Name: facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-06-08T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

We willen Tom Cheung (The Hong Kong University of Science &Technology) bedanken voor advies over MuSC-isolatie. Dit werk werd gefinancierd door het NIAMS-IRP via NIH-subsidies AR041126 en AR041164.

Alle uitgevoerde dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met institutionele richtlijnen die zijn goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee (ACUC) van het National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases (NIAMS). Onderzoekers die dit protocol uitvoeren, moeten zich houden aan hun lokale richtlijnen voor dierenethiek.
OPMERKING: Dit protocol beschrijft in detail hoe FAPs en MuSCs kunnen worden geïsoleerd van achterste ledematen en gewonde tibialis anterieure...

<ol>
	<li>Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+as+a+&amp;#34;mediator&amp;#34;+of+systemic+metabolism.">Muscle as a &amp;#34;mediator&amp;#34; of systemic metabolism.</a> Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).</li><li>Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+and+skeletal+muscle+regeneration.">Satellite cells and skeletal muscle regeneration.</a> Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).</li><li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells.">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).</li><li>Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+satellite+cell+contribution+to+uninjured+adult+muscle+fibers.">Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers.</a> Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).</li><li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+injury+activates+resident+fibro/adipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis.">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle.">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li><li>Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+roles+of+muscle-resident+fibro-adipogenic+progenitors+in+health,+regeneration,+neuromuscular+disorders,+and+aging.">Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging.</a> Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).</li><li>Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle.">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+progenitors+resident+in+the+skeletal+muscle+interstitium+exhibit+robust+BMP-dependent+osteogenic+activity+and+mediate+heterotopic+ossification.">Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).</li><li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+tissue-resident+PDGFR&#945;++fibro-adipogenic+progenitors+spontaneously+acquire+osteogenic+phenotype+in+an+altered+inflammatory+environment.">Murine tissue-resident PDGFR&#945;+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).</li><li>Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-adipogenic+progenitors+cross-talk+in+skeletal+muscle:+The+social+network.">Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).</li><li>Lemos, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nilotinib+reduces+muscle+fibrosis+in+chronic+muscle+injury+by+promoting+TNF-mediated+apoptosis+of+fibro/adipogenic+progenitors.">Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors.</a> Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).</li><li>Malecova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cellular+states+of+fibro-adipogenic+progenitors+during+myogenesis+and+muscular+dystrophy.">Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 9, 3670 (2018).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).</li><li>Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs):+Isolation+by+FACS+and+culture.">Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture.</a> Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).</li><li>Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+differentiation+of+fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs)+from+skeletal+muscle.">Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).</li><li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms.">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li><li>Contreras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+TGF-&#946;+and+PDGFR&#945;+signaling+pathways+regulates+the+fate+of+stromal+fibro-adipogenic+progenitors.">Cross-talk between TGF-&#946; and PDGFR&#945; signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors.</a> Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).</li><li>Holmes, C., Stanford, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Stem+cell+antigen-1:+Expression,+function,+and+enigma.">Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma.</a> Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).</li><li>Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HGFA+Is+an+injury-regulated+systemic+factor+that+induces+the+transition+of+stem+cells+into+GAlert.">HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert.</a> Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).</li><li>Garc&#237;a-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+maintains+a+genuine+muscle+stem-cell+quiescent+state+until+geriatric+age.">FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).</li><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterioration+and+variability+of+highly+purified+collagenase+blends+used+in+clinical+islet+isolation.">Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation.</a> Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).</li><li>Walls, P. L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+potential+for+bursting+bubbles+to+damage+suspended+cells.">Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li><li>Kafadar, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sca-1+expression+is+required+for+efficient+remodeling+of+the+extracellular+matrix+during+skeletal+muscle+regeneration.">Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration.</a> Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).</li></ol>

Het opstellen van efficiënte en reproduceerbare protocollen voor de identificatie en isolatie van zuiver volwassen stamcelpopulaties is de eerste en meest kritieke stap naar het begrijpen van hun functie. Geïsoleerde FAPs en MuSCs kunnen worden gebruikt om multiomics-analyse uit te voeren in transplantatie-experimenten als een potentiële behandeling voor spierziekten of kunnen genetisch worden gemodificeerd voor ziektemodellering in stamceltherapie. 
Het hier beschreven protocol biedt gesta...

