Name: facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-06-08T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

Wir danken Tom Cheung (The Hong Kong University of Science & Technology) für die Beratung zur MuSC-Isolation. Diese Arbeit wurde vom NIAMS-IRP durch die NIH-Zuschüsse AR041126 und AR041164 finanziert.

Alle durchgeführten Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den vom Animal Care and Use Committee (ACUC) des National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases (NIAMS) genehmigten institutionellen Richtlinien durchgeführt. Prüfer, die dieses Protokoll durchführen, müssen sich an ihre lokalen Tierethikrichtlinien halten.
HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie FAPs und MuSCs aus Hintergliedmaßen und verletzten Tibialis anterior (TA) Muskeln von erwachsen...

<ol>
	<li>Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+as+a+&amp;#34;mediator&amp;#34;+of+systemic+metabolism.">Muscle as a &amp;#34;mediator&amp;#34; of systemic metabolism.</a> Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).</li><li>Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+and+skeletal+muscle+regeneration.">Satellite cells and skeletal muscle regeneration.</a> Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).</li><li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells.">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).</li><li>Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+satellite+cell+contribution+to+uninjured+adult+muscle+fibers.">Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers.</a> Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).</li><li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+injury+activates+resident+fibro/adipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis.">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle.">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li><li>Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+roles+of+muscle-resident+fibro-adipogenic+progenitors+in+health,+regeneration,+neuromuscular+disorders,+and+aging.">Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging.</a> Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).</li><li>Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle.">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+progenitors+resident+in+the+skeletal+muscle+interstitium+exhibit+robust+BMP-dependent+osteogenic+activity+and+mediate+heterotopic+ossification.">Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).</li><li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+tissue-resident+PDGFR&#945;++fibro-adipogenic+progenitors+spontaneously+acquire+osteogenic+phenotype+in+an+altered+inflammatory+environment.">Murine tissue-resident PDGFR&#945;+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).</li><li>Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-adipogenic+progenitors+cross-talk+in+skeletal+muscle:+The+social+network.">Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).</li><li>Lemos, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nilotinib+reduces+muscle+fibrosis+in+chronic+muscle+injury+by+promoting+TNF-mediated+apoptosis+of+fibro/adipogenic+progenitors.">Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors.</a> Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).</li><li>Malecova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cellular+states+of+fibro-adipogenic+progenitors+during+myogenesis+and+muscular+dystrophy.">Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 9, 3670 (2018).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).</li><li>Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs):+Isolation+by+FACS+and+culture.">Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture.</a> Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).</li><li>Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+differentiation+of+fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs)+from+skeletal+muscle.">Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).</li><li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms.">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li><li>Contreras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+TGF-&#946;+and+PDGFR&#945;+signaling+pathways+regulates+the+fate+of+stromal+fibro-adipogenic+progenitors.">Cross-talk between TGF-&#946; and PDGFR&#945; signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors.</a> Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).</li><li>Holmes, C., Stanford, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Stem+cell+antigen-1:+Expression,+function,+and+enigma.">Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma.</a> Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).</li><li>Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HGFA+Is+an+injury-regulated+systemic+factor+that+induces+the+transition+of+stem+cells+into+GAlert.">HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert.</a> Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).</li><li>Garc&#237;a-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+maintains+a+genuine+muscle+stem-cell+quiescent+state+until+geriatric+age.">FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).</li><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterioration+and+variability+of+highly+purified+collagenase+blends+used+in+clinical+islet+isolation.">Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation.</a> Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).</li><li>Walls, P. L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+potential+for+bursting+bubbles+to+damage+suspended+cells.">Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li><li>Kafadar, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sca-1+expression+is+required+for+efficient+remodeling+of+the+extracellular+matrix+during+skeletal+muscle+regeneration.">Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration.</a> Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).</li></ol>

Die Etablierung effizienter und reproduzierbarer Protokolle für die Identifizierung und Isolierung von reinen adulten Stammzellpopulationen ist der erste und kritischste Schritt zum Verständnis ihrer Funktion. Isolierte FAPs und MuSCs können zur Durchführung von Multiomics-Analysen in Transplantationsexperimenten als potenzielle Behandlung von Muskelerkrankungen verwendet oder für die Krankheitsmodellierung in der Stammzelltherapie genetisch modifiziert werden. 
Das hier beschriebene Prot...

