Name: facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-06-08T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

Vorremmo ringraziare Tom Cheung (The Hong Kong University of Science & Technology) per i consigli sull'isolamento MuSC. Questo lavoro è stato finanziato dal NIAMS-IRP attraverso le sovvenzioni NIH AR041126 e AR041164.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida istituzionali approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali (ACUC) dell'Istituto nazionale di artrite, muscoloscheletrico e malattie della pelle (NIAMS). Gli investigatori che eseguono questo protocollo devono aderire alle loro linee guida locali sull'etica animale.
NOTA: Questo protocollo descrive in dettaglio come isolare FAP e MuSC dagli arti posteriori e dai muscoli tibiali anteriori (TA) f...

<ol>
	<li>Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+as+a+&amp;#34;mediator&amp;#34;+of+systemic+metabolism.">Muscle as a &amp;#34;mediator&amp;#34; of systemic metabolism.</a> Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).</li><li>Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+and+skeletal+muscle+regeneration.">Satellite cells and skeletal muscle regeneration.</a> Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).</li><li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells.">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).</li><li>Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+satellite+cell+contribution+to+uninjured+adult+muscle+fibers.">Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers.</a> Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).</li><li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+injury+activates+resident+fibro/adipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis.">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle.">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li><li>Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+roles+of+muscle-resident+fibro-adipogenic+progenitors+in+health,+regeneration,+neuromuscular+disorders,+and+aging.">Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging.</a> Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).</li><li>Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle.">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+progenitors+resident+in+the+skeletal+muscle+interstitium+exhibit+robust+BMP-dependent+osteogenic+activity+and+mediate+heterotopic+ossification.">Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).</li><li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+tissue-resident+PDGFR&#945;++fibro-adipogenic+progenitors+spontaneously+acquire+osteogenic+phenotype+in+an+altered+inflammatory+environment.">Murine tissue-resident PDGFR&#945;+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).</li><li>Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-adipogenic+progenitors+cross-talk+in+skeletal+muscle:+The+social+network.">Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).</li><li>Lemos, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nilotinib+reduces+muscle+fibrosis+in+chronic+muscle+injury+by+promoting+TNF-mediated+apoptosis+of+fibro/adipogenic+progenitors.">Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors.</a> Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).</li><li>Malecova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cellular+states+of+fibro-adipogenic+progenitors+during+myogenesis+and+muscular+dystrophy.">Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 9, 3670 (2018).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).</li><li>Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs):+Isolation+by+FACS+and+culture.">Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture.</a> Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).</li><li>Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+differentiation+of+fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs)+from+skeletal+muscle.">Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).</li><li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms.">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li><li>Contreras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+TGF-&#946;+and+PDGFR&#945;+signaling+pathways+regulates+the+fate+of+stromal+fibro-adipogenic+progenitors.">Cross-talk between TGF-&#946; and PDGFR&#945; signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors.</a> Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).</li><li>Holmes, C., Stanford, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Stem+cell+antigen-1:+Expression,+function,+and+enigma.">Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma.</a> Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).</li><li>Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HGFA+Is+an+injury-regulated+systemic+factor+that+induces+the+transition+of+stem+cells+into+GAlert.">HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert.</a> Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).</li><li>Garc&#237;a-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+maintains+a+genuine+muscle+stem-cell+quiescent+state+until+geriatric+age.">FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).</li><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterioration+and+variability+of+highly+purified+collagenase+blends+used+in+clinical+islet+isolation.">Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation.</a> Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).</li><li>Walls, P. L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+potential+for+bursting+bubbles+to+damage+suspended+cells.">Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li><li>Kafadar, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sca-1+expression+is+required+for+efficient+remodeling+of+the+extracellular+matrix+during+skeletal+muscle+regeneration.">Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration.</a> Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).</li></ol>

Stabilire protocolli efficienti e riproducibili per l'identificazione e l'isolamento di popolazioni di cellule staminali adulte pure è il primo e più critico passo verso la comprensione della loro funzione. Le FAP e le MuSC isolate possono essere utilizzate per condurre analisi multiomiche in esperimenti di trapianto come potenziale trattamento per le malattie muscolari o possono essere geneticamente modificate per la modellizzazione della malattia nella terapia con cellule staminali. 
Il pr...

