Name: facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-06-08T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

Nous tenons à remercier Tom Cheung (Université des sciences et technologies de Hong Kong) pour ses conseils sur l’isolement du MusC. Ce travail a été financé par le NIAMS-IRP grâce aux subventions AR041126 et AR041164 des NIH.

Toutes les expériences sur les animaux effectuées ont été menées conformément aux directives institutionnelles approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux (ACUC) de l’Institut national de l’arthrite, des maladies musculo-squelettiques et cutanées (NIAMS). Les enquêteurs qui exécutent ce protocole doivent respecter leurs lignes directrices locales en matière d’éthique animale.
REMARQUE: Ce protocole décrit en détail comment isoler les FAP et les MuSC des...

<ol>
	<li>Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+as+a+&amp;#34;mediator&amp;#34;+of+systemic+metabolism.">Muscle as a &amp;#34;mediator&amp;#34; of systemic metabolism.</a> Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).</li><li>Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+and+skeletal+muscle+regeneration.">Satellite cells and skeletal muscle regeneration.</a> Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).</li><li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells.">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).</li><li>Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+satellite+cell+contribution+to+uninjured+adult+muscle+fibers.">Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers.</a> Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).</li><li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+injury+activates+resident+fibro/adipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis.">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle.">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li><li>Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+roles+of+muscle-resident+fibro-adipogenic+progenitors+in+health,+regeneration,+neuromuscular+disorders,+and+aging.">Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging.</a> Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).</li><li>Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle.">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+progenitors+resident+in+the+skeletal+muscle+interstitium+exhibit+robust+BMP-dependent+osteogenic+activity+and+mediate+heterotopic+ossification.">Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).</li><li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+tissue-resident+PDGFR&#945;++fibro-adipogenic+progenitors+spontaneously+acquire+osteogenic+phenotype+in+an+altered+inflammatory+environment.">Murine tissue-resident PDGFR&#945;+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).</li><li>Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-adipogenic+progenitors+cross-talk+in+skeletal+muscle:+The+social+network.">Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).</li><li>Lemos, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nilotinib+reduces+muscle+fibrosis+in+chronic+muscle+injury+by+promoting+TNF-mediated+apoptosis+of+fibro/adipogenic+progenitors.">Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors.</a> Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).</li><li>Malecova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cellular+states+of+fibro-adipogenic+progenitors+during+myogenesis+and+muscular+dystrophy.">Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 9, 3670 (2018).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).</li><li>Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs):+Isolation+by+FACS+and+culture.">Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture.</a> Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).</li><li>Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+differentiation+of+fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs)+from+skeletal+muscle.">Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).</li><li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms.">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li><li>Contreras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+TGF-&#946;+and+PDGFR&#945;+signaling+pathways+regulates+the+fate+of+stromal+fibro-adipogenic+progenitors.">Cross-talk between TGF-&#946; and PDGFR&#945; signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors.</a> Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).</li><li>Holmes, C., Stanford, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Stem+cell+antigen-1:+Expression,+function,+and+enigma.">Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma.</a> Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).</li><li>Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HGFA+Is+an+injury-regulated+systemic+factor+that+induces+the+transition+of+stem+cells+into+GAlert.">HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert.</a> Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).</li><li>Garc&#237;a-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+maintains+a+genuine+muscle+stem-cell+quiescent+state+until+geriatric+age.">FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).</li><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterioration+and+variability+of+highly+purified+collagenase+blends+used+in+clinical+islet+isolation.">Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation.</a> Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).</li><li>Walls, P. L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+potential+for+bursting+bubbles+to+damage+suspended+cells.">Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li><li>Kafadar, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sca-1+expression+is+required+for+efficient+remodeling+of+the+extracellular+matrix+during+skeletal+muscle+regeneration.">Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration.</a> Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).</li></ol>

L’établissement de protocoles efficaces et reproductibles pour l’identification et l’isolement des populations de cellules souches adultes pures est la première et la plus importante étape pour comprendre leur fonction. Les FAP et les MuSC isolés peuvent être utilisés pour effectuer des analyses multiomiques dans des expériences de transplantation en tant que traitement potentiel des maladies musculaires ou peuvent être génétiquement modifiés pour la modélisation de la maladie dans la thérapie par cell...

