Name: facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-06-08T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

Vi vil takke Tom Cheung (The Hong Kong University of Science & Technology) for råd om MuSC-isolasjon. Dette arbeidet ble finansiert av NIAMS-IRP gjennom NIH-tilskudd AR041126 og AR041164.

Alle dyreforsøk som ble utført ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer godkjent av Animal Care and Use Committee (ACUC) ved National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases (NIAMS). Etterforskere som utfører denne protokollen må overholde sine lokale dyreetiske retningslinjer.
MERK: Denne protokollen beskriver i detalj hvordan man isolerer FAPs og MuSCs fra bakre lemmer og skadede tibialis anterior (TA) muskler hos voksne mannlige og kvinnelige mus (3-6 ...

<ol>
	<li>Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+as+a+&amp;#34;mediator&amp;#34;+of+systemic+metabolism.">Muscle as a &amp;#34;mediator&amp;#34; of systemic metabolism.</a> Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).</li><li>Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+and+skeletal+muscle+regeneration.">Satellite cells and skeletal muscle regeneration.</a> Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).</li><li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells.">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).</li><li>Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+satellite+cell+contribution+to+uninjured+adult+muscle+fibers.">Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers.</a> Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).</li><li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+injury+activates+resident+fibro/adipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis.">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle.">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li><li>Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+roles+of+muscle-resident+fibro-adipogenic+progenitors+in+health,+regeneration,+neuromuscular+disorders,+and+aging.">Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging.</a> Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).</li><li>Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle.">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+progenitors+resident+in+the+skeletal+muscle+interstitium+exhibit+robust+BMP-dependent+osteogenic+activity+and+mediate+heterotopic+ossification.">Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).</li><li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+tissue-resident+PDGFR&#945;++fibro-adipogenic+progenitors+spontaneously+acquire+osteogenic+phenotype+in+an+altered+inflammatory+environment.">Murine tissue-resident PDGFR&#945;+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).</li><li>Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-adipogenic+progenitors+cross-talk+in+skeletal+muscle:+The+social+network.">Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).</li><li>Lemos, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nilotinib+reduces+muscle+fibrosis+in+chronic+muscle+injury+by+promoting+TNF-mediated+apoptosis+of+fibro/adipogenic+progenitors.">Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors.</a> Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).</li><li>Malecova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cellular+states+of+fibro-adipogenic+progenitors+during+myogenesis+and+muscular+dystrophy.">Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 9, 3670 (2018).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).</li><li>Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs):+Isolation+by+FACS+and+culture.">Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture.</a> Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).</li><li>Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+differentiation+of+fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs)+from+skeletal+muscle.">Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).</li><li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms.">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li><li>Contreras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+TGF-&#946;+and+PDGFR&#945;+signaling+pathways+regulates+the+fate+of+stromal+fibro-adipogenic+progenitors.">Cross-talk between TGF-&#946; and PDGFR&#945; signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors.</a> Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).</li><li>Holmes, C., Stanford, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Stem+cell+antigen-1:+Expression,+function,+and+enigma.">Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma.</a> Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).</li><li>Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HGFA+Is+an+injury-regulated+systemic+factor+that+induces+the+transition+of+stem+cells+into+GAlert.">HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert.</a> Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).</li><li>Garc&#237;a-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+maintains+a+genuine+muscle+stem-cell+quiescent+state+until+geriatric+age.">FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).</li><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterioration+and+variability+of+highly+purified+collagenase+blends+used+in+clinical+islet+isolation.">Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation.</a> Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).</li><li>Walls, P. L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+potential+for+bursting+bubbles+to+damage+suspended+cells.">Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li><li>Kafadar, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sca-1+expression+is+required+for+efficient+remodeling+of+the+extracellular+matrix+during+skeletal+muscle+regeneration.">Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration.</a> Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).</li></ol>

Etablering av effektive og reproduserbare protokoller for identifisering og isolering av rene voksne stamcellepopulasjoner er det første og mest kritiske skrittet mot å forstå deres funksjon. Isolerte FAPs og MuSCs kan brukes til å gjennomføre multiomics analyse i transplantasjonseksperimenter som en potensiell behandling for muskelsykdommer eller kan genmodifiseres for sykdomsmodellering i stamcelleterapi. 
Protokollen beskrevet her gir standardiserte retningslinjer for identifisering, i...