Il muscolo scheletrico è il tessuto più grande del corpo, che rappresenta ~ 40% del peso umano adulto, ed è responsabile del mantenimento della postura, della generazione di movimento, della regolazione del metabolismo energetico basale e della temperatura corporea1. Il muscolo scheletrico è un tessuto altamente dinamico e possiede una notevole capacità di adattarsi a una varietà di stimoli, come stress meccanico, alterazioni metaboliche e fattori ambientali quotidiani. Inoltre, il muscolo scheletrico si rigenera in risposta a lesioni acute, portando al completo ripristino della sua morfologia e delle sue funzioni2. La plasticità del muscolo scheletrico si basa principalmente su una popolazione di cellule staminali muscolari residenti (MuSC), chiamate anche cellule satelliti, che si trovano tra la membrana plasmatica della miofibra e la lamina basale 2,3. In condizioni normali, i MuSC risiedono nella nicchia muscolare in uno stato quiescente, con solo poche divisioni per compensare il turnover cellulare e ricostituire il pool di cellule staminali4. In risposta alle lesioni, le MuSC entrano nel ciclo cellulare, proliferano e contribuiscono alla formazione di nuove fibre muscolari o ritornano nella nicchia in un processo di auto-rinnovamento 2,3. Oltre ai MuSC, il mantenimento omeostatico e la rigenerazione del muscolo scheletrico si basano sul supporto di una popolazione di cellule muscolari residenti denominate progenitori fibro-adipogeni (FAP)5,6,7. Le FAP sono cellule stromali mesenchimali incorporate nel tessuto connettivo muscolare e in grado di differenziarsi lungo la linea fibrogenica, adipogena, osteogenica o condrogena 5,8,9,10. I FAP forniscono supporto strutturale per i MuSC in quanto sono una fonte di proteine della matrice extracellulare nella nicchia delle cellule staminali muscolari. I FAP promuovono anche il mantenimento a lungo termine del muscolo scheletrico secernendo citochine e fattori di crescita che forniscono supporto trofico per la miogenesi e la crescita muscolare 6,11. In caso di lesione muscolare acuta, i FAP proliferano rapidamente per produrre una nicchia transitoria che supporta l'integrità strutturale del muscolo rigenerante e fornisce un ambiente favorevole per sostenere la proliferazione e la differenziazione dei MuSC in modo paracrino5. Man mano che la rigenerazione procede, i FAP vengono eliminati dal muscolo rigenerativo mediante apoptosi e il loro numero ritorna gradualmente al livello basale12. Tuttavia, in condizioni che favoriscono il danno muscolare cronico, i FAP annullano la segnalazione pro-apoptotica e si accumulano nella nicchia muscolare, dove si differenziano in fibroblasti e adipociti che producono collagene, portando a infiltrati di grasso ectopico e formazione di cicatrici fibrotiche12,13.
Grazie alla loro multipotenza e alle loro capacità rigenerative, FAP e MuSC sono stati identificati come potenziali bersagli nella medicina rigenerativa per il trattamento dei disturbi del muscolo scheletrico. Pertanto, per studiare la loro funzione e il potenziale terapeutico, è importante stabilire protocolli efficienti e riproducibili per l'isolamento e la coltura di FAP e MuSC.
La selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) può identificare diverse popolazioni cellulari in base a caratteristiche morfologiche come dimensioni e granularità e consente l'isolamento cellulare specifico basato sull'uso di anticorpi diretti contro i marcatori della superficie cellulare. Nei topi adulti, i MuSC esprimono la molecola di adesione delle cellule vascolari 1 (VCAM-1, nota anche come CD106)14,15 e α7-integrina 15, mentre i FAP esprimono il recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine α (PDGFRα) e l'antigene delle cellule staminali 1 (Sca1 o Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . Nel protocollo qui descritto, i MuSC sono stati identificati come CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, mentre i FAP sono stati identificati come CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. In alternativa, topi PDGFRαEGFP sono stati impiegati per isolare FAP come CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- eventi18,19. Inoltre, abbiamo confrontato la sovrapposizione tra il segnale fluorescente delle cellule PDGFRα-GFP+ alle cellule identificate dal marcatore di superficie Sca1. La nostra analisi ha mostrato che tutte le cellule che esprimono GFP erano anche positive per Sca1, indicando che entrambi gli approcci possono essere impiegati per l'identificazione e l'isolamento delle FAP. Infine, la colorazione con anticorpi marcatori specifici ha confermato la purezza di ciascuna popolazione cellulare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G BD Needle 1 in. single use, sterile</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b)</td>
			<td>The University of British Columbia</td>
			<td>53-0010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD31 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSMelody Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD106 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J&#160; mouse (Female and Male)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>007669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution (1 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 40 &#181;m Cell Strainer, Blue, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Collagenase, Type II, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Dispase, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DMEM, high glucose, HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12430054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Horse Serum, New Zealand origin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse PDGF&#160;R alpha Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9624464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NCC0528893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)</td>
			<td>Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 Streptavidin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle

Le cellule progenitrici fibro-adipogeniche (FAP) sono una popolazione di cellule stromali mesenchimali (MSC) residenti nel muscolo scheletrico in grado di differenziarsi lungo la linea fibrogenica, adipogena, osteogenica o condrogena. Insieme alle cellule staminali muscolari (MuSC), le FAP svolgono un ruolo fondamentale nell'omeostasi, nella riparazione e nella rigenerazione muscolare, mantenendo e rimodellando attivamente la matrice extracellulare (ECM). In condizioni patologiche, come danni cronici e distrofie muscolari, i FAP subiscono un'attivazione aberrante e si differenziano in fibroblasti e adipociti produttori di collagene, portando alla fibrosi e all'infiltrazione grassa intramuscolare. Pertanto, i FAP svolgono un duplice ruolo nella rigenerazione muscolare, sostenendo il turnover MuSC e promuovendo la riparazione dei tessuti o contribuendo alla formazione di cicatrici fibrotiche e infiltrati di grasso ectopico, che compromettono l'integrità e la funzione del tessuto muscolare scheletrico. Una corretta purificazione di FAP e MuSC è un prerequisito per comprendere il ruolo biologico di queste cellule sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Qui, descriviamo un metodo standardizzato per l'isolamento simultaneo di FAP e MuSC dai muscoli degli arti di topi adulti utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). Il protocollo descrive in dettaglio la dissociazione meccanica ed enzimatica delle cellule mononucleate dai muscoli dell'intero arto e dai muscoli tibiali anteriori (TA) lesionati. FAP e MuSC vengono successivamente isolati utilizzando uno smistatore di cellule semi-automatico per ottenere popolazioni cellulari pure. Descriviamo inoltre un metodo ottimizzato per la coltura di FAP e MuSC quiescenti e attivati, da soli o in condizioni di cocultura.

Questo protocollo consente l'isolamento di circa un milione di FAP e fino a 350.000 MuSC dagli arti posteriori illesi di topi adulti wild-type (3-6 mesi), corrispondente a una resa dell'8% per le FAP e del 3% per le MuSC degli eventi totali. Quando si selezionano le cellule dal TA danneggiato 7 giorni dopo l'infortunio, vengono raggruppati da due a tre muscoli TA per ottenere fino a 300.000 FAP e 120.000 MuSC, che corrispondono a una resa rispettivamente dell'11% e del 4%. I valori di purezza post-ordinamento sono genera...

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FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle

L'identificazione precisa delle cellule progenitrici fibro-adipogeniche (FAP) e delle cellule staminali muscolari (MuSC) è fondamentale per studiare la loro funzione biologica in condizioni fisiologiche e patologiche. Questo protocollo fornisce linee guida per l'isolamento, la purificazione e la coltura di FAP e MuSC da muscoli di topo adulti.