Le muscle squelettique est le plus grand tissu du corps, représentant ~ 40% du poids humain adulte, et est responsable du maintien de la posture, de la génération de mouvement, de la régulation du métabolisme énergétique de base et de la température corporelle1. Le muscle squelettique est un tissu très dynamique et possède une capacité remarquable à s’adapter à une variété de stimuli, tels que le stress mécanique, les altérations métaboliques et les facteurs environnementaux quotidiens. En outre, le muscle squelettique se régénère en réponse à une blessure aiguë, conduisant à une restauration complète de sa morphologie et de ses fonctions2. La plasticité des muscles squelettiques repose principalement sur une population de cellules souches musculaires résidentes (MuSC), également appelées cellules satellites, situées entre la membrane plasmique myofibreuse et la lame basale 2,3. Dans des conditions normales, les MuSCs résident dans la niche musculaire dans un état de repos, avec seulement quelques divisions pour compenser le renouvellement cellulaire et reconstituer le pool de cellules souches4. En réponse à une blessure, les MuSCs entrent dans le cycle cellulaire, prolifèrent et contribuent à la formation de nouvelles fibres musculaires ou retournent dans la niche dans un processus d’auto-renouvellement 2,3. En plus des MuSC, le maintien homéostatique et la régénération du muscle squelettique reposent sur le soutien d’une population de cellules résidentes musculaires appelées progéniteurs fibro-adipogènes (PAF)5,6,7. Les FAP sont des cellules stromales mésenchymateuses intégrées dans le tissu conjonctif musculaire et capables de se différencier le long de la lignée fibrogénique, adipogénique, ostéogène ou chondrogène 5,8,9,10. Les FAP fournissent un soutien structurel aux MuSC car ils sont une source de protéines de la matrice extracellulaire dans la niche des cellules souches musculaires. Les PAF favorisent également le maintien à long terme du muscle squelettique en sécrétant des cytokines et des facteurs de croissance qui fournissent un soutien trophique à la myogenèse et à la croissance musculaire 6,11. Lors d’une lésion musculaire aiguë, les FAP prolifèrent rapidement pour produire une niche transitoire qui soutient l’intégrité structurelle du muscle régénérant et fournit un environnement favorable pour soutenir la prolifération et la différenciation des MuSC de manière paracrine5. Au fur et à mesure que la régénération progresse, les FAP sont éliminés du muscle régénératif par apoptose, et leur nombre revient progressivement au niveau basal12. Cependant, dans des conditions favorisant les lésions musculaires chroniques, les FAP remplacent la signalisation pro-apoptotique et s’accumulent dans la niche musculaire, où ils se différencient en fibroblastes et adipocytes producteurs de collagène, entraînant des infiltrats de graisse ectopique et la formation de cicatrices fibrotiques12,13.
En raison de leur multipotence et de leurs capacités de régénération, les FAP et les MuSC ont été identifiés comme des cibles potentielles en médecine régénérative pour le traitement des troubles des muscles squelettiques. Par conséquent, pour étudier leur fonction et leur potentiel thérapeutique, il est important d’établir des protocoles efficaces et reproductibles pour l’isolement et la culture des FAP et des MuSC.
Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) permet d’identifier différentes populations cellulaires en fonction de caractéristiques morphologiques telles que la taille et la granularité, et permet une isolation spécifique à la cellule basée sur l’utilisation d’anticorps dirigés contre les marqueurs de surface cellulaire. Chez les souris adultes, les MuSC expriment la molécule d’adhésion cellulaire vasculaire 1 (VCAM-1, également connue sous le nom de CD106)14,15 et α7-Integrin 15, tandis que les FAP expriment le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes α (PDGFRα) et l’antigène des cellules souches 1 (Sca1 ou Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . Dans le protocole décrit ici, les MuSC ont été identifiés comme CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, tandis que les FAP ont été identifiés comme CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Alternativement, des souris PDGFRαEGFP ont été utilisées pour isoler les FAP en tant qu’événements CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-18,19. De plus, nous avons comparé le chevauchement entre le signal fluorescent des cellules PDGFRα-GFP+ et les cellules identifiées par le marqueur de surface Sca1. Notre analyse a montré que toutes les cellules exprimant la GFP étaient également positives pour Sca1, ce qui indique que l’une ou l’autre approche peut être utilisée pour l’identification et l’isolement des FAP. Enfin, la coloration avec des anticorps marqueurs spécifiques a confirmé la pureté de chaque population cellulaire.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G BD Needle 1 in. single use, sterile</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b)</td>
			<td>The University of British Columbia</td>
			<td>53-0010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD31 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSMelody Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD106 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J&#160; mouse (Female and Male)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>007669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution (1 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 40 &#181;m Cell Strainer, Blue, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Collagenase, Type II, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Dispase, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DMEM, high glucose, HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12430054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Horse Serum, New Zealand origin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse PDGF&#160;R alpha Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9624464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NCC0528893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)</td>
			<td>Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 Streptavidin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle

Les cellules progénitrices fibro-adipogènes (FAP) sont une population de cellules stromales mésenchymateuses (CSM) résidentes du muscle squelettique capables de se différencier selon une lignée fibrogénique, adipogénique, ostéogénique ou chondromogène. Avec les cellules souches musculaires (MuSC), les FAP jouent un rôle essentiel dans l’homéostasie, la réparation et la régénération musculaires, tout en maintenant et en remodelant activement la matrice extracellulaire (ECM). Dans des conditions pathologiques, telles que les dommages chroniques et les dystrophies musculaires, les FAP subissent une activation aberrante et se différencient en fibroblastes et adipocytes producteurs de collagène, entraînant une fibrose et une infiltration graisseuse intramusculaire. Ainsi, les FAP jouent un double rôle dans la régénération musculaire, soit en maintenant le renouvellement du MuSC et en favorisant la réparation des tissus, soit en contribuant à la formation de cicatrices fibrotiques et d’infiltrats de graisse ectopique, qui compromettent l’intégrité et la fonction du tissu musculaire squelettique. Une purification adéquate des FAP et des MuSC est une condition préalable à la compréhension du rôle biologique de ces cellules dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ici, nous décrivons une méthode standardisée pour l’isolement simultané des FAP et des MuSC des muscles des membres de souris adultes en utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Le protocole décrit en détail la dissociation mécanique et enzymatique des cellules mononucléées des muscles entiers des membres et des muscles tibiaux antérieurs (TA) blessés. Les FAP et les MuSC sont ensuite isolés à l’aide d’un trieur de cellules semi-automatisé pour obtenir des populations de cellules pures. Nous décrivons en outre une méthode optimisée pour la culture de FAP et de MuSC quiescents et activés, seuls ou dans des conditions de coculture.

Ce protocole permet d’isoler environ un million de PAF et jusqu’à 350 000 MuSC à partir de membres postérieurs non blessés de souris adultes de type sauvage (3 à 6 mois), ce qui correspond à un rendement de 8 % pour les PAF et de 3 % pour les MuSC d’événements totaux. Lors du tri des cellules de TA endommagées 7 jours après la blessure, deux à trois muscles TA sont mis en commun pour obtenir jusqu’à 300 000 FAP et 120 000 MuSC, ce qui correspond à un rendement de 11% et 4%, respectivement. Les valeur...

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FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle

L’identification précise des cellules progénitrices fibro-adipogènes (PAF) et des cellules souches musculaires (MuSC) est essentielle pour étudier leur fonction biologique dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ce protocole fournit des lignes directrices pour l’isolement, la purification et la culture des PAF et des MuSC à partir de muscles de souris adultes.

FACS-isolement et culture de progéniteurs fibro-adipogènes et de cellules souches musculaires à partir de muscles squelettiques de souris non perturbés et blessés

Fibro-adipogenic progenitor cells (FAPs) are a population of skeletal muscle-resident mesenchymal stromal cells (MSCs) capable of differentiating along ...

