Name: facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-06-08T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

ברצוננו להודות לטום צ'אונג (אוניברסיטת הונג קונג למדע וטכנולוגיה) על עצות בנושא בידוד MuSC. עבודה זו מומנה על ידי NIAMS-IRP באמצעות מענקי NIH AR041126 ו- AR041164.

כל הניסויים בבעלי חיים שבוצעו נערכו בהתאם להנחיות מוסדיות שאושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים (ACUC) של המכון הלאומי לדלקת פרקים, שלד-שריר ומחלות עור (NIAMS). חוקרים המבצעים פרוטוקול זה חייבים לציית להנחיות האתיקה המקומיות שלהם לגבי בעלי חיים.
הערה: פרוטוקול זה מתאר בפיר...

<ol>
	<li>Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+as+a+&amp;#34;mediator&amp;#34;+of+systemic+metabolism.">Muscle as a &amp;#34;mediator&amp;#34; of systemic metabolism.</a> Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).</li><li>Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+and+skeletal+muscle+regeneration.">Satellite cells and skeletal muscle regeneration.</a> Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).</li><li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells.">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).</li><li>Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+satellite+cell+contribution+to+uninjured+adult+muscle+fibers.">Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers.</a> Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).</li><li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+injury+activates+resident+fibro/adipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis.">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle.">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li><li>Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+roles+of+muscle-resident+fibro-adipogenic+progenitors+in+health,+regeneration,+neuromuscular+disorders,+and+aging.">Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging.</a> Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).</li><li>Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle.">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+progenitors+resident+in+the+skeletal+muscle+interstitium+exhibit+robust+BMP-dependent+osteogenic+activity+and+mediate+heterotopic+ossification.">Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).</li><li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+tissue-resident+PDGFR&#945;++fibro-adipogenic+progenitors+spontaneously+acquire+osteogenic+phenotype+in+an+altered+inflammatory+environment.">Murine tissue-resident PDGFR&#945;+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).</li><li>Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-adipogenic+progenitors+cross-talk+in+skeletal+muscle:+The+social+network.">Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).</li><li>Lemos, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nilotinib+reduces+muscle+fibrosis+in+chronic+muscle+injury+by+promoting+TNF-mediated+apoptosis+of+fibro/adipogenic+progenitors.">Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors.</a> Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).</li><li>Malecova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cellular+states+of+fibro-adipogenic+progenitors+during+myogenesis+and+muscular+dystrophy.">Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 9, 3670 (2018).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).</li><li>Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs):+Isolation+by+FACS+and+culture.">Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture.</a> Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).</li><li>Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+differentiation+of+fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs)+from+skeletal+muscle.">Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).</li><li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms.">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li><li>Contreras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+TGF-&#946;+and+PDGFR&#945;+signaling+pathways+regulates+the+fate+of+stromal+fibro-adipogenic+progenitors.">Cross-talk between TGF-&#946; and PDGFR&#945; signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors.</a> Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).</li><li>Holmes, C., Stanford, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Stem+cell+antigen-1:+Expression,+function,+and+enigma.">Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma.</a> Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).</li><li>Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HGFA+Is+an+injury-regulated+systemic+factor+that+induces+the+transition+of+stem+cells+into+GAlert.">HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert.</a> Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).</li><li>Garc&#237;a-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+maintains+a+genuine+muscle+stem-cell+quiescent+state+until+geriatric+age.">FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).</li><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterioration+and+variability+of+highly+purified+collagenase+blends+used+in+clinical+islet+isolation.">Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation.</a> Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).</li><li>Walls, P. L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+potential+for+bursting+bubbles+to+damage+suspended+cells.">Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li><li>Kafadar, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sca-1+expression+is+required+for+efficient+remodeling+of+the+extracellular+matrix+during+skeletal+muscle+regeneration.">Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration.</a> Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).</li></ol>

קביעת פרוטוקולים יעילים וניתנים לשחזור לזיהוי ובידוד של אוכלוסיות תאי גזע בוגרים טהורים היא הצעד הראשון והקריטי ביותר לקראת הבנת תפקידם. ניתן להשתמש ב-FAPs וב-MuSCs מבודדים כדי לבצע ניתוח מולטיומיקה בניסויי השתלה כטיפול פוטנציאלי במחלות שרירים או שניתן להנדס גנטית עבור מודלים של מחלות בטיפו...