Der Skelettmuskel ist das größte Gewebe im Körper, macht ~ 40% des erwachsenen menschlichen Gewichts aus und ist verantwortlich für die Aufrechterhaltung der Körperhaltung, die Erzeugung von Bewegung, die Regulierung des Grundenergiestoffwechsels und der Körpertemperatur1. Die Skelettmuskulatur ist ein hochdynamisches Gewebe und besitzt eine bemerkenswerte Fähigkeit, sich an eine Vielzahl von Reizen wie mechanische Belastungen, metabolische Veränderungen und tägliche Umweltfaktoren anzupassen. Darüber hinaus regeneriert sich die Skelettmuskulatur als Reaktion auf akute Verletzungen, was zu einer vollständigen Wiederherstellung ihrer Morphologie und Funktionen führt2. Die Plastizität der Skelettmuskulatur beruht hauptsächlich auf einer Population residenter Muskelstammzellen (MuSCs), auch Satellitenzellen genannt, die sich zwischen der Myofaser-Plasmamembran und der Basallamina 2,3 befinden. Unter normalen Bedingungen befinden sich MuSCs in der Muskelnische in einem Ruhezustand, mit nur wenigen Teilungen, um den Zellumsatz zu kompensieren und den Stammzellpool wieder aufzufüllen4. Als Reaktion auf Verletzungen treten MuSCs in den Zellzyklus ein, vermehren sich und tragen entweder zur Bildung neuer Muskelfasern bei oder kehren in einem Selbsterneuerungsprozess in die Nische zurück 2,3. Zusätzlich zu MuSCs hängt die homöostatische Aufrechterhaltung und Regeneration der Skelettmuskulatur von der Unterstützung einer Population muskelresidenter Zellen ab, die als fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) bezeichnet werden5,6,7. FAPs sind mesenchymale Stromazellen, die in das Muskelbindegewebe eingebettet sind und in der Lage sind, sich entlang der fibrogenen, adipogenen, osteogenen oder chondrogenen Linie 5,8,9,10 zu differenzieren. FAPs bieten strukturelle Unterstützung für MuSCs, da sie eine Quelle für extrazelluläre Matrixproteine in der Muskelstammzellnische sind. FAPs fördern auch die langfristige Erhaltung der Skelettmuskulatur, indem sie Zytokine und Wachstumsfaktoren sezernieren, die trophische Unterstützung für Myogenese und Muskelwachstum bieten 6,11. Bei akuten Muskelverletzungen vermehren sich FAPs schnell, um eine vorübergehende Nische zu erzeugen, die die strukturelle Integrität des regenerierenden Muskels unterstützt und eine günstige Umgebung bietet, um die Proliferation und Differenzierung von MuSCs auf parakrine Weise aufrechtzuerhalten5. Mit fortschreitender Regeneration werden FAPs durch Apoptose aus dem regenerativen Muskel entfernt und ihre Anzahl kehrt allmählich auf das Basalniveau12 zurück. Unter Bedingungen, die chronische Muskelverletzungen begünstigen, überschreiben FAPs jedoch die pro-apoptotische Signalisierung und sammeln sich in der Muskelnische an, wo sie sich in kollagenproduzierende Fibroblasten und Adipozyten differenzieren, was zu ektopischen Fettinfiltraten und fibrotischer Narbenbildung führt12,13.
Aufgrund ihrer Multipotenz und ihrer regenerativen Fähigkeiten wurden FAPs und MuSCs als potenzielle Ziele in der regenerativen Medizin zur Behandlung von Skelettmuskelerkrankungen identifiziert. Um ihre Funktion und ihr therapeutisches Potenzial zu untersuchen, ist es daher wichtig, effiziente und reproduzierbare Protokolle für die Isolierung und Kultur von FAPs und MuSCs zu erstellen.
Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) kann verschiedene Zellpopulationen anhand morphologischer Merkmale wie Größe und Granularität identifizieren und ermöglicht eine zellspezifische Isolierung basierend auf der Verwendung von Antikörpern, die gegen Zelloberflächenmarker gerichtet sind. Bei erwachsenen Mäusen exprimieren MuSCs das vaskuläre Zelladhäsionsmolekül 1 (VCAM-1, auch bekannt als CD106)14,15 und α7-Integrin15, während FAPs den von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktorrezeptor α (PDGFRα) und das Stammzellantigen 1 (Sca1 oder Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 exprimieren. . In dem hier beschriebenen Protokoll wurden MuSCs als CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ identifiziert, während FAPs als CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin- identifiziert wurden. Alternativ wurden PDGFRαEGFP-Mäuse verwendet, um FAPs als CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- Ereignisse18,19 zu isolieren. Darüber hinaus verglichen wir die Überlappung zwischen dem Fluoreszenzsignal von PDGFRα-GFP+-Zellen mit Zellen, die durch den Oberflächenmarker Sca1 identifiziert wurden. Unsere Analyse zeigte, dass alle GFP-exprimierenden Zellen auch positiv für Sca1 waren, was darauf hindeutet, dass beide Ansätze für die Identifizierung und Isolierung von FAPs verwendet werden können. Schließlich bestätigte die Färbung mit spezifischen Markerantikörpern die Reinheit jeder Zellpopulation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G BD Needle 1 in. single use, sterile</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b)</td>
			<td>The University of British Columbia</td>
			<td>53-0010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD31 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSMelody Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD106 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J&#160; mouse (Female and Male)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>007669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution (1 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 40 &#181;m Cell Strainer, Blue, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Collagenase, Type II, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Dispase, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DMEM, high glucose, HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12430054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Horse Serum, New Zealand origin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse PDGF&#160;R alpha Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9624464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NCC0528893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)</td>
			<td>Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 Streptavidin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle

Fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) sind eine Population von skelettmuskelresidenten mesenchymalen Stromazellen (MSCs), die sich entlang fibrogener, adipogener, osteogener oder chondrogener Linie differenzieren können. Zusammen mit Muskelstammzellen (MuSCs) spielen FAPs eine entscheidende Rolle bei der Muskelhomöostase, -reparatur und -regeneration, während sie die extrazelluläre Matrix (ECM) aktiv erhalten und umgestalten. Bei pathologischen Zuständen wie chronischen Schäden und Muskeldystrophien werden FAPs anomal aktiviert und differenzieren sich in kollagenproduzierende Fibroblasten und Adipozyten, was zu Fibrose und intramuskulärer Fettinfiltration führt. Daher spielen FAPs eine doppelte Rolle bei der Muskelregeneration, indem sie entweder den MuSC-Umsatz aufrechterhalten und die Gewebereparatur fördern oder zur fibrotischen Narbenbildung und ektopischen Fettinfiltraten beitragen, die die Integrität und Funktion des Skelettmuskelgewebes beeinträchtigen. Eine ordnungsgemäße Reinigung von FAPs und MuSCs ist eine Voraussetzung für das Verständnis der biologischen Rolle dieser Zellen sowohl bei physiologischen als auch bei pathologischen Zuständen. Hier beschreiben wir eine standardisierte Methode zur gleichzeitigen Isolierung von FAPs und MuSCs aus der Extremitätenmuskulatur erwachsener Mäuse mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS). Das Protokoll beschreibt detailliert die mechanische und enzymatische Dissoziation von einkernigen Zellen aus ganzen Extremitätenmuskeln und verletzten Tibialis anterior (TA) Muskeln. FAPs und MuSCs werden anschließend mit einem halbautomatischen Zellsortierer isoliert, um reine Zellpopulationen zu erhalten. Darüber hinaus beschreiben wir eine optimierte Methode zur Kultivierung ruhender und aktivierter FAPs und MuSCs, entweder allein oder unter Kokulturbedingungen.

Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung von etwa einer Million FAPs und bis zu 350.000 MuSCs aus unverletzten Hinterbeinen erwachsener Wildtyp-Mäuse (3-6 Monate), was einer Ausbeute von 8% für FAPs und 3% für MuSCs von Gesamtereignissen entspricht. Bei der Sortierung von Zellen aus beschädigter TA 7 Tage nach der Verletzung werden zwei bis drei TA-Muskeln gepoolt, um bis zu 300.000 FAPs und 120.000 MuSCs zu erhalten, was einer Ausbeute von 11% bzw. 4% entspricht. Die Reinheitswerte nach der Sortierung liegen bei ...

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FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle

Die genaue Identifizierung von fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) und Muskelstammzellen (MuSCs) ist entscheidend für die Untersuchung ihrer biologischen Funktion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Dieses Protokoll enthält Richtlinien für die Isolierung, Reinigung und Kultur von FAPs und MuSCs aus erwachsenen Mausmuskeln.

