Name: facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-06-08T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer a Tom Cheung (Universidade de Ciência & Tecnologia de Hong Kong) por conselhos sobre o isolamento do MuSC. Este trabalho foi financiado pelo NIAMS-IRP através das bolsas NIH AR041126 e AR041164.

Todos os experimentos em animais realizados foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais aprovadas pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais (ACUC) do Instituto Nacional de Artrite, Musculoesquelético e Doenças da Pele (NIAMS). Os investigadores que executam este protocolo devem seguir suas diretrizes locais de ética animal.
NOTA: Este protocolo descreve em detalhes como isolar FAPs e MuSCs de músculos tibialis anteriores (TA) lesionados de camundongos adultos masculin...

<ol>
	<li>Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+as+a+&amp;#34;mediator&amp;#34;+of+systemic+metabolism.">Muscle as a &amp;#34;mediator&amp;#34; of systemic metabolism.</a> Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).</li><li>Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+and+skeletal+muscle+regeneration.">Satellite cells and skeletal muscle regeneration.</a> Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).</li><li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells.">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).</li><li>Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+satellite+cell+contribution+to+uninjured+adult+muscle+fibers.">Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers.</a> Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).</li><li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+injury+activates+resident+fibro/adipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis.">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle.">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li><li>Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+roles+of+muscle-resident+fibro-adipogenic+progenitors+in+health,+regeneration,+neuromuscular+disorders,+and+aging.">Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging.</a> Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).</li><li>Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle.">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+progenitors+resident+in+the+skeletal+muscle+interstitium+exhibit+robust+BMP-dependent+osteogenic+activity+and+mediate+heterotopic+ossification.">Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).</li><li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+tissue-resident+PDGFR&#945;++fibro-adipogenic+progenitors+spontaneously+acquire+osteogenic+phenotype+in+an+altered+inflammatory+environment.">Murine tissue-resident PDGFR&#945;+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).</li><li>Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-adipogenic+progenitors+cross-talk+in+skeletal+muscle:+The+social+network.">Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).</li><li>Lemos, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nilotinib+reduces+muscle+fibrosis+in+chronic+muscle+injury+by+promoting+TNF-mediated+apoptosis+of+fibro/adipogenic+progenitors.">Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors.</a> Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).</li><li>Malecova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cellular+states+of+fibro-adipogenic+progenitors+during+myogenesis+and+muscular+dystrophy.">Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 9, 3670 (2018).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).</li><li>Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs):+Isolation+by+FACS+and+culture.">Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture.</a> Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).</li><li>Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+differentiation+of+fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs)+from+skeletal+muscle.">Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).</li><li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms.">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li><li>Contreras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+TGF-&#946;+and+PDGFR&#945;+signaling+pathways+regulates+the+fate+of+stromal+fibro-adipogenic+progenitors.">Cross-talk between TGF-&#946; and PDGFR&#945; signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors.</a> Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).</li><li>Holmes, C., Stanford, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Stem+cell+antigen-1:+Expression,+function,+and+enigma.">Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma.</a> Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).</li><li>Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HGFA+Is+an+injury-regulated+systemic+factor+that+induces+the+transition+of+stem+cells+into+GAlert.">HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert.</a> Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).</li><li>Garc&#237;a-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+maintains+a+genuine+muscle+stem-cell+quiescent+state+until+geriatric+age.">FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).</li><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterioration+and+variability+of+highly+purified+collagenase+blends+used+in+clinical+islet+isolation.">Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation.</a> Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).</li><li>Walls, P. L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+potential+for+bursting+bubbles+to+damage+suspended+cells.">Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li><li>Kafadar, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sca-1+expression+is+required+for+efficient+remodeling+of+the+extracellular+matrix+during+skeletal+muscle+regeneration.">Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration.</a> Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).</li></ol>

Estabelecer protocolos eficientes e reprodutíveis para a identificação e isolamento de populações de células-tronco adultas puras é o primeiro e mais crítico passo para entender sua função. FaPs isolados e MuSCs podem ser usados para realizar análises multiômicas em experimentos de transplante como um tratamento potencial para doenças musculares ou podem ser geneticamente modificados para modelagem de doenças na terapia celular-tronco. 
O protocolo descrito aqui fornece diretrize...