FACS-isolamento e coltura di progenitori fibro-adipogeni e cellule staminali muscolari da muscolo scheletrico di topo imperturbato e ferito

Fibro-adipogenic progenitor cells (FAPs) are a population of skeletal muscle-resident mesenchymal stromal cells (MSCs) capable of differentiating along ...

Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento simultaneo di fibro adipogenici, progenitori e cellule staminali muscolari utilizzando attivatori di fluorescenza di selezione. Le popolazioni pure di queste cellule sono un prerequisito per comprendere il loro ruolo biologico in condizioni fisiologiche e patologiche. Utilizzando questa tecnica, Forbes e le cellule staminali muscolari sono state identificate e isolate dall'ascella o dal muscolo ferito.L'elevata impunità di Forbes e delle cellule staminali muscolari ci ha permesso di utilizzare queste cellule per diverse tecniche a valle come il trapianto di saccarina e l'analisi del mix mudiale. Per iniziare, posizionare il topo supino eutanasia su un tampone di dissezione e spruzzarlo con etanolo al 70% Per evitare la contaminazione, utilizzare una pinza per pizzicare il centro della pelle della pancia del topo e tagliare orizzontalmente l'apertura di circa un centimetro. Afferrare i bordi della ferita e il disco nel mouse tirando l'apertura nelle direzioni opposte per scoprire i muscoli sottostanti, esporre un lato dell'arto posteriore alla volta.Prima di raccogliere i muscoli, rimuovere il grasso intermuscolare tra i muscoli posteriori della coscia nell'estremità prossimale del quadricipite per migliorare l'isolamento delle cellule progenitrici fibro adipogeniche e delle cellule staminali muscolari. Successivamente, senza danneggiare il tessuto, utilizzare una pinza affilata per rompere e staccare la fascia per esporre il tibiale inferiore anteriore o TA ed estensore digitorum longus o EDL. Eseguire la punta affilata della pinza sotto i muscoli TA EDL per staccare i muscoli dalla tibia.Tagliare i tendini, attaccando il TA EDL alla caviglia e tenendolo con una pinza, tagliare i muscoli con le forbici lungo la linea longitudinale del TA EDL. Tagliare i tendini intorno al ginocchio per staccare tutti i muscoli TA EDL. Posizionare i muscoli in un piatto di sei centimetri tenuto sul ghiaccio.Per isolare i muscoli gastrocnemio tagliare tutti i tendini alla caviglia e staccare i muscoli dalla tibia e dal perone. Tagliare intorno al ginocchio e trasferire i muscoli al piatto. Staccare la fascia intorno al quadricipite e separarla dal femore facendo scorrere la punta affilata della pinza tra il muscolo e l'osso.Tagliare i tendini intorno al ginocchio e tagliare il resto del muscolo tagliando lungo il femore mentre si tengono i quadricipiti con una pinza all'estremità distale. Posizionare i muscoli nel piatto di sei centimetri. Staccare i muscoli posteriori della coscia e i muscoli rimanenti intorno al femore e trasferirli nel piatto.Raccogli i muscoli degli arti posteriori in un piatto tenuto sul ghiaccio. Aspirare il mezzo di lavaggio dal piatto e aggiungere uno o due millilitri di tampone di dissociazione muscolare per mantenere i muscoli umidi. Quindi, tritare accuratamente i muscoli Utilizzare un bisturi per strappare e affettare il muscolo e quindi utilizzare le forbici per continuare a tagliare il muscolo in piccoli pezzi per uno o due minuti fino ad ottenere una pasta di liquame di tessuto ben tritato.Quindi trasferire i muscoli tritati nel tubo conico contenente il tampone di dissociazione muscolare. Sigillare i tubi con pellicola da laboratorio e incubare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius agitando per un'ora. Dopo un'ora, rimuovere il tubo dallo shaker e riempirlo a 50 millilitri Con il mezzo di lavaggio, capovolgere delicatamente il tubo due volte per garantire la miscelazione.Centrifugare le celle in un rotore oscillante a 250 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire 42 millilitri di surnatante in due nuovi tubi e lasciare otto millilitri nel tubo originale. Riempire i nuovi tubi contenenti 