Skjelettmuskulaturen er det største vevet i kroppen, og står for ~ 40% av voksen menneskelig vekt, og er ansvarlig for å opprettholde holdning, generere bevegelse, regulere basal energimetabolisme og kroppstemperatur1. Skjelettmuskulatur er et svært dynamisk vev og har en bemerkelsesverdig evne til å tilpasse seg en rekke stimuli, for eksempel mekanisk stress, metabolske endringer og daglige miljøfaktorer. I tillegg regenererer skjelettmuskulaturen som svar på akutt skade, noe som fører til fullstendig restaurering av morfologi og funksjoner2. Skjelettmuskulaturens plastisitet er hovedsakelig avhengig av en populasjon av bosatte muskelstamceller (MuSCs), også kalt satellittceller, som ligger mellom myofiberplasmamembranen og basal lamina 2,3. Under normale forhold bor MuSCs i muskelnisjen i hvilemodus, med bare noen få divisjoner for å kompensere for cellulær omsetning og for å fylle opp stamcellebassenget4. Som svar på skade går MuSCs inn i cellesyklusen, sprer seg og bidrar enten til dannelsen av nye muskelfibre eller går tilbake til nisje i en selvfornyelsesprosess 2,3. I tillegg til MuSCs, homeostatisk vedlikehold og regenerering av skjelettmuskulaturen stole på støtte fra en populasjon av muskel bosatt celler kalt fibro-adipogenic forfedre (FAPs) 5,6,7. FAPs er mesenkymale stromale celler innebygd i muskelbindevevet og i stand til å differensiere langs fibrogen, adipogen, osteogen eller kondrogen avstamning 5,8,9,10. FAPs gir strukturell støtte til MuSCs, da de er en kilde til ekstracellulære matriksproteiner i muskelstamcellenisjen. FAPs fremmer også langsiktig vedlikehold av skjelettmuskulaturen ved å utskille cytokiner og vekstfaktorer som gir trofisk støtte til myogenese og muskelvekst 6,11. Ved akutt muskelskade sprer FAPs seg raskt for å produsere en forbigående nisje som støtter den strukturelle integriteten til den regenererende muskelen og gir et gunstig miljø for å opprettholde MuSCs spredning og differensiering på en parakrin måte5. Etter hvert som regenerering fortsetter, blir FAPs fjernet fra den regenerative muskelen ved apoptose, og deres tall går gradvis tilbake til basalt nivå12. Imidlertid, under forhold som favoriserer kronisk muskelskade, overstyrer FAPs pro-apoptotisk signalering og akkumuleres i muskelnisjen, hvor de skiller seg ut i kollagenproduserende fibroblaster og adipocytter, noe som fører til ektopiske fettinfiltrater og fibrotisk arrdannelse12,13.
På grunn av deres multipotens og deres regenerative evner, har FAPs og MuSCs blitt identifisert som potensielle mål i regenerativ medisin for behandling av skjelettmuskulaturforstyrrelser. Derfor, for å undersøke deres funksjon og terapeutiske potensial, er det viktig å etablere effektive og reproduserbare protokoller for isolasjon og kultur av FAPs og MuSCs.
Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) kan identifisere forskjellige cellepopulasjoner basert på morfologiske egenskaper som størrelse og granularitet, og tillater cellespesifikk isolasjon basert på bruk av antistoffer rettet mot celleoverflatemarkører. Hos voksne mus uttrykker MuSCs det vaskulære celleadhesjonsmolekylet 1 (VCAM-1, også kjent som CD106) 14,15 og α7-Integrin15, mens FAPs uttrykker blodplateavledet vekstfaktorreseptor α (PDGFRα) og stamcelleantigenet 1 (Sca1 eller Ly6A / E) 5,6,9,12,16,17 . I protokollen beskrevet her ble MuSCs identifisert som CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, mens FAPs ble identifisert som CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Alternativt ble PDGFRαEGFP-mus brukt til å isolere FAPer som CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-hendelser18,19. Videre sammenlignet vi overlappingen mellom det fluorescerende signalet til PDGFRα-GFP + -celler til celler identifisert av overflatemarkøren Sca1. Vår analyse viste at alle GFP-uttrykkende celler også var positive for Sca1, noe som indikerer at begge tilnærmingene kan brukes til identifisering og isolering av FAPs. Til slutt bekreftet farging med spesifikke markørantistoffer renheten til hver cellepopulasjon.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G BD Needle 1 in. single use, sterile</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b)</td>
			<td>The University of British Columbia</td>
			<td>53-0010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD31 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSMelody Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD106 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J&#160; mouse (Female and Male)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>007669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution (1 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 40 &#181;m Cell Strainer, Blue, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Collagenase, Type II, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Dispase, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DMEM, high glucose, HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12430054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Horse Serum, New Zealand origin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse PDGF&#160;R alpha Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9624464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NCC0528893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)</td>
			<td>Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 Streptavidin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle

Fibro-adipogene stamceller (FAPs) er en populasjon av skjelettmuskulaturbosatte mesenkymale stromale celler (MSCs) som er i stand til å differensiere langs fibrogen, adipogen, osteogen eller kondrogen avstamning. Sammen med muskelstamceller (MuSCs) spiller FAPs en kritisk rolle i muskelhomeostase, reparasjon og regenerering, samtidig som de aktivt opprettholder og ombygger den ekstracellulære matrisen (ECM). Under patologiske forhold, som kronisk skade og muskeldystrofier, gjennomgår FAPs avvikende aktivering og skiller seg ut i kollagenproduserende fibroblaster og adipocytter, noe som fører til fibrose og intramuskulær fettinfiltrasjon. Dermed spiller FAPs en dobbel rolle i muskelregenerering, enten ved å opprettholde MuSC-omsetning og fremme vevsreparasjon eller bidra til fibrotisk arrdannelse og ektopisk fettinfiltrater, noe som kompromitterer integriteten og funksjonen til skjelettmuskelvevet. En riktig rensing av FAPs og MuSCs er en forutsetning for å forstå den biologiske rollen til disse cellene i fysiologiske så vel som under patologiske forhold. Her beskriver vi en standardisert metode for samtidig isolering av FAPs og MuSCs fra lemmuskler hos voksne mus ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Protokollen beskriver i detalj den mekaniske og enzymatiske dissosiasjonen av mononukleerte celler fra hele lemmuskler og skadede tibialis anterior (TA) muskler. FAPs og MuSCs blir deretter isolert ved hjelp av en halvautomatisert cellesorterer for å oppnå rene cellepopulasjoner. Vi beskriver i tillegg en optimalisert metode for dyrking av hvilende og aktiverte FAPs og MuSCs, enten alene eller i kokulturforhold.

Denne protokollen tillater isolering av omtrent en million FAPs og opptil 350 000 MuSCs fra ubesudlede bakre lemmer av villtype voksne mus (3-6 måneder), tilsvarende et utbytte på 8% for FAPs og 3% for MuSCs av totale hendelser. Ved sortering av celler fra skadet TA 7 dager etter skade, samles to til tre TA-muskler for å oppnå opptil 300 000 FAPs og 120 000 MuSCs, noe som tilsvarer et utbytte på henholdsvis 11% og 4%. Renhetsverdier etter sortering er vanligvis over 95 % for FAPs og MuSCs.
<p class="jove_content...

Watch this Scientific Journal Video about FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle

Den nøyaktige identifiseringen av fibro-adipogene stamceller (FAPs) og muskelstamceller (MuSCs) er avgjørende for å studere deres biologiske funksjon i fysiologiske og patologiske forhold. Denne protokollen gir retningslinjer for isolering, rensing og kultur av FAPs og MuSCs fra voksne musemuskler.

FACS-isolasjon og kultur av fibro-adipogene forfedre og muskelstamceller fra uforstyrret og skadet museskjelettmuskulatur

Fibro-adipogenic progenitor cells (FAPs) are a population of skeletal muscle-resident mesenchymal stromal cells (MSCs) capable of differentiating along ...