Ce protocole décrit une méthode pour l’isolement simultané de cellules fibro-adipogènes, progénitrices et souches musculaires à l’aide d’activateurs de fluorescence de tri. Les populations pures de ces cellules sont une condition préalable à la compréhension de leur rôle biologique dans des conditions physiologiques et pathologiques. En utilisant cette technique, Forbes et les cellules souches musculaires ont été identifiées et isolées de l’aisselle ou du muscle blessé.L’impunité élevée de Forbes et des cellules souches musculaires nous a permis d’utiliser ces cellules pour différentes techniques en aval telles que la greffe de saccharine et l’analyse du mélange mudial. Pour commencer, placez la souris euthanasiée sur le dos sur un tampon de dissection et vaporisez-la avec de l’éthanol à 70% Pour éviter la contamination, utilisez des pinces pour pincer le centre de la peau du ventre de la souris et couper environ un centimètre d’ouverture horizontalement. Saisissez les bords de la plaie et le disque dans la souris en tirant l’ouverture dans les directions opposées pour découvrir les muscles en dessous, exposer un côté du membre postérieur à la fois.Avant de collecter des muscles, enlever la graisse intermusculaire entre les ischio-jambiers à l’extrémité proximale des quadriceps pour améliorer l’isolement des cellules progénitrices fibro adipogènes et des cellules souches musculaires. Ensuite, sans endommager le tissu, utilisez des pinces tranchantes pour casser et décoller le fascia afin d’exposer le tibial antérieur ou TA et extenseur digitorum longus ou EDL muscles. Passez l’extrémité pointue de la pince sous les muscles TA EDL pour détacher les muscles du tibia.Coupez les tendons, attachez le TA EDL à la cheville et, tout en le tenant avec une pince, coupez les muscles avec des ciseaux le long de la ligne longitudinale du TA EDL. Coupez les tendons autour du genou pour détacher tous les muscles TA EDL. Placez les muscles dans un plat de six centimètres maintenu sur de la glace.Pour isoler les muscles gastrocnémiens, coupez tous les tendons de la cheville et détachez les muscles du tibia et du péroné. Couper autour du genou et transférer les muscles dans le plat. Décollez le fascia autour du quadriceps et séparez-le du fémur en passant l’extrémité pointue de la pince entre le muscle et l’os.Coupez les tendons autour du genou et coupez le reste du muscle en coupant le long du fémur tout en tenant les quadriceps avec une pince à l’extrémité distale. Placez les muscles dans le plat de six centimètres. Détachez les ischio-jambiers et les muscles restants autour du fémur et transférez-les dans le plat.Rassemblez les muscles des membres postérieurs dans un plat conservé sur de la glace. Aspirer le produit de lavage du plat et ajouter un à deux millilitres de tampon de dissociation musculaire pour garder les muscles humides. Ensuite, émincez soigneusement les muscles Utilisez un scalpel pour déchirer et trancher le muscle, puis utilisez des ciseaux pour continuer à couper le muscle en petits morceaux pendant une à deux minutes jusqu’à obtenir une pâte de boue de tissu bien haché.Transférez ensuite les muscles émincés dans le tube conique contenant le tampon de dissociation musculaire. Scellez les tubes avec un film de laboratoire et incuber dans un bain-marie de 37 degrés Celsius en agitant pendant une heure. Après une heure, retirez le tube du shaker et remplissez-le à 50 millilitres Avec un produit de lavage, retournez doucement le tube deux fois pour assurer le mélange.Centrifuger les cellules dans un rotor à godet oscillant à 250 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Transférez 42 millilitres de surnageant dans deux nouveaux tubes et laissez huit millilitres dans le tube d’origine. Remplissez les nouveaux tubes contenant 21 millilitres du surnageant jusqu’à 50 millilitres avec un produit de lavage.Ensuite, centrifugez les cellules à 350 fois G pendant huit minutes à quatre degrés Celsius. Aspirez le surnageant et gardez les granulés sur la glace. Ensuite, ajoutez un millilitre de collagénases, deux bouillons et un millilitre de stock à base de dis dans le tube d’origine contenant huit millilitres de tampon de dissociation musculaire.À l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres, remettez la pastille en suspension 10 fois sans colmatage. Éjectez la solution vers la paroi du tube, en évitant la formation de bulles. Scellez les tubes avec un film de laboratoire et incuber dans un bain-marie de 37 degrés Celsius en agitant pendant 30 minutes.Après 30 minutes, retirez le tube de l’aspiration de l’agitateur et éjectez la suspension musculaire 10 fois à travers une seringue de 10 millilitres avec une aiguille de calibre 20, remplissez chaque tube jusqu’à 50 millilitres avec du produit de lavage et inversez le tube. Ensuite, centrifuger à 250 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et transférer le surnageant dans un nouveau tube. Laissant huit millilitres dans le tube d’origine.Remplissez le nouveau tube jusqu’à 50 millilitres avec du produit de lavage, centrifugez à nouveau les cellules à 350 fois G pendant huit minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant et gardez le granulé sur de la glace. Placez une crépine à cellules en nylon de 40 microns dans le tube conique original de 50 millilitres contenant huit millilitres de produit de lavage et prémouillez la crépine avec un à deux millilitres de produit de lavage.Tout en tenant la passoire, utilisez une pipette de 10 millilitres pour remettre délicatement la pastille en suspension. Filtrez la suspension à travers la crépine cellulaire dans le même tube pour minimiser la perte de cellule. Filtrer les autres granulés du tube dans le tube d’origine en ajoutant quatre à cinq millilitres de produit de lavage à chaque tube pour remettre les granulés en suspension et transférer la solution dans la crépine automatique positionnée dans le tube d’origine.Après avoir recueilli toutes les granulés dans le tube de 50 millilitres d’origine, rincez la crépine avec