21 millilitri di surnatante fino a 50 millilitri con mezzo di lavaggio.Quindi centrifugare le cellule a 350 volte G per otto minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare il surnatante e mantenere il pellet sul ghiaccio. Quindi, aggiungere un millilitro di collagenasi, due stock e un millilitro di stock a base dis nel tubo originale contenente otto millilitri di tampone di dissociazione muscolare.Utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri risospendere il pellet 10 volte senza intasarsi. Espellere la soluzione verso la parete del tubo, evitando le bolle di formazione. Sigillare i tubi con pellicola di laboratorio e incubare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius agitando per 30 minuti.Dopo 30 minuti, rimuovere il tubo dall'aspirato dello shaker ed espellere la sospensione muscolare 10 volte attraverso una siringa da 10 millilitri con un ago da 20 gauge, riempire ogni tubo fino a 50 millilitri con mezzo di lavaggio e capovolgere il tubo. Quindi centrifugare a 250 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e trasferire il surnatante in un nuovo tubo. Lasciando otto millilitri nel tubo originale.Riempire il nuovo tubo fino a 50 millilitri con mezzo di lavaggio, centrifugare nuovamente le celle a 350 volte G per otto minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e mantenere il pellet sul ghiaccio. Posizionare un filtro a celle di nylon da 40 micron nel tubo conico originale da 50 millilitri contenente otto millilitri di mezzo di lavaggio e pre-bagnare il filtro con uno o due millilitri di mezzo di lavaggio.Mentre si tiene il colino, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per risospendere delicatamente il pellet. Filtrare la sospensione attraverso il filtro cellulare nello stesso tubo per ridurre al minimo la perdita di celle. Filtrare gli altri pellet del tubo nel tubo originale aggiungendo da quattro a cinque millilitri di mezzo di lavaggio a ciascun tubo per risospendere i pellet e trasferire la soluzione all'autofiltro posizionato nel tubo originale.Dopo aver raccolto tutti i pellet nel tubo originale da 50 millilitri, sciacquare l'autofiltro con altri quattro o cinque millilitri di mezzo di lavaggio. Utilizzare una pipetta da 1000 microlitri per raccogliere tutto il liquido dalla parte inferiore dell'autofiltrante. Riempire ogni tubo con mezzo di lavaggio fino a 50 millilitri e capovolgere il tubo.Centrifugare il tubo a 250 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere immediatamente il surnatante senza disturbare il pellet e risospendere il pellet in 600 microlitri di mezzo di lavaggio. Trasferire la sospensione in un micro tubo da centrifuga da due millilitri.Aggiungere gli anticorpi CD 31 APC CD 45 APC SCA un Pacific Blue VCAM una biotina e alfa sette Integrin PE in un tubo da due millimetri contenente sospensione cellulare. Mescolare delicatamente e incubare le cellule in uno shaker rotante a quattro gradi Celsius per 45 minuti proteggendole dalla luce. Dopo l'incubazione, riempire tutti i tubi fino a due millilitri con mezzo di lavaggio e centrifugare a 250 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 300 microlitri di mezzo di lavaggio. Quindi, aggiungere l'anticorpo streptavidina nei tubi e incubare le cellule in uno shaker rotante a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Dopo l'incubazione, riempire i tubi contenenti anticorpi streptavidina a due millilitri con mezzo di lavaggio.Quindi, centrifugare i tubi e aspirare completamente il surnatante . Dopo il secondo lavaggio, risospendere le cellule nel tubo sperimentale in 500 microlitri di mezzo di lavaggio. Pre-bagnare un tappo filtrante cellulare di un tubo inferiore rotondo in polistirene da cinque millilitri con 200 microlitri di mezzo di lavaggio.Trasferire la sospensione cellulare dal tubo sperimentale nel tubo inferiore rotondo in polistirene da cinque millilitri e lasciarlo filtrare per gravità. Stampare il tubo da due millilitri contenente la sospensione campione sperimentale con 300 microlitri di mezzo