Name: facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-06-08T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

MuSCの分離に関するアドバイスをくださったTom Cheung氏(香港科技大学)に感謝します。この作業は、NIAMS-IRPによって、NIH助成金AR041126およびAR041164を通じて資金提供されました。

実施されたすべての動物実験は、国立関節炎・筋骨格系・皮膚疾患研究所(NIAMS)の動物管理使用委員会(ACUC)によって承認された制度的ガイドラインに準拠して実施されました。このプロトコルを実行する研究者は、地域の動物倫理ガイドラインを遵守する必要があります。
注:このプロトコルでは、後肢および損傷した前脛骨筋からFAPおよびMuSCを分離する方法を詳細に説?...

<ol>
	<li>Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+as+a+&amp;#34;mediator&amp;#34;+of+systemic+metabolism.">Muscle as a &amp;#34;mediator&amp;#34; of systemic metabolism.</a> Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).</li><li>Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+and+skeletal+muscle+regeneration.">Satellite cells and skeletal muscle regeneration.</a> Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).</li><li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells.">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).</li><li>Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+satellite+cell+contribution+to+uninjured+adult+muscle+fibers.">Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers.</a> Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).</li><li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+injury+activates+resident+fibro/adipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis.">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle.">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li><li>Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+roles+of+muscle-resident+fibro-adipogenic+progenitors+in+health,+regeneration,+neuromuscular+disorders,+and+aging.">Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging.</a> Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).</li><li>Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle.">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+progenitors+resident+in+the+skeletal+muscle+interstitium+exhibit+robust+BMP-dependent+osteogenic+activity+and+mediate+heterotopic+ossification.">Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).</li><li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+tissue-resident+PDGFR&#945;++fibro-adipogenic+progenitors+spontaneously+acquire+osteogenic+phenotype+in+an+altered+inflammatory+environment.">Murine tissue-resident PDGFR&#945;+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).</li><li>Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-adipogenic+progenitors+cross-talk+in+skeletal+muscle:+The+social+network.">Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).</li><li>Lemos, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nilotinib+reduces+muscle+fibrosis+in+chronic+muscle+injury+by+promoting+TNF-mediated+apoptosis+of+fibro/adipogenic+progenitors.">Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors.</a> Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).</li><li>Malecova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cellular+states+of+fibro-adipogenic+progenitors+during+myogenesis+and+muscular+dystrophy.">Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 9, 3670 (2018).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).</li><li>Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs):+Isolation+by+FACS+and+culture.">Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture.</a> Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).</li><li>Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+differentiation+of+fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs)+from+skeletal+muscle.">Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).</li><li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms.">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li><li>Contreras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+TGF-&#946;+and+PDGFR&#945;+signaling+pathways+regulates+the+fate+of+stromal+fibro-adipogenic+progenitors.">Cross-talk between TGF-&#946; and PDGFR&#945; signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors.</a> Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).</li><li>Holmes, C., Stanford, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Stem+cell+antigen-1:+Expression,+function,+and+enigma.">Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma.</a> Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).</li><li>Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HGFA+Is+an+injury-regulated+systemic+factor+that+induces+the+transition+of+stem+cells+into+GAlert.">HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert.</a> Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).</li><li>Garc&#237;a-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+maintains+a+genuine+muscle+stem-cell+quiescent+state+until+geriatric+age.">FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).</li><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterioration+and+variability+of+highly+purified+collagenase+blends+used+in+clinical+islet+isolation.">Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation.</a> Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).</li><li>Walls, P. L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+potential+for+bursting+bubbles+to+damage+suspended+cells.">Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li><li>Kafadar, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sca-1+expression+is+required+for+efficient+remodeling+of+the+extracellular+matrix+during+skeletal+muscle+regeneration.">Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration.</a> Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).</li></ol>

純粋な成体幹細胞集団の同定と単離のための効率的で再現性のあるプロトコルを確立することは、その機能を理解するための最初で最も重要なステップです。単離されたFAPおよびMuSCは、筋肉疾患の潜在的な治療法として移植実験におけるマルチオミクス解析を行うために使用することができ、または幹細胞治療における疾患モデリングのために遺伝子改変することができる。 
<p class="jove_...

