer og deres niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Brug af Isoleret Mitokondrier fra minimale mængder af Mouse Skeletmuskel for High throughput Mikropladekrav Respiratory Målinger

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Induktion af akut Skeletal Muscle Regeneration af cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Forberedelse og Kultur Myogenic precursorceller / Primær Myoblaster af skeletmuskulatur af Voksen og Aged Mennesker

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluering af skade-induceret gulne og In Vivo omprogrammering i den skeletmuskulatur

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolation, kultur og differentiering af knoglemarven stromale celler og osteoklast ophav fra mus

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Anvendelse af kronisk stimulering til at studere kontraktile aktivitet-induceret rotte skeletmuskulatur fænotypiske tilpasninger

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identifikation af skeletmuskulatur satellit celler ved immunfluorescens med Pax7 og Laminin antistoffer

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...