di lavaggio e passarlo attraverso lo stesso tappo filtrante. Utilizzare una pipetta da 200 microlitri per raccogliere tutto il liquido dalla parte inferiore del filtro cellulare.Sigillare con un cappuccio, lasciare i tubi sul ghiaccio e proteggerli dalla luce. La strategia di gating adottata per l'isolamento del progenitore fibro adipogeno e delle cellule staminali muscolari è mostrata qui. Il PD GFR alpha E G F P knock in topi reporter esprime il gene di fusione H due B E G F P P dal locus alfa endogeno PD G FFR, consentendo una marcatura efficiente e specifica della linea alfa PD G GFR.La purezza delle popolazioni cellulari isolate è stata confermata dalla colorazione immuno di cellule staminali fibro adipogeniche positive alla co-coltura GFP e cellule staminali muscolari con anticorpi PAC-sette. Il progenitore fibro adipogeno GFP positivo non ha espresso il marcatore PAC-sette, mentre le cellule staminali muscolari hanno reagito con questo anticorpo. Tutte le cellule che esprimono GFP erano positive per SCA uno e negative per CD 31, CD 45 VCAM one e alfa sette integrina.Vengono mostrati il progenitore fibro adipogenico e le cellule staminali muscolari isolate da topi feriti con iniezioni intramuscolari di nessuna tossina sette giorni dopo l'infortunio. Man mano che le cellule staminali muscolari vengono attivate, aumenta le dimensioni cellulari. È importante regolare i parametri F SCA e SS CA ed espandere il gate per includere tali celle al centro.La quantificazione del progenitore fibro adipogenico e delle cellule staminali muscolari nei muscoli TA illesi e sette giorni dopo l'infortunio sono mostrati qui. Sebbene il picco e la proliferazione siano stati osservati tra i due e i tre giorni, un basso tasso di cellule proliferanti era ancora apprezzabile sette giorni dopo l'infortunio. L'esecuzione di una corretta macinazione muscolare è di fondamentale importanza per rilasciare una singola cellula.Inoltre, l'isolamento delle cellule mononucleotidiche si ottiene facendo passare la sospensione su una siringa da 10 millilitri con un ago da 20 gauge. Questa tecnica aiuterà gli scienziati a studiare il profilo trascrizionale ed epigenomico biologico di Forbes e delle cellule staminali muscolari in condizioni normali e durante le fasi più profonde della rigenerazione muscolare.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolamento e quantitativa immunocitochimica caratterizzazione di cellule miogeniche primarie e fibroblasti da muscolo scheletrico umano

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Cultura Vivo del faringea Archi allo Studio cuore e muscoli Progenitori e la loro nicchia

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Utilizzo di mitocondri isolati da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per High micropiastre rendimento respiratorie Misure

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Induzione di acuta muscolo scheletrico Rigenerazione da cardiotossina Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Preparazione e la cultura di cellule miogeniche Precursore / mioblasti primari dal muscolo scheletrico di adulti e esseri umani invecchiati

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Valutazione delle lesioni-indotta senescenza e In Vivo riprogrammazione nel muscolo scheletrico

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolamento, la cultura e la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo e dei progenitori degli osteoclasti dai topi

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Applicazione di stimolazione cronica per lo studio del ratto indotta da attività contrattile del muscolo scheletrico fenotipica adattamenti

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identificazione delle cellule satelliti del muscolo scheletrico dall'immunofluorescenza con Pax7 e Laminin anticorpi

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Isolamento, cultura, caratterizzazione e differenziazione delle cellule del progenitore muscolare umano dalla procedura di biopsia muscolare scheletrica