שריר השלד הוא הרקמה הגדולה ביותר בגוף, המהווה ~ 40% ממשקל האדם הבוגר, והוא אחראי על שמירה על יציבה, יצירת תנועה, ויסות חילוף החומרים של האנרגיה הבסיסית וטמפרטורת הגוף1. שרירי השלד הם רקמה דינמית מאוד ובעלת יכולת יוצאת דופן להסתגל למגוון גירויים, כגון לחץ מכני, שינויים מטבוליים וגורמים סביבתיים יומיומיים. בנוסף, שריר השלד מתחדש בתגובה לפגיעה חריפה, מה שמוביל לשיקום מלא של המורפולוגיה והתפקודים שלו2. פלסטיות שרירי השלד מסתמכת בעיקר על אוכלוסייה של תאי גזע שריריים תושבים (MuSCs), המכונים גם תאי לוויין, הממוקמים בין קרום הפלזמה של מיופייבר לבין הלמינההבסיסית 2,3. בתנאים רגילים, MuSCs שוכנים בנישת השרירים במצב שקט, עם חלוקות מעטות בלבד כדי לפצות על תחלופת התאים ולחדש את מאגר תאי הגזע4. בתגובה לפציעה, MuSCs נכנסים למחזור התא, מתרבים, ותורמים ליצירת סיבי שריר חדשים או חוזרים לנישה בתהליך התחדשות עצמית 2,3. בנוסף ל-MuSCs, תחזוקה הומאוסטטית והתחדשות של שרירי השלד מסתמכים על תמיכתה של אוכלוסייה של תאי שריר מקומיים הנקראים אבות פיברו-אדיפוגניים (FAPs)5,6,7. FAPs הם תאים סטרומליים מזנכימליים המוטבעים ברקמת החיבור לשריר ומסוגלים להתמיין לאורך שושלת פיברוגנית, אדיפוגנית, אוסטאוגנית או כונדרוגנית 5,8,9,10. FAPs מספקים תמיכה מבנית ל-MuSCs מכיוון שהם מקור לחלבוני מטריצה חוץ-תאית בנישת תאי הגזע של השריר. FAPs גם מקדמים תחזוקה ארוכת טווח של שרירי השלד על ידי הפרשת ציטוקינים וגורמי גדילה המספקים תמיכה טרופית למיוגנזה ולצמיחת שרירים 6,11. לאחר פגיעה חריפה בשריר, FAPs מתרבים במהירות כדי לייצר נישה חולפת התומכת בשלמות המבנית של השריר המתחדש ומספקת סביבה חיובית לקיום התפשטות והתמיינות של MuSCs באופן פרקריני5. עם התקדמות ההתחדשות, FAPs מנוקים מהשריר הרגנרטיבי על ידי אפופטוזיס, ומספרם חוזר בהדרגה לרמה בסיסית12. עם זאת, בתנאים המעדיפים פגיעה כרונית בשרירים, FAPs גוברים על איתות פרו-אפופטוטי ומצטברים בנישת השרירים, שם הם מתבדלים לפיברובלסטים ואדיפוציטים המייצרים קולגן, מה שמוביל לחדירת שומן חוץ רחמי וליצירת צלקת פיברוטית12,13.
בשל הרב-פוטנטיות שלהם ויכולות ההתחדשות שלהם, FAPs ו- MuSCs זוהו כמטרות פוטנציאליות ברפואה רגנרטיבית לטיפול בהפרעות בשרירי השלד. לכן, כדי לחקור את תפקודם ואת הפוטנציאל הטיפולי שלהם, חשוב ליצור פרוטוקולים יעילים וניתנים לשחזור עבור בידוד ותרבות של FAPs ו- MuSCs.
מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) יכול לזהות אוכלוסיות תאים שונות על סמך מאפיינים מורפולוגיים כגון גודל וגרעיניות, ומאפשר בידוד ספציפי לתא בהתבסס על שימוש בנוגדנים המכוונים נגד סמני פני השטח של התא. בעכברים בוגרים, MuSCs מבטאים את מולקולת הידבקות תאי כלי הדם 1 (VCAM-1, הידועה גם בשם CD106)14,15 ו-α7-Integrin15, בעוד ש-FAPs מבטאים את α הקולטן של גורם הגדילה שמקורו בטסיות (PDGFRα) ואת האנטיגן של תאי הגזע 1 (Sca1 או Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . בפרוטוקול המתואר כאן, MuSCs זוהו כ-CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, בעוד ש-FAPs זוהו כ-CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. לחלופין, נעשה שימוש בעכברי PDGFRαEGFP כדי לבודד FAPs כ-CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- אירועים18,19. יתר על כן, השווינו את החפיפה בין האות הפלואורסצנטי של תאי PDGFRα-GFP+ לתאים שזוהו על ידי סמן פני השטח Sca1. הניתוח שלנו הראה כי כל התאים המבטאים GFP היו חיוביים גם עבור Sca1, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש בכל אחת מהגישות לזיהוי ובידוד של FAPs. לבסוף, צביעה עם נוגדנים סמנים ספציפיים אישרה את הטוהר של כל אוכלוסיית תאים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G BD Needle 1 in. single use, sterile</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b)</td>
			<td>The University of British Columbia</td>
			<td>53-0010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD31 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSMelody Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD106 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J&#160; mouse (Female and Male)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>007669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution (1 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 40 &#181;m Cell Strainer, Blue, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Collagenase, Type II, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Dispase, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DMEM, high glucose, HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12430054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Horse Serum, New Zealand origin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse PDGF&#160;R alpha Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9624464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NCC0528893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)</td>
			<td>Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 Streptavidin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle

תאי אב פיברו-אדיפוגניים (FAPs) הם אוכלוסייה של תאים סטרומליים מזנכימליים (MSCs) המתגוררים בשרירי השלד, המסוגלים להתמיין לאורך שושלת פיברוגנית, אדיפוגנית, אוסטאוגנית או כונדרוגנית. יחד עם תאי גזע של שרירים (MuSCs), FAPs ממלאים תפקיד קריטי בהומאוסטזיס שרירים, בשיקום ובהתחדשות, תוך שמירה פעילה ועיצוב מחדש של המטריצה החוץ-תאית (ECM). במצבים פתולוגיים, כגון נזק כרוני ודיסטרופיות שרירים, FAPs עוברים הפעלה חריגה ומתמיינים לפיברובלסטים ואדיפוציטים המייצרים קולגן, מה שמוביל לפיברוזיס ולחדירת שומן תוך שרירית. לפיכך, FAPs ממלאים תפקיד כפול בהתחדשות שרירים, בין אם על ידי שמירה על תחלופת MuSC וקידום תיקון רקמות או תרומה ליצירת צלקות פיברוטיות וחדירת שומן חוץ רחמי, הפוגעים בשלמות ובתפקוד של רקמת שריר השלד. טיהור נכון של FAPs ו- MuSCs הוא תנאי מוקדם להבנת התפקיד הביולוגי של תאים אלה בתנאים פיזיולוגיים כמו גם בתנאים פתולוגיים. במאמר זה נתאר שיטה מתוקננת לבידוד סימולטני של FAPs ו-MuSCs משרירי גפיים של עכברים בוגרים באמצעות מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנציה (FACS). הפרוטוקול מתאר בפירוט את הדיסוציאציה המכנית והאנזימטית של תאים חד-גרעיניים משרירי גפיים שלמות ומשרירי טיביאליס קדמיים (TA) פצועים. FAPs ו-MuSCs מבודדים לאחר מכן באמצעות סדרן תאים אוטומטי למחצה כדי להשיג אוכלוסיות תאים טהורות. בנוסף, אנו מתארים שיטה אופטימלית לגידול FAPs ו-MuSCs שקטים ומופעלים, לבד או בתנאי קולקולטורה.

פרוטוקול זה מאפשר בידוד של כמיליון FAPs ועד 350,000 MuSCs מגפיים אחוריות לא מרוטשות של עכברים בוגרים מסוג בר (3-6 חודשים), המקביל לתשואה של 8% עבור FAPs ו-3% עבור MuSCs של סך האירועים. בעת מיון תאים מת"א פגום 7 ימים לאחר הפציעה, שניים עד שלושה שרירי TA מאוגדים כדי לקבל עד 300,000 FAPs ו-120,000 MuSCs, התואמים לתשואה של 11% ו-4%...