骨格筋は体内で最大の組織であり、成人の体重の~40%を占め、姿勢の維持、運動の生成、基礎エネルギー代謝の調節、および体温1を担っています。骨格筋は非常に動的な組織であり、機械的ストレス、代謝変化、日常の環境要因など、さまざまな刺激に適応する優れた能力を持っています。さらに、骨格筋は急性損傷に応じて再生し、その形態と機能の完全な回復につながります2。骨格筋の可塑性は、主に筋線維原形質膜と基底層の間に位置するサテライト細胞とも呼ばれる常在筋幹細胞(MuSC)の集団に依存しています2,3。通常の条件下では、MuSCは静止状態で筋肉ニッチに存在し、細胞の代謝回転を補い、幹細胞プールを補充するための分裂はわずかです4。損傷に応答して、MuSCは細胞周期に入り、増殖し、新しい筋線維の形成に寄与するか、自己複製プロセスでニッチに戻ります2,3。MuSCに加えて、骨格筋の恒常性維持と再生は、線維脂肪原性前駆細胞(FAP)と呼ばれる筋肉常在細胞の集団のサポートに依存しています5,6,7。FAPは、筋肉結合組織に埋め込まれた間葉系間質細胞であり、線維形成、脂肪原性、骨形成性、または軟骨原性の系統に沿って分化することができます5、8、9、10。FAPは、筋幹細胞ニッチにおける細胞外マトリックスタンパク質の供給源であるため、MuSCの構造的サポートを提供します。FAPはまた、筋形成と筋肉成長の栄養サポートを提供するサイトカインと成長因子を分泌することにより、骨格筋の長期維持を促進します6,11。急性筋損傷時には、FAPは急速に増殖して、再生する筋肉の構造的完全性をサポートし、パラクリン様式でMuSCの増殖および分化を維持するための好ましい環境を提供する一過性のニッチを生成します5。再生が進むにつれて、FAPはアポトーシスによって再生筋から除去され、その数は徐々に基底レベル12に戻ります。しかし、慢性的な筋肉損傷に有利な状態では、FAPはアポトーシス促進シグナル伝達を無効にして筋肉ニッチに蓄積し、そこでコラーゲン産生線維芽細胞と脂肪細胞に分化し、異所性脂肪浸潤と線維性瘢痕形成を引き起こします12,13。
FAPとMuSCは、その多能性と再生能力により、骨格筋疾患の治療のための再生医療の有望な標的として特定されています。したがって、それらの機能と治療の可能性を調べるためには、FAPとMuSCの分離と培養のための効率的で再現性のあるプロトコルを確立することが重要です。
蛍光活性化セルソーティング(FACS)は、サイズや粒度などの形態学的特性に基づいてさまざまな細胞集団を同定でき、細胞表面マーカーに対する抗体の使用に基づいて細胞特異的な分離を可能にします。成体マウスでは、MuSCは血管細胞接着分子1(VCAM-1、CD106としても知られる)14,15およびα7-インテグリン15を発現し、FAPは血小板由来成長因子受容体α(PDGFRα)および幹細胞抗原1(Sca1またはLy6A/E)5,6,9,12,16,17を発現します。.ここで説明したプロトコルでは、MuSCはCD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-インテグリン+として同定され、FAPはCD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-インテグリン-として同定された。あるいは、PDGFRαEGFPマウスを使用して、FAPをCD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-インテグリン-イベントとして単離した18,19。さらに、PDGFRα-GFP+細胞の蛍光シグナルと表面マーカーSca1で同定された細胞の重なりを比較しました。私たちの分析は、すべてのGFP発現細胞がSca1に対しても陽性であることを示し、FAPの同定と単離にどちらのアプローチも使用できることを示しています。最後に、特異的マーカー抗体による染色により、各細胞集団の純度を確認した。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G BD Needle 1 in. single use, sterile</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b)</td>
			<td>The University of British Columbia</td>
			<td>53-0010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD31 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSMelody Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD106 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J&#160; mouse (Female and Male)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>007669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution (1 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 40 &#181;m Cell Strainer, Blue, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Collagenase, Type II, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Dispase, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DMEM, high glucose, HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12430054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Horse Serum, New Zealand origin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse PDGF&#160;R alpha Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9624464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NCC0528893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)</td>
			<td>Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 Streptavidin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle

線維脂肪原性前駆細胞(FAP)は、線維形成、脂肪原性、骨形成性、または軟骨原性の系統に沿って分化することができる骨格筋に常在する間葉系間質細胞(MSC)の集団です。FAPは、筋幹細胞(MuSC)とともに、細胞外マトリックス(ECM)を積極的に維持およびリモデリングしながら、筋肉の恒常性、修復、および再生に重要な役割を果たします。慢性的な損傷や筋ジストロフィーなどの病的状態では、FAPは異常な活性化を受け、コラーゲン産生線維芽細胞と脂肪細胞に分化し、線維症と筋肉内脂肪浸潤を引き起こします。したがって、FAPは、MuSC代謝回転を維持し、組織修復を促進するか、骨格筋組織の完全性と機能を損なう線維性瘢痕形成と異所性脂肪浸潤に寄与することにより、筋肉の再生に二重の役割を果たします。FAPおよびMuSCの適切な精製は、生理学的および病理学的状態におけるこれらの細胞の生物学的役割を理解するための前提条件です。ここでは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)を用いて成体マウスの四肢筋からFAPとMuSCを同時に単離するための標準化された方法について説明します。プロトコルは、四肢筋全体および損傷した前脛骨筋(TA)からの単核細胞の機械的および酵素的解離を詳細に説明しています。その後、FAPおよびMuSCを半自動セルソーターを使用して単離し、純粋な細胞集団を取得します。さらに、静止および活性化されたFAPおよびMuSCを単独または共存培養条件で培養するための最適化された方法について説明します。

このプロトコルにより、野生型成体マウス(3〜6か月)の損傷していない後肢から約100万のFAPと最大350,000のMuSCを分離することができ、これはFAPで8%、MuSCで3%の収量に対応します。損傷後7日で損傷したTAから細胞を選別する場合、2〜3個のTA筋肉をプールして、最大300,000個のFAPと120,000個のMuSCを取得し、これらはそれぞれ11%と4%の収率に相当します。ソート後の純度値は、通常、FAP および MuSC で 95%...

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FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle

線維脂肪原性前駆細胞(FAP)および筋幹細胞(MuSC)の正確な同定は、生理学的および病理学的状態におけるそれらの生物学的機能を研究するために重要です。このプロトコルは、成体マウスの筋肉からのFAPおよびMuSCの分離、精製、および培養のためのガイドラインを提供します。

FACSによる無動および損傷マウス骨格筋からの線維脂肪原性前駆細胞および筋幹細胞の単離および培養

Fibro-adipogenic progenitor cells (FAPs) are a population of skeletal muscle-resident mesenchymal stromal cells (MSCs) capable of differentiating along ...