O músculo esquelético é o maior tecido do corpo, respondendo por ~40% do peso humano adulto, e é responsável por manter a postura, gerar movimento, regular o metabolismo de energia basal e a temperatura corporal1. O músculo esquelético é um tecido altamente dinâmico e possui uma notável capacidade de adaptação a uma variedade de estímulos, como estresse mecânico, alterações metabólicas e fatores ambientais diários. Além disso, o músculo esquelético se regenera em resposta a lesões agudas, levando à restauração completa de sua morfologia e funções2. A plasticidade muscular esquelética depende principalmente de uma população de células-tronco musculares residentes (MuSCs), também denominadas células satélites, que estão localizadas entre a membrana plasmática de miofibra e a lamina basal 2,3. Em condições normais, os MuSCs residem no nicho muscular em um estado quiescente, com apenas algumas divisões para compensar a rotatividade celular e repor a piscina de células-tronco4. Em resposta à lesão, os MuSCs entram no ciclo celular, proliferam e contribuem para a formação de novas fibras musculares ou retornam ao nicho em um processo de auto-renovação 2,3. Além dos MuSCs, a manutenção homeostática e a regeneração do músculo esquelético contam com o apoio de uma população de células residentes musculares chamadas progenitoras fibro-adipogênicas (FAPs)5,6,7. As FAPs são células estromamicanas mesenquimais incorporadas no tecido conjuntivo muscular e capazes de diferenciar-se ao longo da linhagem fibrogênica, adipogênica, osteogênica ou condrogênica 5,8,9,10. Os FAPs fornecem suporte estrutural para muSCs, pois são uma fonte de proteínas de matriz extracelular no nicho de células-tronco musculares. As FAPs também promovem a manutenção a longo prazo do músculo esquelético, secretando citocinas e fatores de crescimento que fornecem suporte trófico para a miogênese e crescimento muscular 6,11. Após lesão muscular aguda, as FAPs proliferam rapidamente para produzir um nicho transitório que suporte a integridade estrutural do músculo regenerador e forneça um ambiente favorável para sustentar a proliferação e diferenciação dos MuSCs de forma paracrina5. À medida que a regeneração prossegue, as FAPs são liberadas do músculo regenerativo por apoptose, e seus números gradualmente retornam ao nível basal12. No entanto, em condições que favorecem lesões musculares crônicas, as FAPs substituem a sinalização pró-apoptótica e se acumulam no nicho muscular, onde se diferenciam em fibroblastos e adipócitos produtores de colágeno, levando a infiltrações de gordura ectópica e formação de cicatrizes fibrosas12,13.
Devido à sua multipotência e suas habilidades regenerativas, FAPs e MuSCs foram identificados como alvos prospectivos na medicina regenerativa para o tratamento de distúrbios musculares esqueléticos. Portanto, para investigar sua função e potencial terapêutico, é importante estabelecer protocolos eficientes e reprodutíveis para o isolamento e cultura de FAPs e MuSCs.
A triagem celular ativada pela fluorescência (FACS) pode identificar diferentes populações celulares com base em características morfológicas, como tamanho e granularidade, e permite o isolamento específico das células com base no uso de anticorpos direcionados contra marcadores de superfície celular. Em camundongos adultos, os MuSCs expressam a molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1, também conhecido como CD106)14,15 e α7-Integrin15, enquanto os FAPs expressam o receptor do fator de crescimento derivado da plaqueta α (PDGFRα) e o antígeno de células-tronco 1 (Sca1 ou Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . No protocolo aqui descrito, os MuSCs foram identificados como CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, enquanto os FAPs foram identificados como CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Alternativamente, os camundongos PDGFRαEGFP foram empregados para isolar os FPs como CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- eventos18,19. Além disso, comparamos a sobreposição entre o sinal fluorescente das células PDGFRα-GFP+ às células identificadas pelo marcador de superfície Sca1. Nossa análise mostrou que todas as células que expressam GFP também foram positivas para o Sca1, indicando que qualquer abordagem pode ser empregada para identificação e isolamento de FAPs. Finalmente, a coloração com anticorpos marcadores específicos confirmou a pureza de cada população celular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G BD Needle 1 in. single use, sterile</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b)</td>
			<td>The University of British Columbia</td>
			<td>53-0010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD31 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSMelody Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD106 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J&#160; mouse (Female and Male)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>007669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution (1 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 40 &#181;m Cell Strainer, Blue, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Collagenase, Type II, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Dispase, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DMEM, high glucose, HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12430054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Horse Serum, New Zealand origin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse PDGF&#160;R alpha Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9624464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NCC0528893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)</td>
			<td>Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 Streptavidin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle

As células progenitoras fibro-adipogênicas (FAPs) são uma população de células mesenquimais mesenquimais (MSCs) residentes em músculos esqueléticos, capazes de diferenciar-se ao longo da linhagem fibrogênica, adipogênica, osteogênica ou condrogênica. Juntamente com células-tronco musculares (MuSCs), as FAPs desempenham um papel crítico na homeostase muscular, reparo e regeneração, mantendo e remodelando ativamente a matriz extracelular (ECM). Em condições patológicas, como danos crônicos e distrofias musculares, as FAPs passam por ativação aberrante e diferenciam-se em fibroblastos e adipócitos produtores de colágeno, levando à fibrose e infiltração gordurosa intramuscular. Assim, as FAPs desempenham um papel duplo na regeneração muscular, seja por meio da manutenção da rotatividade do MuSC e da promoção da reparação de tecidos ou contribuindo para a formação de cicatrizes fibrosas e infiltrações de gordura ectópica, que comprometem a integridade e a função do tecido muscular esquelético. Uma purificação adequada de FAPs e MuSCs é um pré-requisito para entender o papel biológico dessas células em condições fisiológicas e em condições patológicas. Aqui, descrevemos um método padronizado para o isolamento simultâneo de FAPs e MuSCs de músculos de membros de camundongos adultos usando a triagem celular ativada por fluorescência (FACS). O protocolo descreve em detalhes a dissociação mecânica e enzimática de células mononucleadas de músculos inteiros dos membros e músculos tibialis anteriores (TA) lesionados. FAPs e MuSCs são posteriormente isolados usando um classificador de células semi-automatizado para obter populações de células puras. Além disso, descrevemos um método otimizado para a cultura quiescente e ativada de FAPs e MuSCs, sozinhos ou em condições de cocultura.

Este protocolo permite o isolamento de aproximadamente um milhão de FAPs e até 350.000 MuSCs de membros traseiros não feridos de camundongos adultos do tipo selvagem (3-6 meses), correspondendo a um rendimento de 8% para FAPs e 3% para MuSCs de eventos totais. Ao classificar células de TA danificadas 7 dias após a lesão, dois a três músculos TA são agrupados para obter até 300.000 FAPs e 120.000 MuSCs, que correspondem a um rendimento de 11% e 4%, respectivamente. Os valores de pureza pós-tipo geralmente são ...

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FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle

A identificação precisa de células progenitoras fibro-adipogênicas (FAPs) e células-tronco musculares (MuSCs) é fundamental para estudar sua função biológica em condições fisiológicas e patológicas. Este protocolo fornece diretrizes para o isolamento, purificação e cultura de FAPs e MuSCs de músculos de camundongos adultos.

FACS-isolamento e Cultura de Progenitores Fibro-Adipogênicos e Células-Tronco Musculares de Músculo Esquelético não perturbado e lesionado

Fibro-adipogenic progenitor cells (FAPs) are a population of skeletal muscle-resident mesenchymal stromal cells (MSCs) capable of differentiating along ...