Denne protokollen beskriver en metode for samtidig isolering av fibro adipogenic, forfedre og muskelstamceller ved hjelp av fluorescensaktivatorer av sortering. Rene populasjoner av disse cellene er en forutsetning for å forstå deres biologiske rolle i fysiologiske og patologiske forhold. Ved hjelp av denne teknikken ble Forbes og muskelstamceller identifisert og isolert fra enten armhulen eller skadet muskel.Den høye fylte straffriheten til Forbes og muskelstamceller har gjort det mulig for oss å bruke disse cellene til forskjellige nedstrømsteknikker som sakkarintransplantasjon og mudial blandingsanalyse. For å begynne, plasser den avlivede musen på en disseksjonspute og spray den med 70% etanol For å unngå forurensning, bruk tang for å klemme midten av musemagehuden og kutt omtrent en centimeter åpning horisontalt. Ta tak i sårkantene og disken i musen ved å trekke åpningen i motsatt retning for å avdekke musklene under, eksponer den ene siden av bakbenet om gangen.Før du samler muskler, Fjern intermuskulært fett mellom hamstrings i den proksimale enden av quadriceps for å forbedre isoleringen av fibro adipogene stamceller og muskelstamceller. Deretter, uten å skade vevet, bruk skarpe tang for å bryte og skrelle av fascia for å eksponere under tibialis anterior eller TA og extensor digitorum longus eller EDL muskler. Kjør den skarpe tuppen av tangen under TA EDL-musklene for å løsne musklene fra tibia.Klipp av senene, fest TA EDL til ankelen, og mens du holder den med tang, trim musklene med saks langs lengdelinjen til TA EDL. Klipp senene rundt kneet for å løsne hele TA EDL-musklene. Legg musklene i en seks centimeter tallerken som holdes på is.For å isolere gastrocnemius muskler kutte alle sener ved ankelen og løsne musklene fra tibia og fibula. Skjær rundt kneet og overfør musklene til parabolen. Skrell av fascia rundt quadriceps og skille den fra lårbenet ved å kjøre den skarpe spissen av tangen mellom muskel og bein.Klipp senene rundt kneet og trim resten av muskelen ved å skjære langs lårbenet mens du holder quadriceps med tang i den distale enden. Plasser musklene i seks centimeter parabolen. Løsne hamstrings og gjenværende muskler rundt lårbenet og overfør dem til parabolen.Samle bakre lemmer muskler i en tallerken holdt på is. Aspirer vaskemedium fra parabolen og tilsett en til to milliliter muskeldissosiasjonsbuffer for å holde musklene fuktige. Deretter hakker musklene grundig Bruk en skalpell til å rive og skjære muskelen og bruk deretter saks for å fortsette å kutte muskelen i små biter i ett til to minutter til du får en slurrypasta av godt hakket vev.Overfør deretter de hakkede musklene til det koniske røret som inneholder muskeldissosiasjon Buffer. Forsegl rørene med laboratoriefilm og inkuber i et 37 grader Celsius vannbad med omrøring i en time. Etter en time, fjern røret fra shakeren og fyll det til 50 milliliter Med vaskemedium, snu røret forsiktig to ganger for å sikre blanding.Sentrifuge cellene i en svingende bøtte Rotor ved 250 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius. Overfør 42 milliliter supernatant til to nye rør og la åtte milliliter være i det originale røret. Fyll de nye rørene som inneholder 21 milliliter av supernatanten opp til 50 milliliter med vaskemedium.Sentrifuger deretter cellene ved 350 ganger G i åtte minutter ved fire grader Celsius. Aspirer supernatanten og hold pellets på is. Deretter legger du til en milliliter kollagenas to lager og en milliliter disbasert lager i det opprinnelige røret som inneholder åtte milliliter muskeldissosiasjonsbuffer.Ved hjelp av en fem milliliter serologisk pipette resuspendere pelleten 10 ganger uten tilstopping. Løs ut oppløsningen mot rørets vegg, unngå formasjonsboblene. Forsegl rørene med laboratoriefilm og inkuber i et 37 grader Celsius vannbad med omrøring i 30 minutter.Etter 30 minutter, fjern røret fra shakerens aspirat og kast ut muskelsuspensjonen 10 ganger gjennom en 10 milliliter sprøyte med en 20 gauge nål, fyll hvert rør opp til 50 milliliter med vaskemedium og inverter røret. Sentrifuger deretter ved 250 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius og overfører supernatanten til et nytt rør. Etterlater åtte milliliter i det opprinnelige røret.Fyll det nye røret opp til 50 milliliter med vaskemedium, sentrifuger igjen cellene ved 350 ganger G i åtte minutter ved fire grader Celsius. Fjern supernatanten og hold pelleten på is. Plasser en 40 mikron nyloncellesil i det originale 50 milliliter koniske røret som inneholder åtte milliliter vaskemedium og for-våt silen med en til to milliliter vaskemedium.Mens du holder silen, Bruk en 10 milliliter pipette for å resuspendere pelleten forsiktig. Filtrer suspensjonen gjennom cellesilen tilbake i samme rør for å minimere celletap. Filtrer de andre rørpellets tilbake i det opprinnelige røret ved å legge til fire til fem ml vaskemedium til hvert rør for å resuspendere pellets og overføre løsningen til selvsilen plassert i det opprinnelige røret.Etter å ha samlet alle pellets i det originale 