Name: facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-06-08T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Тома Чунга (Гонконгский университет науки и технологии) за советы по изоляции MuSC. Эта работа финансировалась NIAMS-IRP через гранты NIH AR041126 и AR041164.

Все проведенные эксперименты на животных проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами, утвержденными Комитетом по уходу за животными и их использованию (ACUC) Национального института артрита, опорно-двигательного аппарата и кожных заболеваний (NIAMS). Исследов...

<ol>
	<li>Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+as+a+&amp;#34;mediator&amp;#34;+of+systemic+metabolism.">Muscle as a &amp;#34;mediator&amp;#34; of systemic metabolism.</a> Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).</li><li>Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+and+skeletal+muscle+regeneration.">Satellite cells and skeletal muscle regeneration.</a> Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).</li><li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells.">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).</li><li>Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+satellite+cell+contribution+to+uninjured+adult+muscle+fibers.">Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers.</a> Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).</li><li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+injury+activates+resident+fibro/adipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis.">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle.">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li><li>Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+roles+of+muscle-resident+fibro-adipogenic+progenitors+in+health,+regeneration,+neuromuscular+disorders,+and+aging.">Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging.</a> Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).</li><li>Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle.">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+progenitors+resident+in+the+skeletal+muscle+interstitium+exhibit+robust+BMP-dependent+osteogenic+activity+and+mediate+heterotopic+ossification.">Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).</li><li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+tissue-resident+PDGFR&#945;++fibro-adipogenic+progenitors+spontaneously+acquire+osteogenic+phenotype+in+an+altered+inflammatory+environment.">Murine tissue-resident PDGFR&#945;+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).</li><li>Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-adipogenic+progenitors+cross-talk+in+skeletal+muscle:+The+social+network.">Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).</li><li>Lemos, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nilotinib+reduces+muscle+fibrosis+in+chronic+muscle+injury+by+promoting+TNF-mediated+apoptosis+of+fibro/adipogenic+progenitors.">Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors.</a> Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).</li><li>Malecova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cellular+states+of+fibro-adipogenic+progenitors+during+myogenesis+and+muscular+dystrophy.">Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 9, 3670 (2018).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).</li><li>Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs):+Isolation+by+FACS+and+culture.">Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture.</a> Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).</li><li>Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+differentiation+of+fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs)+from+skeletal+muscle.">Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).</li><li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms.">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li><li>Contreras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+TGF-&#946;+and+PDGFR&#945;+signaling+pathways+regulates+the+fate+of+stromal+fibro-adipogenic+progenitors.">Cross-talk between TGF-&#946; and PDGFR&#945; signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors.</a> Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).</li><li>Holmes, C., Stanford, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Stem+cell+antigen-1:+Expression,+function,+and+enigma.">Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma.</a> Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).</li><li>Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HGFA+Is+an+injury-regulated+systemic+factor+that+induces+the+transition+of+stem+cells+into+GAlert.">HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert.</a> Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).</li><li>Garc&#237;a-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+maintains+a+genuine+muscle+stem-cell+quiescent+state+until+geriatric+age.">FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).</li><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterioration+and+variability+of+highly+purified+collagenase+blends+used+in+clinical+islet+isolation.">Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation.</a> Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).</li><li>Walls, P. L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+potential+for+bursting+bubbles+to+damage+suspended+cells.">Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li><li>Kafadar, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sca-1+expression+is+required+for+efficient+remodeling+of+the+extracellular+matrix+during+skeletal+muscle+regeneration.">Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration.</a> Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).</li></ol>

Создание эффективных и воспроизводимых протоколов для идентификации и изоляции чистых популяций взрослых стволовых клеток является первым и наиболее важным шагом на пути к пониманию их функции. Изолированные FAP и MuSC могут быть использованы для проведения мультиомического анализа в э...