De skeletspieren zijn het grootste weefsel in het lichaam, goed voor ~ 40% van het volwassen menselijk gewicht, en is verantwoordelijk voor het handhaven van de houding, het genereren van beweging, het reguleren van het basale energiemetabolisme en de lichaamstemperatuur1. Skeletspieren zijn een zeer dynamisch weefsel en bezitten een opmerkelijk vermogen om zich aan te passen aan een verscheidenheid aan stimuli, zoals mechanische stress, metabole veranderingen en dagelijkse omgevingsfactoren. Bovendien regenereert de skeletspieren als reactie op acuut letsel, wat leidt tot volledig herstel van de morfologie en functies2. Skeletspierplasticiteit is voornamelijk afhankelijk van een populatie van residente spierstamcellen (MuSC's), ook wel satellietcellen genoemd, die zich bevinden tussen het myofiberplasmamembraan en de basale lamina 2,3. Onder normale omstandigheden bevinden MuSC's zich in de spierniche in een rustige toestand, met slechts een paar divisies om de cellulaire omzet te compenseren en de stamcelpool aan te vullen4. Als reactie op letsel komen MuSC's de celcyclus binnen, prolifereren ze en dragen ze bij aan de vorming van nieuwe spiervezels of keren ze terug naar de niche in een zelfvernieuwingsproces 2,3. Naast MuSC's zijn homeostatisch onderhoud en regeneratie van de skeletspieren afhankelijk van de ondersteuning van een populatie van spierresidente cellen genaamd fibro-adipogene voorlopers (FAPs)5,6,7. FAPs zijn mesenchymale stromale cellen ingebed in het spierbindweefsel en in staat om onderscheid te maken langs fibrogene, adipogene, osteogene of chondrogene afstamming 5,8,9,10. FAPs bieden structurele ondersteuning voor MuSC's omdat ze een bron zijn van extracellulaire matrixeiwitten in de spierstamcelniche. FAPs bevorderen ook het langetermijnonderhoud van de skeletspieren door cytokines en groeifactoren af te scheiden die trofische ondersteuning bieden voor myogenese en spiergroei 6,11. Bij acuut spierletsel vermenigvuldigen FAPs zich snel om een voorbijgaande niche te produceren die de structurele integriteit van de regenererende spier ondersteunt en een gunstige omgeving biedt om de proliferatie en differentiatie van MuSC's op een paracriene manier te ondersteunen5. Naarmate de regeneratie vordert, worden FAPs door apoptose uit de regeneratieve spier verwijderd en keren hun aantallen geleidelijk terug naar basaal niveau12. In omstandigheden die chronische spierbeschadiging bevorderen, overschrijven FAPs echter pro-apoptotische signalering en hopen ze zich op in de spierniche, waar ze differentiëren in collageenproducerende fibroblasten en adipocyten, wat leidt tot ectopische vetinfiltraten en fibrotische littekenvorming12,13.
Vanwege hun multipotentie en hun regeneratieve vermogens zijn FAPs en MuSC's geïdentificeerd als potentiële doelwitten in de regeneratieve geneeskunde voor de behandeling van skeletspieraandoeningen. Daarom is het belangrijk om, om hun functie en therapeutisch potentieel te onderzoeken, efficiënte en reproduceerbare protocollen op te stellen voor de isolatie en cultuur van FAPs en MuSC's.
Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) kan verschillende celpopulaties identificeren op basis van morfologische kenmerken zoals grootte en granulariteit, en maakt celspecifieke isolatie mogelijk op basis van het gebruik van antilichamen gericht tegen celoppervlakmarkers. Bij volwassen muizen drukken MuSC's het vasculaire celadhesiemolecuul 1 (VCAM-1, ook bekend als CD106)14,15 en α7-Integrin15 tot expressie, terwijl FAPs de van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor tot expressie brengen α (PDGFRα) en het stamcelantigeen 1 (Sca1 of Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . In het hier beschreven protocol werden MuSC's geïdentificeerd als CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, terwijl FAPs werden geïdentificeerd als CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Als alternatief werden PDGFRαEGFP-muizen gebruikt om FAPs te isoleren als CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-events18,19. Bovendien vergeleken we de overlapping tussen het fluorescerende signaal van PDGFRα-GFP+ cellen met cellen geïdentificeerd door de oppervlaktemarker Sca1. Onze analyse toonde aan dat alle GFP-expresserende cellen ook positief waren voor Sca1, wat aangeeft dat beide benaderingen kunnen worden gebruikt voor de identificatie en isolatie van FAPs. Ten slotte bevestigde kleuring met specifieke markerantistoffen de zuiverheid van elke celpopulatie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G BD Needle 1 in. single use, sterile</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b)</td>
			<td>The University of British Columbia</td>
			<td>53-0010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD31 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSMelody Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD106 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J&#160; mouse (Female and Male)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>007669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution (1 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 40 &#181;m Cell Strainer, Blue, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Collagenase, Type II, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Dispase, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DMEM, high glucose, HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12430054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Horse Serum, New Zealand origin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse PDGF&#160;R alpha Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9624464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NCC0528893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)</td>
			<td>Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 Streptavidin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle

Fibro-adipogene voorlopercellen (FAPs) zijn een populatie van mesenchymale stromale cellen (MSC's) die in staat zijn om te differentiëren langs fibrogene, adipogene, osteogene of chondrogene afstamming. Samen met spierstamcellen (MuSC's) spelen FAPs een cruciale rol bij spierhomeostase, herstel en regeneratie, terwijl ze de extracellulaire matrix (ECM) actief onderhouden en remodelleren. Bij pathologische aandoeningen, zoals chronische schade en spierdystrofieën, ondergaan FAPs afwijkende activering en differentiëren ze in collageenproducerende fibroblasten en adipocyten, wat leidt tot fibrose en intramusculaire vetinfiltratie. Faps spelen dus een dubbele rol bij spierregeneratie, hetzij door musc-omzet te ondersteunen en weefselherstel te bevorderen, hetzij door bij te dragen aan fibrotische littekenvorming en ectopische vetinfiltraten, die de integriteit en functie van het skeletspierweefsel in gevaar brengen. Een goede zuivering van FAPs en MuSCs is een voorwaarde voor het begrijpen van de biologische rol van deze cellen in fysiologische en pathologische omstandigheden. Hier beschrijven we een gestandaardiseerde methode voor de gelijktijdige isolatie van FAPs en MuSC's van ledemaatspieren van volwassen muizen met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Het protocol beschrijft in detail de mechanische en enzymatische dissociatie van mononucleaire cellen van hele ledematen spieren en gewonde tibialis anterieure (TA) spieren. FAPs en MuSC's worden vervolgens geïsoleerd met behulp van een semi-geautomatiseerde celsorteerder om zuivere celpopulaties te verkrijgen. Daarnaast beschrijven we een geoptimaliseerde methode voor het kweken van rustige en geactiveerde FAPs en MuSC's, alleen of in cocultuuromstandigheden.

Dit protocol maakt de isolatie mogelijk van ongeveer een miljoen FAPs en tot 350.000 MuSC's van niet-gewonde achterpoten van volwassen muizen van het wilde type (3-6 maanden), wat overeenkomt met een opbrengst van 8% voor FAPs en 3% voor MuSC's van totale gebeurtenissen. Bij het sorteren van cellen van beschadigde TA 7 dagen na het letsel, worden twee tot drie TA-spieren samengevoegd om tot 300.000 FAPs en 120.000 MuSC's te verkrijgen, wat overeenkomt met een rendement van respectievelijk 11% en 4%. De zuiverheidswaarden...