Este protocolo descreve um método para o isolamento simultâneo de fibro adipogênicos, progenitores e células-tronco musculares usando ativadores de fluorescência de classificação. Populações puras dessas células são um pré-requisito para entender seu papel biológico em condições fisiológicas e patológicas. Usando esta técnica, Forbes e células-tronco musculares foram identificados e isolados da axila ou músculo ferido.A alta impunidade cheia de Forbes e células-tronco musculares nos permitiram usar essas células para diferentes técnicas a jusante, como transplante de sacarina e análise de mistura lamacenta. Para começar, coloque o supino de rato eutanizado em uma almofada de dissecção e pulverize-o com 70% de etanol Para evitar contaminação use fórceps para beliscar o centro da pele da barriga do rato e cortar aproximadamente um centímetro de abertura horizontalmente. Segure as bordas da ferida e o disco no mouse puxando a abertura nas direções opostas para descobrir os músculos por baixo, exponha um lado do membro traseiro no momento.Antes de coletar músculos, Remova a gordura intermuscular entre os isquiotibiais na extremidade proximal do quadríceps para melhorar o isolamento de células progenitoras fibro adipogênicas e células-tronco musculares. Em seguida, sem danificar o tecido use fórceps afiados para quebrar e descascar a fáscia para expor os músculos tibialis anterior ou TA e extensor digitorum longus ou EDL. Execute a ponta afiada dos fórceps sob os músculos TA EDL para separar os músculos da tíbia.Corte os tendões, anexando o TA EDL ao tornozelo e, ao segurá-lo com fórceps, corte os músculos com uma tesoura ao longo da linha longitudinal do TA EDL. Corte os tendões ao redor do joelho para desprender todos os músculos TA EDL. Coloque os músculos em uma antena de seis centímetros mantida no gelo.Para isolar os músculos gastrocnemius cortar todos os tendões no tornozelo e desprender os músculos da tíbia e da fíbula. Corte ao redor do joelho e transfira os músculos para o prato. Retire a fáscia ao redor do quadríceps e separe-a do fêmur, executando a ponta afiada dos fórceps entre o músculo e o osso.Corte os tendões ao redor do joelho e corte o resto do músculo cortando ao longo do fêmur enquanto segura o quadríceps com fórceps na extremidade distal. Coloque os músculos na antena de seis centímetros. Retire os tendões e os músculos remanescentes ao redor do fêmur e transfira-os para o prato.Colete os músculos do membro traseiro em um prato mantido no gelo. Aspirar lavar médio do prato e adicionar um a dois mililitros de tampão de dissociação muscular para manter os músculos úmidos. Em seguida, pique os músculos use minuciosamente um bisturi para rasgar e cortar o músculo e, em seguida, use uma tesoura para continuar cortando o músculo em pequenos pedaços por um a dois minutos até obter uma pasta de chorume de tecido bem picado.Em seguida, transfira os músculos picados para o tubo cônico contendo tampão de dissociação muscular. Sele os tubos com filme de laboratório e incuba em um banho de água de 37 graus Celsius com agitação por uma hora. Após uma hora, retire o tubo do agitador e encha-o a 50 mililitros Com meio de lavagem, inverta suavemente o tubo duas vezes para garantir a mistura.Centrifugar as células em um rotor de balde balançando a 250 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Transfira 42 mililitros de supernascentes em dois novos tubos e deixe oito mililitros no tubo original. Encha os novos tubos contendo 21 mililitros do supernatante até 50 mililitros com meio de lavagem.Em seguida, centrifugar as células a 350 vezes G por oito minutos a quatro graus Celsius. Aspire o supernatante e mantenha as pelotas no gelo. Em seguida, adicione um mililitro de colagens dois estoques e um mililitro de estoque baseado em dis no tubo original contendo oito mililitros de tampão de dissociação muscular.Usando uma pipeta serológica de cinco mililitros resuspensa a pelota 10 vezes sem entupimento. Ejete a solução em direção à parede do tubo, evitando as bolhas de formação. Sele os tubos com filme de laboratório e incuba em um banho de água de 37 graus Celsius com agitação por 30 minutos.Após 30 minutos, retire o tubo do shaker aspirado e ejete a suspensão muscular 10 vezes através de uma seringa de 10 mililitros com uma agulha de calibre 20, encha cada tubo até 50 mililitros com meio de lavagem e inverta o tubo. Em seguida, centrífugas a 250 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius e transfira o supernante para um novo tubo. Deixando oito mililitros no tubo original.Encha o novo tubo até 50 mililitros com meio de lavagem, novamente centrifugar as células a 350 vezes G por oito minutos a quatro graus Celsius. Remova o supernatante e mantenha a pelota no gelo. Coloque um coador de células de nylon de 40 mícrons no tubo cônico original de 50 mililitros contendo oito mililitros de lavagem média e pré-molhado o coador com um a dois mililitros de meio de lavagem.Enquanto segura o coador, use uma pipeta de 10 mililitros para resuspencar a pelota suavemente. Filtre a suspensão através do coador celular de volta para o mesmo tubo para minimizar a perda celular. Filtre as outras pelotas do tubo de volta para o tubo original adicionando quatro a cinco mililitros de meio de lavagem a cada tubo para resuspensar as pelotas e transferir a solução para o auto coador posicionado no