Скелетная мышца является самой большой тканью в организме, на которую приходится ~ 40% веса взрослого человека, и отвечает за поддержание осанки, создание движения, регулирование базального энергетического обмена и температуры тела1. Скелетные мышцы являются очень динамичной тканью и обладают замечательной способностью адаптироваться к различным раздражителям, таким как механическое напряжение, метаболические изменения и ежедневные факторы окружающей среды. Кроме того, скелетная мышца регенерирует в ответ на острую травму, что приводит к полному восстановлению ее морфологии и функций2. Пластичность скелетных мышц в основном зависит от популяции резидентных мышечных стволовых клеток (MuSC), также называемых сателлитными клетками, которые расположены между плазматической мембраной миофибры и базальной пластинкой 2,3. В нормальных условиях MuSC находятся в мышечной нише в состоянии покоя, с несколькими делениями, чтобы компенсировать клеточный оборот и пополнить пул стволовых клеток4. В ответ на травму MuSC входят в клеточный цикл, размножаются и либо способствуют образованию новых мышечных волокон, либо возвращаются в нишу в процессе самообновления 2,3. В дополнение к MuSC, гомеостатическое поддержание и регенерация скелетных мышц полагаются на поддержку популяции мышечных резидентных клеток, называемых фибро-адипогенными предшественниками (FAPs)5,6,7. ФАП представляют собой мезенхимальные стромальные клетки, встроенные в мышечную соединительную ткань и способные дифференцироваться по фиброгенной, адипогенной, остеогенной или хондрогенной линии 5,8,9,10. FAP обеспечивают структурную поддержку MuSC, поскольку они являются источником белков внеклеточного матрикса в нише мышечных стволовых клеток. FAP также способствуют долгосрочному поддержанию скелетных мышц путем секреции цитокинов и факторов роста, которые обеспечивают трофическую поддержку миогенеза и роста мышц 6,11. При остром мышечном повреждении ФАП быстро размножаются, образуя переходную нишу, которая поддерживает структурную целостность регенерирующей мышцы и обеспечивает благоприятную среду для поддержания пролиферации и дифференцировки MUSC паракринным способом5. По мере продолжения регенерации ФАПы очищаются от регенеративной мышцы апоптозом, и их количество постепенно возвращается к базальному уровню12. Однако в условиях, благоприятствующих хроническому повреждению мышц, FAP перекрывают проапоптотическую сигнализацию и накапливаются в мышечной нише, где они дифференцируются в коллаген-продуцирующие фибробласты и адипоциты, что приводит к инфильтратам эктопического жира и образованию фиброзных рубцов12,13.
Из-за их мультипотентности и регенеративных способностей FAP и MuSC были идентифицированы как перспективные мишени в регенеративной медицине для лечения заболеваний скелетных мышц. Поэтому для исследования их функции и терапевтического потенциала важно установить эффективные и воспроизводимые протоколы для выделения и культивирования ФАПов и MUSC.
Флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS) может идентифицировать различные клеточные популяции на основе морфологических характеристик, таких как размер и гранулярность, и позволяет выделять специфические клетки на основе использования антител, направленных против маркеров клеточной поверхности. У взрослых мышей MuSC экспрессируют молекулу адгезии сосудистых клеток 1 (VCAM-1, также известную как CD106)14,15 и α7-интегрин15, в то время как FAP экспрессируют рецептор фактора роста тромбоцитов α (PDGFRα) и антиген стволовых клеток 1 (Sca1 или Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . В описанном здесь протоколе MuSC были идентифицированы как CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, в то время как FAP были идентифицированы как CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Альтернативно, мыши PDGFRαEGFP использовали для выделения FAP как CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-events18,19. Кроме того, мы сравнили перекрытие между флуоресцентным сигналом клеток PDGFRα-GFP+ с клетками, идентифицированными поверхностным маркером Sca1. Наш анализ показал, что все GFP-экспрессирующие клетки также были положительными для Sca1, что указывает на то, что любой подход может быть использован для идентификации и изоляции FAP. Наконец, окрашивание специфическими маркерными антителами подтвердило чистоту каждой клеточной популяции.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G BD Needle 1 in. single use, sterile</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b)</td>
			<td>The University of British Columbia</td>
			<td>53-0010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD31 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSMelody Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD106 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J&#160; mouse (Female and Male)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>007669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution (1 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 40 &#181;m Cell Strainer, Blue, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Collagenase, Type II, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Dispase, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DMEM, high glucose, HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12430054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Horse Serum, New Zealand origin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse PDGF&#160;R alpha Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9624464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NCC0528893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)</td>
			<td>Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 Streptavidin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle

Фибро-адипогенные клетки-предшественники (ФАП) представляют собой популяцию скелетных мышечных мезенхимальных стромальных клеток (МСК), способных дифференцироваться по фиброгенной, адипогенной, остеогенной или хондрогенной линии. Вместе с мышечными стволовыми клетками (MuSC) FAP играют решающую роль в гомеостазе мышц, восстановлении и регенерации, активно поддерживая и реконструируя внеклеточный матрикс (ECM). При патологических состояниях, таких как хронические повреждения и мышечные дистрофии, ФАП подвергаются аберрантной активации и дифференцируются в коллаген-продуцирующие фибробласты и адипоциты, что приводит к фиброзу и внутримышечной жировой инфильтрации. Таким образом, ФАП играют двойную роль в регенерации мышц, либо поддерживая оборот MuSC и способствуя восстановлению тканей, либо способствуя образованию фиброзных рубцов и внематочных жировых инфильтратов, которые ставят под угрозу целостность и функцию скелетной мышечной ткани. Правильная очистка ФАПов и MuSC является необходимым условием для понимания биологической роли этих клеток как в физиологических, так и в патологических состояниях. Здесь мы описываем стандартизированный метод одновременного выделения FAP и MuSC из мышц конечностей взрослых мышей с использованием флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). Протокол подробно описывает механическую и ферментативную диссоциацию мононуклеарных клеток из целых мышц конечностей и травмированных передних (ТА) мышц большеберцовой кости. FAP и MuSC впоследствии изолируются с помощью полуавтоматического клеточного сортировщика для получения чистых клеточных популяций. Дополнительно описан оптимизированный метод культивирования покоящихся и активированных ФАПов и MUSC, либо отдельно, либо в условиях кокультуры.

Этот протокол позволяет выделить около одного миллиона FAP и до 350 000 MuSC из неповрежденных задних конечностей взрослых мышей дикого типа (3-6 месяцев), что соответствует выходу 8% для FAP и 3% для MuSC от общего числа событий. При сортировке клеток из поврежденных ТА через 7 дней после травмы две-т?...

Watch this Scientific Journal Video about FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle

Точная идентификация фибро-адипогенных клеток-предшественников (FAPs) и мышечных стволовых клеток (MuSC) имеет решающее значение для изучения их биологической функции в физиологических и патологических состояниях. Этот протокол содержит рекомендации по выделению, очистке и культивированию ФАПов и MUSC из мышц взрослых мышей.

FACS-изоляция и культура фибро-адипогенных предшественников и мышечных стволовых клеток из невозмутимых и поврежденных скелетных мышц мыши

Fibro-adipogenic progenitor cells (FAPs) are a population of skeletal muscle-resident mesenchymal stromal cells (MSCs) capable of differentiating along ...