Watch this Scientific Journal Video about FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle

De precieze identificatie van fibro-adipogene voorlopercellen (FAPs) en spierstamcellen (MuSC's) is van cruciaal belang voor het bestuderen van hun biologische functie in fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit protocol biedt richtlijnen voor de isolatie, zuivering en cultuur van FAPs en MuSC's van volwassen muisspieren.

FACS-isolatie en kweek van fibro-adipogene voorlopers en spierstamcellen van onverstoorbare en gewonde muizenskeletspieren

Fibro-adipogenic progenitor cells (FAPs) are a population of skeletal muscle-resident mesenchymal stromal cells (MSCs) capable of differentiating along ...

Dit protocol beschrijft een methode voor de gelijktijdige isolatie van fibro adipogene, voorlopercellen en spierstamcellen met behulp van fluorescentieactivatoren van sorteren. Zuivere populaties van deze cellen zijn een voorwaarde voor het begrijpen van hun biologische rol in fysiologische en pathologische omstandigheden. Met behulp van deze techniek werden Forbes en spierstamcellen geïdentificeerd en geïsoleerd uit oksel of gewonde spieren.De hoge gevulde straffeloosheid van Forbes en spierstamcellen hebben ons in staat gesteld om deze cellen te gebruiken voor verschillende downstream-technieken zoals sacharinetransplantatie en mudial mix-analyse. Plaats om te beginnen de geëuthanaseerde muisrug op een dissectiepad en spuit deze met 70% ethanol Om besmetting te voorkomen, gebruikt u een tang om het midden van de buikhuid van de muis te knijpen en ongeveer een centimeter horizontaal te openen. Grijp de wondranden en schijf in de muis door de opening in de tegenovergestelde richtingen te trekken om de spieren eronder bloot te leggen, waarbij één kant van de achterpoot op dat moment wordt blootgelegd.Verwijder voordat spieren worden verzameld intermusculair vet tussen de hamstrings in het proximale uiteinde van de quadriceps om de isolatie van fibro-adipogene voorlopercellen en spierstamcellen te verbeteren. Gebruik vervolgens, zonder het weefsel te beschadigen, een scherpe tang om de fascia te breken en af te pellen om de onderliggende tibialis anterior of TA en extensor digitorum longus of EDL-spieren bloot te leggen. Laat de scherpe punt van de tang onder de TA EDL-spieren lopen om de spieren los te maken van het scheenbeen.Knip de pezen af, bevestig de TA EDL aan de enkel en terwijl u deze vasthoudt met een tang, trimt u de spieren met een schaar langs de lengtelijn van de TA EDL. Snijd de pezen rond de knie om de hele TA EDL-spieren los te maken. Plaats de spieren in een schaal van zes centimeter die op ijs wordt gehouden.Om gastrocnemiusspieren te isoleren, snijdt u alle pezen bij de enkel en maakt u de spieren los van het scheenbeen en het kuitbeen. Snijd rond de knie en breng de spieren over naar de schaal. Verwijder de fascia rond de quadriceps en scheid deze van het dijbeen door de scherpe punt van de tang tussen de spier en het bot te laten lopen.Snijd de pezen rond de knie en trim de rest van de spier door langs het dijbeen te snijden terwijl de quadriceps met een tang aan het distale uiteinde worden vastgehouden. Plaats de spieren in de schaal van zes centimeter. Maak de hamstrings en resterende spieren rond het dijbeen los en breng die over naar het gerecht.Verzamel de spieren van de achterpoten in een schaal die op ijs wordt gehouden. Aspirate wasmedium uit de schaal en voeg één tot twee milliliter spierdissociatiebuffer toe om de spieren vochtig te houden. Vervolgens gehakt spieren grondig Gebruik een scalpel om de spier te scheuren en te snijden en gebruik vervolgens een schaar om de spier gedurende één tot twee minuten in kleine stukjes te blijven snijden totdat een slurrypasta van goed gehakt weefsel wordt verkregen.Breng vervolgens de gehakte spieren over naar de conische buis met spierdissociatiebuffer. Sluit de