Watch this Scientific Journal Video about FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle

הזיהוי המדויק של תאי אב פיברו-אדיפוגניים (FAPs) ותאי גזע של שרירים (MuSCs) הוא קריטי לחקר תפקודם הביולוגי בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. פרוטוקול זה מספק הנחיות לבידוד, לטיהור ולתרבות של FAPs ו-MuSCs משרירי עכברים בוגרים.

בידוד ותרבית FACS של אבות פיברו-אדיפוגניים ותאי גזע של שרירים משרירי שלד עכברים לא מופרעות ופצועים

Fibro-adipogenic progenitor cells (FAPs) are a population of skeletal muscle-resident mesenchymal stromal cells (MSCs) capable of differentiating along ...

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד סימולטני של תאי גזע פיברו-אדיפוגניים, אבות ותאי גזע של שרירים באמצעות מפעילי פלואורסצנטיות של מיון. אוכלוסיות טהורות של תאים אלה הן תנאי מוקדם להבנת תפקידם הביולוגי בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. באמצעות טכניקה זו, פורבס ותאי גזע של שרירים זוהו ובודדו מבית השחי או משריר פצוע.החסינות הגבוהה של פורבס ותאי גזע של שרירים אפשרה לנו להשתמש בתאים אלה לטכניקות שונות במורד הזרם כגון השתלת סכרין וניתוח תערובת בוציאלית. כדי להתחיל, מניחים את העכבר המומת על כרית דיסקציה ומרססים אותו ב-70% אתנול כדי למנוע זיהום השתמשו במלקחיים כדי לצבוט את מרכז עור בטן העכבר וחתכו כסנטימטר פתיחה אופקית. תפסו את קצוות הפצע ואת הדיסק בעכבר על ידי משיכת הפתח בכיוונים הפוכים כדי לחשוף את השרירים שמתחת, וחשפו צד אחד של הגפה האחורית באותו זמן.לפני איסוף השרירים, הסר שומן בין-שרירי בין ההמסטרינגים בקצה הפרוקסימלי של הארבע ראשי כדי לשפר את הבידוד של תאי אב פיברו אדיפוגניים ותאי גזע שריר. לאחר מכן, מבלי לפגוע ברקמה השתמש במלקחיים חדים כדי לשבור ולקלף את החיתולית כדי לחשוף את שרירי הטיביאליס הקדמיים או TA ו- extensor digitorum longus או EDL. הפעל את הקצה החד של המלקחיים מתחת לשרירי TA EDL כדי לנתק את השרירים מהטיביה.חותכים את הגידים, מחברים את ה- TA EDL לקרסול ותוך כדי החזקתו במלקחיים, חותכים את השרירים במספריים לאורך קו האורך של ה- TA EDL. חותכים את הגידים סביב הברך כדי לנתק את כל שרירי ה-TA EDL. מניחים את השרירים בצלחת של שישה סנטימטרים שנשמרת על קרח.כדי לבודד את שרירי הגסטרוקנמיוס חותכים את כל הגידים בקרסול ומנתקים את השרירים מהטיביה והפיבולה. חותכים סביב הברך ומעבירים את השרירים לצלחת. לקלף את החיתולית סביב quadriceps ולהפריד אותו מן עצם הירך על ידי הפעלת הקצה החד של מלקחיים בין השריר והעצם.חותכים את הגידים סביב הברך וחותכים את שאר השריר על ידי חיתוך לאורך עצם הירך תוך החזקת הארבע ראשי עם מלקחיים בקצה הדיסטלי. מניחים את השרירים בצלחת של שישה סנטימטרים. נתקו את שרירי ההמסטרינג והשרירים הנותרים סביב עצם הירך והעבירו אותם לצלחת.לאסוף את שרירי הגפיים האחוריות בצלחת שנשמרה על קרח. שאפו לשטוף בינוני מן המנה ולהוסיף אחד עד שני מיליליטר של חיץ דיסוציאציה שריר כדי לשמור על השרירים לחים. לאחר מכן, טחון שרירים ביסודיות השתמש באזמל כדי לקרוע ולפרוס את השריר ולאחר מכן להשתמש מספריים כדי להמשיך לחתוך את השריר לחתיכות קטנות במשך דקה עד שתי דקות עד לקבלת הדבק slurry של רקמה טחון היטב.לאחר מכן מעבירים את השרירים הטחונים לצינור החרוטי המכיל חיץ דיסוציאציה שרירי. אוטמים את הצינורות עם סרט מעבדה ודוגרים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה למשך שעה. לאחר שעה, הסר את הצינור מהשייקר ומלא אותו ל -50 מיליליטר עם מדיום כביסה, הפוך בעדינות את הצינור פעמיים כדי להבטיח ערבוב.