50 milliliter røret, skyll selvsilen med ytterligere fire til fem ml vaskemedium. Bruk en 1000 mikroliter pipette for å samle all væske fra undersiden av selvsilen. Fyll hvert rør med vaskemedium opptil 50 milliliter og snu røret.Sentrifuge røret ved 250 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius. Fjern supernatanten umiddelbart uten å forstyrre pelleten og resuspender pelleten i 600 mikroliter vaskemedium. Overfør suspensjonen til et to milliliter mikrosentrifugerør.Legg til antistoffer CD 31 APC CD 45 APC SCA en Pacific Blue VCAM en biotin og alfa syv Integrin PE i et to millimeter rør som inneholder cellesuspensjon. Bland og inkuber cellene forsiktig i en roterende shaker ved fire grader Celsius i 45 minutter for å beskytte dem mot lys. Etter inkubering, fyll alle rørene opptil to milliliter med vaskemedium og sentrifuge ved 250 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius.Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 300 mikroliter vaskemedium. Deretter legger du streptavidin antistoff i rør og inkuberer cellene i en roterende shaker ved fire grader Celsius i 20 minutter. Etter inkubering, fyll rør som inneholder streptavidin antistoff til to milliliter med vaskemedium.Sentrifuger deretter rørene og aspirerer supernatanten helt. Etter den andre vasken, resuspender cellene i forsøksrøret i 500 mikroliter vaskemedium. For-våt en celle silhette av en fem milliliter polystyren rund bunnrør med 200 mikroliter vaskemedium.Overfør cellesuspensjonen fra forsøksrøret til fem milliliter polystyren rund bunnrør og la den filtrere etter tyngdekraften. Skriv ut to milliliter røret som inneholder den eksperimentelle prøvesuspensjonen med 300 mikroliter vaskemedium og før den gjennom samme silhette. Bruk en 200 mikroliter pipette for å samle all væske fra undersiden av cellesilen.Forsegl med en hette, la rør ligge på is og beskytt dem mot lys. Gating-strategien som er vedtatt for isolering av fibro-adipogene stamceller og muskelstamceller, er vist her. PD GFR alpha E G F P knock in reportermus uttrykker H-to B E G F P-fusjonsgenet fra det endogene PD G FFR alfa-lokuset, noe som muliggjør effektiv og spesifikk merking av PD G GFR alfa-linjen.Renheten til de isolerte cellepopulasjonene ble bekreftet ved immunfarging av samkultur GFP-positive fibro-adipogene stamceller og muskelstamceller med PAC-syv antistoffer. GFP-positiv fibro-adipogen stamfar uttrykte ikke PAC-seven-markøren, mens muskelstamceller reagerte med dette antistoffet. Alle GFP-uttrykkende celler var positive for SCA en og negativ for CD 31, CD 45 VCAM en og alfa syv integrin.Fibro-adipogen stamfar og muskelstamceller isolert fra mus skadet med intramuskulære injeksjoner uten toksin syv dager etter skade er vist. Som muskel stamceller er aktivert en økning i cellulær størrelse. Det er viktig å justere F SCA- og SS CA-parametrene og utvide porten for å inkludere disse cellene i midten.Kvantifisering av fibro adipogenic stamfar og muskel stamceller i uninjured og syv dager etter skade TA muskler er vist her. Selv om topp og spredning ble observert mellom dag to og tre, var en lav frekvens av prolifererende celler fortsatt betydelig syv dager etter skade. Å utføre riktig muskelhakking er av kritisk betydning for å frigjøre en enkelt celle.Videre oppnås mononukleotidcelleisolasjon ved å kjøre suspensjonen til en 10 milliliter sprøyte med en 20 målt nål. Denne teknikken vil hjelpe forskere til å studere den biologiske transkripsjonelle og epigenomiske profilen til Forbes og muskelstamceller i normal tilstand og i de dypere stadiene av muskelregenerering.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolasjon og Kvantitativ immunocytokjemisk Karakterisering av Primære myogenic celler og fibroblaster fra Menneskelig Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex vivo Culture of Faryngeal Arches å studere Hjerte og Muscle stamfedre og deres nisje

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Bruke Isolert Mitokondrier fra minimale mengder av Mouse Skeletal Muscle for høy gjennomstrømming Mikro respirasjonsmålinger

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Induksjon av akutt Skeletal Muscle Regenerering av Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Utarbeidelse og kultur myogenisk forloperceller / Primær myoblasts fra Skeletal Muscle of Adult og Gamle mennesker

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Vurdering av skaden-indusert Senescence og i Vivo omprogrammering i skjelettmuskelen

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolasjon, kultur og differensiering av benmarg Stromal celler og Osteoclast Progenitors fra mus

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Anvendelse av kronisk stimulering å studere kontraktile aktivitet-indusert rotte Skjelettmuskel fenotypiske tilpasninger

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identifikasjon av Skjelettmuskel satellitt celler av Immunofluorescence med Pax7 og Laminin antistoffer

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...