buizen af met laboratoriumfilm en incubeer in een waterbad van 37 graden Celsius met agitatie gedurende een uur. Verwijder na een uur de buis uit de shaker en vul deze tot 50 milliliter Met wasmedium keert u de buis twee keer voorzichtig om om te zorgen voor menging.Centrifugeer de cellen in een zwenkbare emmer Rotor op 250 maal G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Breng 42 milliliter supernatant over in twee nieuwe buizen en laat acht milliliter in de originele buis. Vul de nieuwe buisjes met 21 milliliter van het supernatant tot 50 milliliter met wasmedium.Centrifugeer vervolgens de cellen op 350 maal G gedurende acht minuten bij vier graden Celsius. Adem het supernatant aan en houd de pellets op ijs. Voeg vervolgens een milliliter collagenasen twee bouillon en een milliliter dis-gebaseerde bouillon toe in de oorspronkelijke buis met acht milliliter spierdissociatiebuffer.Gebruik een serologische pipet van vijf milliliter om de pellet 10 keer te resuspeneren zonder verstopping. Werp de oplossing uit naar de wand van de buis en vermijd de vormingsbellen. Sluit de buizen af met laboratoriumfilm en incubeer gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius met agitatie.Verwijder na 30 minuten de buis uit het shakeraspiraat en werp de spiersuspensie 10 keer uit door een spuit van 10 milliliter met een naald van 20 gauge, vul elke buis tot 50 milliliter met wasmedium en keer de buis om. Centrifugeer vervolgens op 250 maal G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en breng het supernatant over in een nieuwe buis. Acht milliliter in de originele buis laten.Vul de nieuwe buis tot 50 milliliter met wasmedium, centrifugeer de cellen opnieuw op 350 maal G gedurende acht minuten bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en bewaar de pellet op ijs. Plaats een 40 micron nylon celzeef in de originele 50 milliliter conische buis met acht milliliter wasmedium en maak de zeef voorbevochtig met één tot twee milliliter wasmedium.Gebruik tijdens het vasthouden van de zeef een pipet van 10 milliliter om de pellet voorzichtig te resuspeneren. Filter de suspensie door de celzeef terug in dezelfde buis om celverlies te minimaliseren. Filter de andere buispellets terug in de oorspronkelijke buis door vier tot vijf milliliter wasmedium aan elke buis toe te voegen om de pellets te resuspenderen en breng de oplossing over op de zelfzeef die in de oorspronkelijke buis is geplaatst.Na het verzamelen van alle pellets in de originele buis van 50 milliliter spoelt u de zelfzeef met nog eens vier tot vijf milliliter wasmedium. Gebruik een pipet van 1000 microliter om alle vloeistof van de onderkant van de zelfzeef te verzamelen. Vul elke buis met wasmedium tot 50 milliliter en keer de buis om.Centrifugeer de buis op 250 maal G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant onmiddellijk zonder de pellet te verstoren en resuspenseer de pellet in 600 microliter wasmedium. Breng de suspensie over in een microcentrifugebuis van twee milliliter.Voeg antilichamen CD 31 APC CD 45 APC SCA one Pacific Blue VCAM one biotine en alpha seven Integrin PE toe aan een buis van twee millimeter met celsuspensie. Meng en incubeer de cellen voorzichtig in een roterende shaker op vier graden Celsius gedurende 45 minuten en bescherm ze tegen licht. Vul na incubatie alle buizen tot twee milliliter met wasmedium en centrifugeer op 250 maal G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 300 microliter wasmedium. Voeg vervolgens streptavidin-antilichaam toe aan buizen en incubeer de cellen in een roterende shaker op vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Vul na incubatie buizen met streptavidin-antilichaam tot twee milliliter met wasmedium.Centrifugeer vervolgens de buizen en aspirateer het supernatant volledig. Na de tweede wasbeurt resuspenseert u de cellen in de experimentele buis in 500 microliter wasmedium. Maak een