quatre à cinq millilitres de liquide de lavage. Utilisez une pipette de 1000 microlitres pour recueillir tout le liquide de la face inférieure de la crépine automatique. Remplissez chaque tube avec un produit de lavage jusqu’à 50 millilitres et inversez le tube.Centrifuger le tube à 250 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retirez immédiatement le surnageant sans déranger le granulé et remettez le granulé en suspension dans 600 microlitres de produit de lavage. Transférer la suspension dans un tube microcentrifuge de deux millilitres.Ajouter des anticorps CD 31 APC CD 45 APC SCA un VCAM bleu Pacifique une biotine et alpha sept intégrine PE dans un tube de deux millimètres contenant une suspension cellulaire. Mélangez délicatement et incuber les cellules dans un agitateur rotatif à quatre degrés Celsius pendant 45 minutes en les protégeant de la lumière. Après l’incubation, remplir tous les tubes jusqu’à deux millilitres avec du produit de lavage et centrifuger à 250 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 300 microlitres de produit de lavage. Ensuite, ajoutez des anticorps contre la streptavidine dans des tubes et incuber les cellules dans un agitateur rotatif à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Après incubation, remplir les tubes contenant des anticorps anti-streptavidine à deux millilitres avec un produit de lavage.Ensuite, centrifuger les tubes et aspirer complètement le surnageant. Après le deuxième lavage, remettez les cellules en suspension dans le tube expérimental dans 500 microlitres de produit de lavage. Pré-mouiller un capuchon de crépine cellulaire d’un tube à fond rond en polystyrène de cinq millilitres avec 200 microlitres de produit de lavage.Transférez la suspension cellulaire du tube expérimental dans le tube inférieur rond en polystyrène de cinq millilitres et laissez-la filtrer par gravité. Imprimez le tube de deux millilitres contenant la suspension expérimentale de l’échantillon avec 300 microlitres de produit de lavage et passez-le à travers le même bouchon de crépine. Utilisez une pipette de 200 microlitres pour recueillir tout le liquide de la face inférieure de la crépine cellulaire.Scellez avec un bouchon, laissez les tubes sur la glace et protégez-les de la lumière. La stratégie de gating adoptée pour l’isolement des cellules souches fibro-adipogéniques et musculaires est présentée ici. Le knock GFR alpha E G F P chez les souris rapporteures exprime le gène de fusion H deux B E G F P du locus alpha endogène G FFR, permettant un marquage efficace et spécifique de la lignée G GFR alpha.La pureté des populations cellulaires isolées a été confirmée par immuno-coloration de cellules fibro-adipogéniques GFP positives en co-culture et de cellules souches musculaires avec des anticorps PAC-sept. Le progéniteur fibro adipogène GFP positif n’a pas exprimé le marqueur PAC-sept, tandis que les cellules souches musculaires ont réagi avec cet anticorps. Toutes les cellules exprimant la GFP étaient positives pour le SCA un et négatives pour la CD 31, la CD 45 VCAM un et l’alpha sept intégrine.Le progéniteur fibro adipogénique et les cellules souches musculaires isolées de souris blessées par des injections intramusculaires sans toxine sept jours après la blessure sont montrés. Comme les cellules souches musculaires sont activées une augmentation de la taille cellulaire. Il est important d’ajuster les paramètres F SCA et SS CA et d’élargir la porte pour inclure ces cellules au centre.La quantification des cellules souches progénitrices fibro-adipogéniques et musculaires dans les muscles TA non blessés et sept jours après la blessure est présentée ici. Bien que le pic et la prolifération aient été observés entre les deuxième et troisième jours, un faible taux de prolifération des cellules était encore appréciable sept jours après la blessure. Effectuer un hachage musculaire approprié est d’une importance cruciale pour libérer une seule cellule.De plus, l’isolement des cellules mononucléotidiques est obtenu en faisant passer la suspension sur une seringue de 10 millilitres avec une aiguille de calibre 20. Cette technique aidera les scientifiques à étudier le profil transcriptionnel et épigénomique biologique de Forbes et des cellules souches musculaires en condition normale et pendant les stades plus profonds de la régénération musculaire.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolement et quantitative immunocytochimique caractérisation des cellules myogéniques primaires et fibroblastes de muscle squelettique humain

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Recherche

Biologie du développement

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Culture ex vivo des pharyngée Arches pour étudier cardiaques et musculaires progéniteurs et leur niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Utilisation de mitochondries isolées à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour microplaques à haut débit respiratoire mesurée

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Induction de aiguë Skeletal Muscle Régénération par cardiotoxine Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Préparation et culture de cellules Myogenic Précurseurs / myoblastes primaires de muscle squelettique des adultes et les humains âgés

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Évaluation des lésions induites par la sénescence et In Vivo reprogrammation dans le Muscle squelettique

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolement, Culture et différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse et les ostéoclastes progéniteurs de souris

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Application d’une Stimulation chronique pour étudier les Rat d’induite par l’activité Contractile du Muscle squelettique phénotypique Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identification des cellules satellites musculaires squelettiques par Immunofluorescence avec des anticorps de laminine et Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...