tubo original.Depois de coletar todas as pelotas no tubo original de 50 mililitros enxágue o coador auto com mais quatro a cinco mililitros de meio de lavagem. Use uma pipeta de 1000 microliter para coletar todo o líquido da parte inferior do coador. Encha cada tubo com meio de lavagem até 50 mililitros e inverta o tubo.Centrifugar o tubo a 250 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Remova o supernatante imediatamente sem perturbar a pelota e resuspenja a pelota em 600 microliters de meio de lavagem. Transfira a suspensão para um tubo micro centrífuga de dois mililitros.Adicione anticorpos CD 31 APC CD 45 APC SCA um Pacific Blue VCAM uma biotina e alfa sete Integrin PE em um tubo de dois milímetros contendo suspensão celular. Misture suavemente e incuba as células em um shaker rotativo a quatro graus Celsius por 45 minutos protegendo-as da luz. Após a incubação, encha todos os tubos até dois mililitros com meio de lavagem e centrífuga a 250 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Remova o supernatante e resuspenja a pelota em 300 microliters de meio de lavagem. Em seguida, adicione anticorpo streptavidin em tubos e incuba as células em um agitador rotativo a quatro graus Celsius por 20 minutos. Após a incubação, encha os tubos contendo anticorpo streptavidin a dois mililitros com meio de lavagem.Em seguida, centrifugar os tubos e aspirar o supernasal completamente. Após a segunda lavagem, resuspenja as células no tubo experimental em 500 microliters de meio de lavagem. Pré-molhado uma tampa de coador celular de um tubo inferior redondo de poliestireno de cinco mililitros com 200 microliters de meio de lavagem.Transfira a suspensão celular do tubo experimental para o tubo de fundo redondo de poliestireno de cinco mililitros e deixe filtrar por gravidade. Imprima o tubo de dois mililitros contendo a suspensão experimental da amostra com 300 microliters de meio de lavagem e passe-o através da mesma tampa do filtro. Use uma pipeta de 200 microliter para coletar todo o líquido da parte inferior do coador celular.Sele com uma tampa, deixe tubos no gelo e proteja-os da luz. A estratégia de gating adotada para o isolamento de progenitores fibro adipogênicos e células-tronco musculares é mostrada aqui. O PD GFR alfa E G F P knock in reporter mice expressa o gene de fusão H two B E G F P do lócus alfa PD G FFR, permitindo rotulagem eficiente e específica da linhagem alfa PD G GFR.A pureza das populações celulares isoladas foi confirmada pela coloração imuno-cultura GFP progenitora progenitora progenia adipogênica e células-tronco musculares com anticorpos PAC-sete. O progenitor adipogênico fibro adipogênico GFP não expressou o marcador PAC-seven, enquanto as células-tronco musculares reagiram com este anticorpo. Todas as células de expressão de GFP foram positivas para SCA um e negativas para CD 31, CD 45 VCAM um e alfa sete integrin.O progenitor adipogênico fibro e células-tronco musculares isolados de camundongos feridos com injeções intramusculares sem toxina sete dias após a lesão são mostrados. À medida que as células-tronco musculares são ativadas, um aumento no tamanho celular. É importante ajustar os parâmetros F SCA e SS CA e expandir o portão para incluir essas células no centro.Quantificação de progenitora fibro adipogênica e células-tronco musculares em músculos não feridos e sete dias de músculos TA pós-lesão são mostrados aqui. Embora o pico e a proliferação tenham sido observados entre os dias dois e três, uma baixa taxa de células proliferadoras ainda era apreciável sete dias após a lesão. Realizar um bom picar o músculo é de fundamental importância para liberar uma única célula.Além disso, o isolamento celular mononucleotídeo é alcançado executando a suspensão a uma seringa de 10 mililitros com uma agulha calibre 20. Essa técnica ajudará os cientistas a estudar o perfil histórico transcricional e epigenômico da Forbes e células-tronco musculares em condições normais e durante os estágios mais profundos da regeneração muscular.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Biologia do Desenvolvimento

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Cultura Vivo de Pharyngeal Arcos para estudo do coração e do músculo Progenitores e seu nicho

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para alta taxa de transferência de microplacas respiratórias Medições

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Indução da Aguda Skeletal regeneração muscular por cardiotoxina Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Preparação e cultivo de células precursoras Miogênica / mioblastos primárias de músculo esquelético de Adulto e Idoso Humanos

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Avaliação da senescência induzida por lesão e na Vivo reprogramação no músculo esquelético

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolamento, cultura e diferenciação de células do estroma da medula óssea e osteoclasto progenitores dos ratos

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Aplicação da estimulação crônica para estudar ratos induzida pela atividade contrátil adaptações fenotípica de músculo esquelético

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identificação de células satélite de músculo esquelético por imunofluorescência com anticorpos de laminina e Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...