celzeefdop van een vijf milliliter polystyreen ronde onderbuis met 200 microliter wasmedium voorbevochtigd.Breng de celsuspensie van de experimentele buis over in de vijf milliliter polystyreen ronde onderbuis en laat deze filteren op basis van de zwaartekracht. Print de buis van twee milliliter met de experimentele monstersuspensie met 300 microliter wasmedium en laat deze door dezelfde zeefdop lopen. Gebruik een pipet van 200 microliter om alle vloeistof van de onderkant van de celzeef te verzamelen.Sluit af met een dop, laat buizen op ijs liggen en bescherm ze tegen licht. De gatingstrategie voor de isolatie van fibro adipogene voorloper- en spierstamcellen wordt hier getoond. De PD GFR alpha E G F P knock in reporter muizen drukt het H twee B E G F P fusie gen uit de endogene PD G FFR alpha locus, waardoor efficiënte en specifieke labeling van de PD G GFR alpha lineage mogelijk is.De zuiverheid van de geïsoleerde celpopulaties werd bevestigd door immunokleuring van co-kweek GFP-positieve fibro adipogene voorloper- en spierstamcellen met PAC-seven-antilichamen. GFP-positieve fibro adipogene voorloper drukte de PAC-seven marker niet uit, terwijl spierstamcellen reageerden met dit antilichaam. Alle GFP-expressiecellen waren positief voor SCA één en negatief voor CD 31, CD 45 VCAM één en alfa zeven integrine.De fibro adipogene voorloper en spierstamcellen geïsoleerd uit muizen gewond met intramusculaire injecties van geen toxine zeven dagen na het letsel worden getoond. Naarmate spierstamcellen worden geactiveerd, neemt de cellulaire grootte toe. Het is belangrijk om de F SCA- en SS CA-parameters aan te passen en de poort uit te breiden met die cellen in het midden.Kwantificering van fibro adipogene voorloper en spierstamcellen in niet-gewonde en zeven dagen na het letsel TA-spieren worden hier getoond. Hoewel de piek en proliferatie werd waargenomen tussen dag twee en drie, was een lage snelheid van prolifererende cellen zeven dagen na het letsel nog steeds merkbaar. Het uitvoeren van de juiste spiergehakt is van cruciaal belang om een enkele cel vrij te geven.Bovendien wordt mononucleotidecelisolatie bereikt door de suspensie uit te voeren naar een spuit van 10 milliliter met een naald van 20 gauged. Deze techniek zal wetenschappers helpen om het biologische transcriptionele en epigenomische profiel van Forbes en spierstamcellen in normale toestand en tijdens de diepere stadia van spierregeneratie te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolatie en Kwantitatieve Immunocytochemische karakterisering van primaire Myogene cellen en fibroblasten van Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Cultuur van pharynxbogen to Heart en Muscle voorouders en hun niche Studie

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Met behulp Isolated Mitochondriën van geringe hoeveelheden van de muis skeletspieren voor High throughput Microplate Respiratory Metingen

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Inductie van Acute Skeletal Muscle Regeneration door cardiotoxine Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Voorbereiding en Cultuur van Myogene voorloper cellen / Primary myoblasten uit Skeletal Muscle van Adult en Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluatie van schade-geïnduceerde senescentie en In Vivo herprogrammering in de skeletspieren

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolatie, cultuur en differentiatie van beenmerg stromale cellen en Osteoclast voorlopercellen van muizen

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Toepassing van chronische stimulering te bestuderen contractiele activiteit-geïnduceerde Rat skeletspieren fenotypische aanpassingen

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identificatie van de skeletspieren satelliet cellen met immunofluorescentie met Pax7 en Laminin antilichamen

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...