FACS-Isolierung und Kultur von fibro-adipogene Vorläuferzellen und Muskelstammzellen aus ungestörten und verletzten Maus-Skelettmuskeln

Fibro-adipogenic progenitor cells (FAPs) are a population of skeletal muscle-resident mesenchymal stromal cells (MSCs) capable of differentiating along ...

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur gleichzeitigen Isolierung von fibroadipogenen, Vorläuferzellen und Muskelstammzellen unter Verwendung von Fluoreszenzaktivatoren der Sortierung. Reine Populationen dieser Zellen sind eine Voraussetzung für das Verständnis ihrer biologischen Rolle unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Mit dieser Technik wurden Forbes und Muskelstammzellen identifiziert und entweder aus Achselhöhlen oder verletzten Muskeln isoliert.Die hohe gefüllte Straflosigkeit von Forbes- und Muskelstammzellen hat es uns ermöglicht, diese Zellen für verschiedene nachgeschaltete Techniken wie Saccharintransplantation und Mudial-Mix-Analyse zu verwenden. Um zu beginnen, legen Sie die euthanasierte Maus-Rückenlage auf ein Sezierkissen und besprühen Sie sie mit 70% Ethanol Um eine Kontamination zu vermeiden, verwenden Sie eine Pinzette, um die Mitte der Bauchhaut der Maus zu kneifen und schneiden Sie etwa einen Zentimeter Öffnung horizontal. Greifen Sie die Wundränder und die Scheibe in der Maus, indem Sie die Öffnung in die entgegengesetzte Richtung ziehen, um die darunter liegenden Muskeln freizulegen, und legen Sie eine Seite der Hinterbeine frei.Bevor Sie Muskeln sammeln, entfernen Sie intermuskuläres Fett zwischen den Oberschenkeln am proximalen Ende des Quadrizeps, um die Isolierung von fibroadipogenen Vorläuferzellen und Muskelstammzellen zu verbessern. Als nächstes, ohne das Gewebe zu beschädigen, verwenden Sie scharfe Pinzetten, um die Faszie zu brechen und abzulösen, um die Muskeln unter Tibialis anterior oder TA und Extensor digitorum longus oder EDL freizulegen. Führen Sie die scharfe Spitze der Pinzette unter die TA EDL-Muskeln, um die Muskeln von der Tibia zu lösen.Schneiden Sie die Sehnen ab, befestigen Sie die TA EDL am Knöchel und während Sie sie mit einer Pinzette halten, trimmen Sie die Muskeln mit einer Schere entlang der Längslinie der TA EDL. Schneiden Sie die Sehnen um das Knie, um die gesamten TA EDL-Muskeln zu lösen. Legen Sie die Muskeln in eine sechs Zentimeter große Schale, die auf Eis gehalten wird.Um die Gastrocnemius-Muskeln zu isolieren, schneiden Sie alle Sehnen am Knöchel und lösen Sie die Muskeln von Tibia und Fibula. Schneiden Sie um das Knie und übertragen Sie die Muskeln auf die Schale. Ziehen Sie die Faszie um den Quadrizeps ab und trennen Sie sie vom Femur, indem Sie die scharfe Spitze der Pinzette zwischen Muskel und Knochen führen.Schneiden Sie die Sehnen um das Knie und trimmen Sie den Rest des Muskels, indem Sie entlang des Femurs schneiden, während Sie den Quadrizeps mit einer Pinzette am distalen Ende halten. Legen Sie die Muskeln in die sechs Zentimeter große Schale. Lösen Sie die Oberschenkelmuskulatur und die verbleibenden Muskeln um den Femur herum und übertragen Sie diese auf die Schale.Sammeln Sie die Muskeln der Hinterbeine in einer auf Eis gehaltenen Schale. Waschmedium aus der Schale aspirieren und ein bis zwei Milliliter Muskeldissoziationspuffer hinzufügen, um die Muskeln feucht zu halten. Als nächstes hacken Sie die Muskeln gründlich Verwenden Sie ein Skalpell, um den Muskel zu reißen und zu schneiden, und schneiden Sie dann mit einer Schere den Muskel ein bis zwei Minuten lang in kleine Stücke, bis Sie eine Güllepaste aus gut gehacktem Gewebe erhalten.Dann übertragen Sie die gehackten Muskeln in die konische Röhre, die Muskeldissoziationspuffer enthält. Verschließen Sie die Röhrchen mit Laborfolie und inkubieren Sie sie eine Stunde lang in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad mit Rührwerk. Nach einer Stunde die Tube aus dem Shaker nehmen und auf 50 Milliliter füllen Mit Waschmedium zweimal vorsichtig umdrehen, um das Mischen zu gewährleisten.Zentrifugieren Sie die Zellen in einem schwingenden Eimerrotor bei 250 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. 