このプロトコルは、ソーティングの蛍光活性化剤を使用して、脂肪形成性線維形成性、前駆細胞、および筋幹細胞を同時に単離するための方法を記載している。これらの細胞の純粋な集団は、生理学的および病理学的状態におけるそれらの生物学的役割を理解するための前提条件です。この技術を使用して、フォーブスと筋幹細胞が同定され、脇の下または損傷した筋肉から分離されました。フォーブスと筋幹細胞の高充填免責により、この細胞をサッカリン移植やムジアルミックス分析などのさまざまな下流技術に使用することができました。まず、安楽死させたマウスを解剖パッドに置き、70%エタノールをスプレーします 汚染を避けるために、鉗子を使用してマウスの腹の皮膚の中心をつまみ、水平方向に約1センチの開口部を切ります。マウスの傷口と椎間板をつかみ、開口部を反対方向に引っ張って下の筋肉を明らかにし、その時点で後肢の片側を露出させます。筋肉を収集する前に, 大腿四頭筋の近位端のハムストリングス間の筋肉間脂肪を除去して、線維脂肪生成前駆細胞と筋幹細胞の分離を改善します.次に、組織を損傷することなく、鋭利な鉗子を使用して筋膜を壊して剥がし、前脛骨筋またはTAの下と長指伸筋またはEDL筋を露出させます。TA EDL筋肉の下に鉗子の鋭い先端を走らせて、脛骨から筋肉を切り離します。腱を切り取り、TA EDLを足首に取り付け、鉗子で保持しながら、TA EDLの縦線に沿ってハサミで筋肉を整えます。膝の周りの腱を切断して、TA EDLの筋肉全体を切り離します。氷の上に置いた6センチの皿に筋肉を入れます。腓腹筋を隔離するには、足首のすべての腱を切断し、脛骨と腓骨から筋肉を切り離します。膝の周りを切り、筋肉を皿に移します。大腿四頭筋の周りの筋膜をはがし、鉗子の鋭い先端を筋肉と骨の間に走らせて大腿骨から分離します。膝の周りの腱を切断し、遠位端で大腿四頭筋を鉗子で保持しながら大腿骨に沿って切断することにより、残りの筋肉をトリミングします。筋肉を6センチの皿に入れます。ハムストリングスと大腿骨の周りの残りの筋肉を切り離し、それらを皿に移します。氷の上に置いた皿に後肢の筋肉を集めます。皿から洗浄媒体を吸引し、筋肉を湿らせておくために1〜2ミリリットルの筋肉解離バッファーを追加します。次に、筋肉を徹底的に細かく刻みますメスを使用して筋肉を引き裂いてスライスし、ハサミを使用して筋肉を細かく切り分け、よく刻んだ組織のスラリーペーストが得られるまで1〜2分間筋肉を細かく切り続けます。次に、細かく刻んだ筋肉を筋肉解離バッファーを含む円錐管に移します。チューブを実験室用フィルムで密封し、摂氏37度の水浴中で1時間撹拌しながらインキュベートする。1時間後、シェーカーからチューブを取り外し、50ミリリットルまで満たします 洗浄媒体で、チューブを2回静かに反転させて、確実に混合します。スイングバケットローターでセルを250倍Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。42ミリリットルの上清を2つの新しいチューブに移し、元のチューブに8ミリリットルを残します。21ミリリットルまでの上清を含む新しいチューブに最大50ミリリットルを洗浄媒体で満たします。次に、細胞を摂氏4度で8分間、350倍Gで遠心分離します。上清を吸引し、ペレットを氷上に保つ。次に、8ミリリットルの筋解離バッファーを含む元のチューブに1ミリリットルのコラゲナーゼ2ストックと1ミリリットルのディスベースストックを追加します。5ミリリットルの血清学的ピペットを用いて、目詰まりすることなくペレットを10回再懸濁した。形成気泡を避けて、チューブの壁に向かって溶液を排出します。チューブを実験用フィルムで密封し、摂氏37度の水浴中で30分間攪拌しながらインキュベートします。30分後、シェーカー吸引液からチューブを取り外し、20ゲージ針を備えた10ミリリットルのシリンジを通して筋肉懸濁液を10回排出し、各チューブを洗浄媒体で最大50ミリリットル満たし、チューブを反転させます。次に、摂氏4度で5分間250倍Gで遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。元のチューブに8ミリリットルを残します。新しいチューブを最大50ミリリットルまで洗浄培地で満たし、再び細胞を摂氏4度で8分間350倍Gで遠心分離します。上清を取り除き、ペレットを氷上に置いておきます。8ミリリットルの洗浄媒体を含む元の50ミリリットルの円錐管に40ミクロンのナイロンセルストレーナーを置き、1〜2ミリリットルの洗浄媒体でストレーナーを事前に湿らせます。ストレーナーを保持しながら、10ミリリットルのピペットを使用してペレットを静かに再懸濁します。セルストレーナーを通して懸濁液をろ過して同じチューブに戻して、細胞の損失を最小限に抑えます。各チューブに4〜5ミリリットルの洗浄媒体を加えてペレットを再懸濁し、元のチューブに配置されたセルフストレーナーに溶液を移して、他のチューブペレットを元のチューブに戻します。すべてのペレットを元の50ミリリットルのチューブに集めた後、セルフストレーナーをさらに4〜5ミリリットルの洗浄媒体ですすいでください。1000マイクロリットルのピペットを使用して、セルフストレーナーの下側からすべての液体を収集します。各チューブに最大50ミリリットルの洗浄媒体を満たし、チューブを反転させます。