צנטריפוגה של התאים בדלי מתנדנד רוטור ב 250 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים 42 מיליליטר של סופרנאטנט לשני צינורות חדשים ומשאירים שמונה מיליליטר בצינור המקורי. מלאו את הצינורות החדשים המכילים 21 מיליליטר של הסופרנטנט עד 50 מיליליטר במדיום כביסה.לאחר מכן צנטריפוגה של התאים ב 350 פעמים G במשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס. שאפו את הסופר-נאטנט ושמרו את הכדורים על הקרח. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של collagenases שני מלאי ומיליליטר אחד של מלאי מבוסס דיס בצינור המקורי המכיל שמונה מיליליטר של חיץ דיסוציאציה שרירית.באמצעות פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר יש להשעות את הכדור 10 פעמים ללא סתימה. לפלוט את התמיסה לכיוון הקיר של הצינור, הימנעות בועות היווצרות. אטמו את הצינורות עם סרט מעבדה ודגרו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה במשך 30 דקות.לאחר 30 דקות, הסר את הצינור מן השייקר לשאוף ולהוציא את ההשעיה שריר 10 פעמים דרך מזרק 10 מיליליטר עם מחט 20 מד, למלא כל צינור עד 50 מיליליטר עם בינוני לשטוף ולהפוך את הצינור. לאחר מכן צנטריפוגה ב 250 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהעביר את supernatant לתוך צינור חדש. השארת שמונה מיליליטר בצינור המקורי.למלא את הצינור החדש עד 50 מיליליטר עם מדיום לשטוף, שוב צנטריפוגה את התאים ב 350 פעמים G במשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס. מוציאים את הסופר-נאטנט ושומרים את הכדור על הקרח. מניחים מסננת תאי ניילון בגודל 40 מיקרון בצינור החרוטי המקורי של 50 מיליליטר המכילה שמונה מיליליטר של מדיום שטיפה ומרטיבים מראש את המסננת במיליליטר אחד עד שניים של מדיום כביסה.תוך כדי החזקת המסננת, השתמש פיפטה של 10 מיליליטר כדי להשהות את הכדור בעדינות. סנן את המתלה דרך מסננת התא בחזרה לאותה צינור כדי למזער את אובדן התא. סנן את כדורי הצינור האחרים בחזרה לצינור המקורי על ידי הוספת ארבעה עד חמישה מיליליטרים של מדיום כביסה לכל צינור כדי להשעות מחדש את הכדורים ולהעביר את התמיסה למסננת העצמית הממוקמת בצינור המקורי.לאחר איסוף כל הכדורים לתוך צינור המקורי 50 מיליליטר לשטוף את המסננת העצמית עם עוד ארבעה עד חמישה מיליליטר של מדיום לשטוף. השתמש פיפטה 1000 microliter כדי לאסוף את כל הנוזלים מן החלק התחתון של מסננת עצמית. מלא כל צינור עם בינוני לשטוף עד 50 מיליליטר ולהפוך את הצינור.צנטריפוגה את הצינור ב 250 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את supernatant מיד מבלי להפריע את הכדור ו resuse את הכדור ב 600 microliters של מדיום לשטוף. מעבירים את המתלים לצינור מיקרו צנטריפוגה של שני מיליליטר.הוסף נוגדנים CD 31 APC CD 45 APC SCA אחד פסיפיק כחול VCAM אחד ביוטין ואלפא שבע Integrin PE לתוך צינור שני מילימטר המכיל תרחיף תאים. מערבבים בעדינות ודוגרים את התאים בשייקר מסתובב בארבע מעלות צלזיוס למשך 45 דקות כדי להגן עליהם מפני אור. לאחר הדגירה, למלא את כל הצינורות עד שני מיליליטר עם בינוני לשטוף צנטריפוגה ב 250 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.הסר את supernatant ו resuse את הכדור ב 300 microliters של מדיום לשטוף. לאחר מכן, יש להוסיף נוגדן סטרפטווידין לצינורות ולדגור על התאים בשייקר מסתובב בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, צינורות מילוי המכילים נוגדן סטרפטווידין לשני מיליליטר עם מדיום כביסה.לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינורות ולשאוף את supernatant לחלוטין. לאחר השטיפה השנייה, יש להשעות את התאים בצינור הניסוי ב-500 מיקרוליטרים של מדיום הכביסה. יש להרטיב מראש מכסה מסננת תא של צינור תחתון עגול של חמישה מיליליטר פוליסטירן עם 200 מיקרוליטר של מדיום כביסה.העבירו את מתלה התא מצינור הניסוי לצינור התחתון העגול של חמישה מיליליטר פוליסטירן ואפשרו לו לסנן לפי כוח הכבידה. הדפיסו את צינור שני המיליליטר המכיל את מתלה הדגימה הניסיוני עם 300 מיקרוליטר של מדיום כביסה והעבירו אותו דרך אותו מכסה מסננת. השתמש פיפטה 200 microliter כדי לאסוף את כל הנוזל מן החלק התחתון של מסננת התא.לאטום עם כובע, להשאיר צינורות על קרח ולהגן עליהם מפני אור. אסטרטגיית ה-gating שאומצה לבידוד של תאי אב ותאי גזע של שריר פיברו אדיפוגניים מוצגת כאן. ה- PD GFR alpha E G F P לדפוק בעכברים מדווחים מבטא את גן ההיתוך H two B E G F P מתוך לוקוס אלפא PD G FFR אנדוגני, ומאפשר תיוג יעיל וספציפי של שושלת האלפא PD G GFR.טוהר אוכלוסיות התאים המבודדים אושר על ידי צביעה חיסונית של תרבית משותפת GFP חיובית פיברו אדיפוגנית ותאי גזע שרירים עם נוגדני PAC-7. אב פיברו אדיפוגני חיובי ל-GFP לא ביטא את סמן PAC-7, בעוד שתאי גזע שריריים הגיבו עם נוגדן זה. כל התאים המבטאים GFP היו חיוביים עבור SCA אחד ושליליים עבור CD 31, CD 45 VCAM אחד ואלפא שבע integrin.מוצגים תאי האב ותאי גזע השריריים של פיברו אדיפוגניים שבודדו מעכברים שנפצעו בזריקות תוך שריריות ללא רעלן שבעה ימים לאחר הפציעה. ככל שתאי גזע שריר מופעלים עלייה בגודל התא. חשוב להתאים את הפרמטרים F SCA ו- SS CA ולהרחיב את השער כך שיכלול תאים אלה במרכז.כימות של תאי אב ותאי גזע של שרירים פיברו אדיפוגניים בשרירי TA שלא נפגעו ושבעה ימים לאחר הפציעה מוצגים כאן. למרות שהשיא וההתרבות נצפו בין הימים השני לשלושה, עדיין ניתן היה להבחין בשיעור נמוך של תאים מתרבים שבעה ימים לאחר הפציעה. ביצוע ניקוי שרירים תקין הוא בעל חשיבות קריטית לשחרור תאים בודדים.יתר על כן, בידוד תאי מונונוקלאוטיד מושג על ידי הפעלת המתלה למזרק 10 מיליליטר עם מחט 20 מדודה. טכניקה זו תסייע למדענים לחקור את פרופיל השעתוק הביולוגי והאפיגנומי של פורבס ותאי גזע של שרירים במצב תקין ובשלבים העמוקים יותר של התחדשות השרירים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

אקס תרבות Vivo של בלוע קשתות לחקר תאי אב לב ושרירים והנישה שלהם

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

באמצעות מבודד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות נשימה microplate תפוקה הגבוה

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

אינדוקציה של התחדשות שריר שלד החריף ידי Cardiotoxin הזרקה

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

הכנה והתרבות של תאים מבשר myogenic / ראשי myoblasts מן שרירי השלד של מבוגר ובני אדם בני

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

הערכה של פציעה-induced הזדקנות ביולוגית, In Vivo התכנות בשריר השלד

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

יישום של גירוי כרוני ללמוד עיבודים פנוטיפי של שרירי השלד כויץ הנוצרות על-ידי פעילות עכברוש

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

זיהוי של שרירי השלד תאים הלוויין על-ידי Immunofluorescence עם Pax7 ו- Laminin נוגדנים

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...