42 Milliliter Überstand in zwei neue Röhrchen überführen und acht Milliliter in der ursprünglichen Röhre belassen. Füllen Sie die neuen Röhrchen mit 21 Milliliter des Überstands bis zu 50 Milliliter mit Waschmedium.Dann zentrifugieren Sie die Zellen bei 350 mal G für acht Minuten bei vier Grad Celsius. Saugen Sie den Überstand ab und halten Sie die Pellets auf Eis. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter Kollagenasen zwei Stamm und einen Milliliter Dis-basierten Bestand in die ursprüngliche Röhre mit acht Milliliter Muskeldissoziationspuffer hinzu.Mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette das Pellet 10 Mal resuspendieren, ohne zu verstopfen. Werfen Sie die Lösung in Richtung der Rohrwand aus und vermeiden Sie die Bildungsblasen. Die Röhrchen mit Laborfolie verschließen und in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad mit Rühren für 30 Minuten inkubieren.Nach 30 Minuten den Schlauch aus dem Shaker-Aspirat entfernen und die Muskelsuspension 10 Mal durch eine 10-Milliliter-Spritze mit einer 20-Gauge-Nadel auswerfen, jedes Röhrchen bis zu 50 Milliliter mit Waschmedium füllen und das Röhrchen umkehren. Dann bei 250 mal G fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand in ein neues Röhrchen überführen. Acht Milliliter in der Originalröhre.Füllen Sie das neue Röhrchen bis zu 50 Milliliter mit Waschmedium, zentrifugieren Sie die Zellen erneut bei 350 mal G für acht Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und halten Sie das Pellet auf Eis. Legen Sie ein 40-Mikron-Nylonzellensieb in das originale 50-Milliliter-Konikusröhrchen mit acht Milliliter Waschmedium und befeuchten Sie das Sieb mit ein bis zwei Milliliter Waschmedium.Während Sie das Sieb halten, verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um das Pellet vorsichtig zu resuspendieren. Filtern Sie die Suspension durch das Zellsieb zurück in dasselbe Röhrchen, um den Zellverlust zu minimieren. Filtern Sie die anderen Rohrpellets zurück in das Originalrohr, indem Sie jedem Röhrchen vier bis fünf Milliliter Waschmedium hinzufügen, um die Pellets zu resuspendieren und die Lösung in das im Originalrohr positionierte Selbstsieb zu überführen.Nachdem Sie alle Pellets in das originale 50-Milliliter-Röhrchen gesammelt haben, spülen Sie das Sieb mit weiteren vier bis fünf Milliliter Waschmedium aus. Verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipette, um die gesamte Flüssigkeit von der Unterseite des Selbstsiebs zu sammeln. Füllen Sie jedes Röhrchen mit Waschmedium bis zu 50 Milliliter und drehen Sie das Röhrchen um.Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 250 mal G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand sofort, ohne das Pellet zu stören, und resuspendieren Sie das Pellet in 600 Mikroliter Waschmedium. Die Suspension wird in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.Antikörper CD 31 APC CD 45 APC SCA ein Pacific Blue VCAM ein Biotin und alpha sieben Integrin PE in ein zwei Millimeter Röhrchen mit Zellsuspension geben. Mischen und inkubieren Sie die Zellen vorsichtig in einem rotierenden Shaker bei vier Grad Celsius für 45 Minuten, um sie vor Licht zu schützen. Nach der Inkubation alle Röhrchen bis zu zwei Milliliter mit Waschmedium füllen und bei 250 mal G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugieren.Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 300 Mikrolitern Waschmedium. Als nächstes fügen Sie Streptavidin-Antikörper in Röhrchen hinzu und inkubieren die Zellen in einem rotierenden Shaker bei vier Grad Celsius für 20 Minuten. Nach der Inkubation Röhrchen mit Streptavidin-Antikörpern auf zwei Milliliter mit Waschmedium füllen.Dann zentrifugieren Sie die Röhrchen und saugen Sie den Überstand vollständig ab. Nach dem zweiten Waschen die Zellen im Versuchsröhrchen in 500 Mikroliter Waschmedium resuspendieren. Vorbefeuchten Sie eine Zellsiebkappe aus einem Fünf-Milliliter-Polystyrol-Rundrohr mit 200 Mikrolitern Waschmedium.Die Zellsuspension aus dem Versuchsröhrchen in das Fünf-Milliliter-Polystyrol-Rundbodenrohr überführen und durch Schwerkraft filtern lassen. Drucken Sie das Zwei-Milliliter-Röhrchen mit der experimentellen Probensuspension mit 300 Mikrolitern Waschmedium aus und führen Sie es durch dieselbe Siebkappe. Verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um die gesamte Flüssigkeit von der Unterseite des Zellsiebs zu sammeln.Verschließen Sie mit einer Kappe, lassen Sie die Schläuche auf Eis und schützen Sie sie vor Licht. Die Gating-Strategie für die Isolierung von fibroadipogenen Vorläufer- und Muskelstammzellen wird hier gezeigt. Das PD GFR alpha E G F P Knock in Reportermäusen exprimiert das H two B E G F P Fusionsgen aus dem endogenen PD G FFR Alpha-Locus, was eine effiziente und spezifische Markierung der PD G GFR alpha-Linie ermöglicht.Die Reinheit der isolierten Zellpopulationen wurde durch Immunfärbung von GFP-positiven fibroadipogenen Vorläuferzellen und Muskelstammzellen mit PAC-seven-Antikörpern bestätigt. GFP-positiver fibroadipogener Vorläufer exprimierte den PAC-Seven-Marker nicht, während Muskelstammzellen mit diesem Antikörper reagierten. Alle GFP-exprimierenden Zellen waren positiv für SCA one und negativ für CD 31, CD 45 VCAM one und alpha seven Integrin.Der fibroadipogene Vorläufer und die Muskelstammzellen, die von Mäusen isoliert wurden, die sieben Tage nach der Verletzung mit intramuskulären Injektionen von keinem Toxin verletzt wurden, werden gezeigt. Wenn Muskelstammzellen aktiviert werden, wird eine Zunahme der Zellgröße aktiviert. Es ist wichtig, die Parameter F SCA und SS CA anzupassen und das Gate zu erweitern, um diese Zellen in der Mitte einzubeziehen.Die Quantifizierung von fibroadipogenen Vorläufer- und Muskelstammzellen in unverletzten und sieben Tage nach der Verletzung von TA-Muskeln wird hier gezeigt. Obwohl der Höhepunkt und die Proliferation zwischen den Tagen zwei und drei beobachtet wurden, war eine geringe Rate proliferierender Zellen sieben Tage nach der Verletzung immer noch bemerkenswert. Die Durchführung des richtigen Muskelhackens ist von entscheidender Bedeutung, um eine einzelne Zelle freizusetzen.Darüber hinaus wird die Mononukleotidzellisolierung erreicht, indem die Suspension mit einer 20-Gau-Nadel zu einer 10-Milliliter-Spritze geführt wird. Diese Technik wird Wissenschaftlern helfen, das biologische transkriptionelle und epigenomische Profil von Forbes und Muskelstammzellen unter normalem Zustand und während der tieferen Stadien der Muskelregeneration zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex-vivo-Kultur von Schlundbögen auf Herz und Muskelvorläuferzellen und ihre Nische Studieren

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Die Induktion von Akute Skelettmuskelregeneration durch Cardio Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Herstellung und Kultur von Myogenic Vorläuferzellen / Primär-Myoblasten aus Skelettmuskel von adulten und im Alter von Menschen

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Bewertung von Verletzungen-Induzierte Seneszenz und In Vivo eine Anpassung in der Skelettmuskulatur

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolation, Kultur und Differenzierung von Stromazellen Knochenmarkzellen und Osteoklasten-Vorläufer von Mäusen

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Anwendung der chronische Stimulation kontraktilen Aktivität induzierten Ratte Skelettmuskulatur phänotypische Anpassungen zu studieren

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Kennung des skelettartigen Muskels Satellitenzellen durch Immunfluoreszenz mit Pax7 und Laminin-Antikörper

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...