チューブを摂氏4度で5分間、250倍Gで遠心分離します。ペレットを乱すことなく直ちに上清を除去し、ペレットを600マイクロリットルの洗浄媒体に再懸濁します。懸濁液を2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。抗体CD 31 APC CD 45 APC SCA 1 パシフィックブルー VCAM 1 ビオチンおよびアルファ 7 インテグリン PE を細胞懸濁液を含む 2 ミリメートルチューブに加えます。細胞を摂氏4度の回転シェーカーで45分間穏やかに混合してインキュベートし、光から細胞を保護します。インキュベーション後、2ミリリットルまでのすべてのチューブに洗浄培地を満たし、摂氏4度で5分間250倍Gで遠心分離します。上清を除去し、ペレットを300マイクロリットルの洗浄媒体に再懸濁します。次に、ストレプトアビジン抗体をチューブに加え、回転するシェーカーで摂氏4度で20分間インキュベートします。インキュベーション後、ストレプトアビジン抗体を2ミリリットルまで含むチューブを洗浄媒体で満たします。次に、チューブを遠心分離し、上清を完全に吸引します。2回目の洗浄後、実験チューブ内の細胞を500マイクロリットルの洗浄培地に再懸濁する。5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブのセルストレーナーキャップを200マイクロリットルの洗浄媒体で事前に濡らします。細胞懸濁液を実験チューブから5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブに移し、重力でろ過できるようにします。実験サンプル懸濁液を含む2ミリリットルのチューブを300マイクロリットルの洗浄媒体で印刷し、同じストレーナーキャップに通します。200マイクロリットルのピペットを使用して、セルストレーナーの下側からすべての液体を収集します。キャップで密封し、チューブを氷の上に置き、光から保護します。線維脂肪生成前駆細胞および筋幹細胞の単離に採用されたゲーティング戦略をここに示します。レポーターマウスにおけるPD GFRアルファEGF Pノックは、内因性PDG FFRアルファ遺伝子座由来のH二B E G F P融合遺伝子を発現し、PD G GFRアルファ系統の効率的かつ特異的な標識を可能にする。単離した細胞集団の純度は、GFP陽性線維脂肪生成前駆細胞と筋幹細胞をPAC-7抗体で共培養する免疫染色により確認した。GFP陽性線維脂肪生成前駆細胞はPAC-7マーカーを発現しなかったが、筋幹細胞はこの抗体と反応した。すべてのGFP発現細胞は、SCA 1に対して陽性であり、CD 31、CD 45 VCAM1およびα7インテグリンに対して陰性であった。損傷後7日目に無毒素の筋肉内注射で傷害を受けたマウスから単離された線維脂肪生成前駆細胞および筋幹細胞が示されている。筋幹細胞が活性化されると、細胞サイズが大きくなります。F SCA および SS CA パラメータを調整し、ゲートを拡張して中央のセルを含めることが重要です。無傷および損傷後7日間のTA筋肉における線維脂肪生成前駆細胞および筋幹細胞の定量化をここに示します。ピークと増殖は2日目から3日目の間に観察されましたが、損傷後7日目でも細胞の増殖率は依然としてかなり高かったです。適切な筋肉ミンチを行うことは、単一の細胞を放出するために非常に重要です。さらに、モノヌクレオチド細胞単離は、懸濁液を20ゲージの針を有する10ミリリットルのシリンジに流すことによって達成される。この技術は、科学者が正常な状態および筋肉再生のより深い段階でのフォーブスおよび筋幹細胞の生物学的転写およびエピゲノムプロファイルを研究するのに役立ちます。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

咽頭アーチのex vivo培養は、ハートと筋前駆細胞とそのニッチを研究します

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

心臓毒注入による急性骨格筋再生の誘導

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

成人および高齢人間の骨格筋から筋原性前駆細胞/一次筋芽細胞の調製と文化

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

傷害による老化と生体内での骨格筋におけるリプログラミングの評価

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

分離、カルチャ、および骨髄間質細胞とマウスから破骨細胞前駆細胞の分化

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

慢性的な刺激の収縮活動に伴うラット骨格筋の表現型適応を研究への応用

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Pax7 とラミニン抗体抗体法による骨格筋衛星細胞の同定

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...