Этот протокол описывает метод одновременного выделения фиброадипогенных, прогениторных и мышечных стволовых клеток с использованием флуоресцентных активаторов сортировки. Чистые популяции этих клеток являются предпосылкой для понимания их биологической роли в физиологических и патологических состояниях. Используя эту технику, Forbes и мышечные стволовые клетки были идентифицированы и выделены либо из подмышечной впадины, либо из поврежденной мышцы.Высокая безнаказанность Forbes и мышечных стволовых клеток позволила нам использовать эти клетки для различных методов, таких как трансплантация сахарина и анализ мудиальной смеси. Для начала поместите усыпленную мышь лежа на спине на подушечке для рассечения и опрыскайте ее 70% этанолом Чтобы избежать загрязнения, используйте щипцы, чтобы защипать центр кожи живота мыши и разрезать примерно на один сантиметр отверстие горизонтально. Захватите края раны и диск в мыши, потянув отверстие в противоположных направлениях, чтобы раскрыть мышцы под ним, обнажите одну сторону задней конечности в то время.Перед сбором мышц удалите межмышечный жир между подколенными сухожилиями в проксимальном конце квадрицепсов, чтобы улучшить выделение фиброадипогенных клеток-предшественников и мышечных стволовых клеток. Затем, не повреждая ткань, используйте острые щипцы, чтобы сломать и отклеить фасцию, чтобы обнажить нижнюю часть большеберцовой кости передней или ТА и разгибатель digitorum longus или EDL мышцы. Запустите острый кончик щипцов под мышцами TA EDL, чтобы отделить мышцы от большеберцовой кости.Отрежьте сухожилия, прикрепив TA EDL к лодыжке и, удерживая ее щипцами, обрежьте ножницами мышцы вдоль продольной линии TA EDL. Отрежьте сухожилия вокруг колена, чтобы отделить все мышцы TA EDL. Поместите мышцы в шестисантиметровое блюдо, хранящееся на льду.Для изоляции икроножных мышц отрежьте все сухожилия на лодыжке и отделите мышцы от большеберцовой и малоберцовой костей. Обрежьте вокруг колена и перенесите мышцы к блюду. Очистите фасцию вокруг квадрицепсов и отделите ее от бедренной кости, проведя острым кончиком щипцов между мышцей и костью.Обрежьте сухожилия вокруг колена и обрежьте остальную часть мышцы, разрезав вдоль бедренной кости, удерживая квадрицепсы щипцами на дистальном конце. Поместите мышцы в шестисантиметровое блюдо. Отсоедините подколенные сухожилия и оставшиеся мышцы вокруг бедренной кости и перенесите их в блюдо.Соберите мышцы задних конечностей в блюдо, хранящееся на льду. Аспират смойте среду из посуды и добавьте один-два миллилитра буфера диссоциации мышц, чтобы сохранить мышцы влажными. Затем тщательно измельчите мышцы Используйте скальпель, чтобы разорвать и разрезать мышцу, а затем используйте ножницы, чтобы продолжать разрезать мышцу на мелкие кусочки в течение одной-двух минут до получения суспензионной пасты из хорошо измельченной ткани.Затем переместите измельченные мышцы в коническую трубку, содержащую буфер диссоциации мышц. Запечатайте пробирки лабораторной пленкой и высиживайте на водяной бане 37 градусов Цельсия с перемешиванием в течение одного часа. Через час извлеките трубку из шейкера и заполните ее до 50 миллилитров С помощью моющего средства осторожно переверните трубку дважды, чтобы обеспечить перемешивание.Центрифугируйте ячейки в качающемся роторе ведра при 250 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Переложите 42 миллилитра супернатанта в две новые трубки и оставьте восемь миллилитров в исходной трубке. Наполните новые пробирки, содержащие 21 миллилитр супернатанта до 50 миллилитров, моющей средой.Затем центрифугируют клетки в 350 раз G в течение восьми минут при четырех градусах Цельсия. Аспирируйте супернатант и держите гранулы на льду. Затем добавьте один миллилитр коллагеназ, два запаса и один миллилитр дис-основе в оригинальную трубку, содержащую восемь миллилитров буфера диссоциации мышц.С помощью пятимиллилитровой серологической пипетки повторно суспендируют гранулу 10 раз без засорения. Выталкивайте раствор к стенке трубки, избегая образования пузырьков. Запечатайте пробирки лабораторной пленкой и вынашивайте на водяной бане 37 градусов Цельсия с перемешиванием в течение 30 минут.Через 30 минут извлеките трубку из шейкера аспирата и вытолкните мышечную суспензию 10 раз через шприц объемом 10 миллилитров с помощью иглы 20 калибра, заполните каждый тюбик до 50 миллилитров моющей средой и переверните трубку. Затем центрифугируют в 250 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и переносят супернатант в новую трубку. Оставляя восемь миллилитров в оригинальной трубке.Заполните новую трубку до 50 миллилитров моющей средой, снова центрифугируйте ячейки в 350 раз G в течение восьми минут при четырех градусах Цельсия. Удалите супернатант и держите гранулу на льду. Поместите 40-микронный нейлоновый клеточный сетчатый фильтр в оригинальную коническую трубку размером 50 миллилитров, содержащую восемь миллилитров моющей среды, и предварительно смочите ситечко с одним-двумя миллилитрами моющей среды.Удерживая ситечко, используйте 10-миллилитровую пипетку, чтобы аккуратно повторно использовать гранулу. Фильтруйте суспензию через клеточный сетчатый фильтр обратно в ту же трубку, чтобы свести к минимуму потерю клеток. Отфильтруйте другие гранулы трубки обратно в исходную трубку, добавив четыре-пять миллилитров промывочной среды в каждую трубку, чтобы повторно суспендировать гранулы и перенести раствор в самосектор, расположенный в исходной трубке.После сбора всех гранул в оригинальную 50-миллилитровую трубку промойте самосетчатый фильтр еще четырьмя-пятью миллилитрами промывочной среды. Используйте пипетку объемом 1000 микролитров, чтобы собрать всю жидкость с нижней стороны ситечка. Наполните каждый тюбик промывочной средой до 50 миллилитров и переверните трубку.Центрифугируйте трубку в 250 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Немедленно удалите супернатант, не нарушая гранулу, и повторно суспендируйте гранулу в 600 микролитрах моющей среды. Перенесите суспензию в двухмиллилитровую микроцентрифужную трубку.Добавьте антитела CD 31 APC CD 45 APC SCA один Pacific Blue VCAM один биотин и альфа семь Integrin PE в двухмиллиметровую трубку, содержащую клеточную суспензию. Осторожно перемешайте и инкубируйте клетки во вращающемся шейкере при четырех градусах Цельсия в течение 45 минут, защищая их от света. После инкубации заполните все пробирки до двух миллилитров моющей средой и центрифугой в 250 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 300 микролитров моющей среды. Затем добавьте антитело к стрептавидину в пробирки и инкубируйте клетки во вращающемся шейкере при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. После инкубации наполните пробирки, содержащие антитело стрептавидина, до двух миллилитров промывной средой.Затем центрифугируйте трубки и полностью аспирируйте супернатант. После второй промывки повторно суспендируют клетки в экспериментальной трубке в 500 микролитрах промывочной среды. Предварительно смочите крышку клеточного сетчатого фильтра из пятимиллилитровой полистирольной трубки круглого дна с 200 микролитрами промывочной среды.Переместите клеточную суспензию из экспериментальной трубки в пятимиллилитровую полистирольную трубку круглого дна и дайте ей фильтровать под действием силы тяжести. Распечатайте двухмиллилитровую трубку, содержащую экспериментальный образец суспензии с 300 микролитрами промывочной среды, и пропустите ее через тот же колпачок сетчатого фильтра. Используйте пипетку на 200 микролитров, чтобы собрать всю жидкость с нижней стороны клеточного ситечка.Запечатайте колпачком, оставьте трубки на льду и защитите их от света. Стратегия гатинга, принятая для выделения фиброадипогенных предшественников и мышечных стволовых клеток, показана здесь. PD GFR alpha E G F P knock у репортерных мышей экспрессирует ген слияния H two B E G F P из эндогенного альфа-локуса PD G FFR, что позволяет эффективно и специфично маркировать альфа-линию PD G GFR.Чистота изолированных клеточных популяций была подтверждена иммунокоррастацией GFP-положительных фиброадипогенных предшественников и мышечных стволовых клеток антителами PAC-seven. GFP-положительный фиброадипогенный предшественник не экспрессировал маркер PAC-seven, в то время как мышечные стволовые клетки реагировали с этим антителом. Все клетки, экспрессирующие GFP, были положительными для SCA one и отрицательными для CD 31, CD 45 VCAM one и альфа-семь интегрина.Показаны фиброадипогенные предшественники и мышечные стволовые клетки, выделенные у мышей, травмированных внутримышечными инъекциями без токсина через семь дней после травмы. По мере активации мышечных стволовых клеток происходит увеличение размера клеток. Важно настроить параметры F SCA и SS CA и расширить ворота, включив эти ячейки в центр.Здесь показана количественная оценка фиброадипогенных предшественников и мышечных стволовых клеток в неповрежденных и семидневных после травмированных та-мышцах. Хотя пик и пролиферация наблюдались между вторым и третьим днями, низкая скорость пролиферации клеток все еще была заметна через семь дней после травмы. Выполнение правильного измельчения мышц имеет решающее значение для высвобождения отдельных клеток.Кроме того, изоляция мононуклеотидных клеток достигается путем запуска суспензии на 10-миллилитровый шприц с 20-калибровочной иглой. Эта методика поможет ученым изучить биологический транскрипционный и эпигеномный профиль Forbes и мышечных стволовых клеток в нормальном состоянии и на более глубоких этапах регенерации мышц.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Выделение и количественный Иммуноцитохимическая Характеристика первичных Миогенные клеток и фибробластов из человеческих скелетных мышц

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Экс Vivo культуры глотки Арки для изучения Сердце и мышцы предшественников и свою нишу

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Использование изолированными митохондриями из минимальных количествах мыши скелетных мышц для Высокая пропускная MICROPLATE респираторных измерений

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Индукция Острый скелетных мышц регенерации путем инъекций Cardiotoxin

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Подготовка и культура Миогенный прогениторных клеток / Первичные миобластов из скелетной мышце взрослых и выдержана Людей

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Оценка травмы индуцированного старения и в естественных условиях перепрограммирования в скелетных мышцах

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Изоляция, культура и дифференцировки клеток стромы костного мозга и остеокластов прародителей от мышей

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Применение хронической стимуляции для изучения сократительной активности индуцированной крыса скелетных мышц Фенотипическая адаптация

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Идентификации Спутниковое клеток скелетных мышц, иммунофлюоресценции с Pax7 и Ламинин антител

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...