Name: facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-06-08T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a Tom Cheung (Universidad de Ciencia y Tecnología de Hong Kong) por su asesoramiento sobre el aislamiento de MuSC. Este trabajo fue financiado por el NIAMS-IRP a través de las subvenciones de los NIH AR041126 y AR041164.

Todos los experimentos con animales realizados se realizaron de acuerdo con las pautas institucionales aprobadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales (ACUC) del Instituto Nacional de Artritis, Musculoesquelético y Enfermedades de la Piel (NIAMS). Los investigadores que realizan este protocolo deben cumplir con sus pautas locales de ética animal.
NOTA: Este protocolo describe en detalle cómo aislar FAPs y MuSCs de las extremidades posteriores y los músculos lesionados del tibial ante...

<ol>
	<li>Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+as+a+&amp;#34;mediator&amp;#34;+of+systemic+metabolism.">Muscle as a &amp;#34;mediator&amp;#34; of systemic metabolism.</a> Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).</li><li>Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+and+skeletal+muscle+regeneration.">Satellite cells and skeletal muscle regeneration.</a> Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).</li><li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells.">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).</li><li>Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+satellite+cell+contribution+to+uninjured+adult+muscle+fibers.">Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers.</a> Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).</li><li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+injury+activates+resident+fibro/adipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis.">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle.">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li><li>Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+roles+of+muscle-resident+fibro-adipogenic+progenitors+in+health,+regeneration,+neuromuscular+disorders,+and+aging.">Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging.</a> Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).</li><li>Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle.">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+progenitors+resident+in+the+skeletal+muscle+interstitium+exhibit+robust+BMP-dependent+osteogenic+activity+and+mediate+heterotopic+ossification.">Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).</li><li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+tissue-resident+PDGFR&#945;++fibro-adipogenic+progenitors+spontaneously+acquire+osteogenic+phenotype+in+an+altered+inflammatory+environment.">Murine tissue-resident PDGFR&#945;+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).</li><li>Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-adipogenic+progenitors+cross-talk+in+skeletal+muscle:+The+social+network.">Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).</li><li>Lemos, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nilotinib+reduces+muscle+fibrosis+in+chronic+muscle+injury+by+promoting+TNF-mediated+apoptosis+of+fibro/adipogenic+progenitors.">Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors.</a> Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).</li><li>Malecova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cellular+states+of+fibro-adipogenic+progenitors+during+myogenesis+and+muscular+dystrophy.">Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 9, 3670 (2018).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).</li><li>Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs):+Isolation+by+FACS+and+culture.">Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture.</a> Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).</li><li>Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+differentiation+of+fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs)+from+skeletal+muscle.">Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).</li><li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms.">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li><li>Contreras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+TGF-&#946;+and+PDGFR&#945;+signaling+pathways+regulates+the+fate+of+stromal+fibro-adipogenic+progenitors.">Cross-talk between TGF-&#946; and PDGFR&#945; signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors.</a> Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).</li><li>Holmes, C., Stanford, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Stem+cell+antigen-1:+Expression,+function,+and+enigma.">Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma.</a> Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).</li><li>Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HGFA+Is+an+injury-regulated+systemic+factor+that+induces+the+transition+of+stem+cells+into+GAlert.">HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert.</a> Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).</li><li>Garc&#237;a-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+maintains+a+genuine+muscle+stem-cell+quiescent+state+until+geriatric+age.">FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).</li><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterioration+and+variability+of+highly+purified+collagenase+blends+used+in+clinical+islet+isolation.">Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation.</a> Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).</li><li>Walls, P. L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+potential+for+bursting+bubbles+to+damage+suspended+cells.">Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li><li>Kafadar, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sca-1+expression+is+required+for+efficient+remodeling+of+the+extracellular+matrix+during+skeletal+muscle+regeneration.">Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration.</a> Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).</li></ol>

El establecimiento de protocolos eficientes y reproducibles para la identificación y el aislamiento de poblaciones de células madre adultas puras es el primer y más crítico paso hacia la comprensión de su función. Los FAP y MuSC aislados se pueden usar para realizar análisis multiómicos en experimentos de trasplante como un tratamiento potencial para enfermedades musculares o pueden modificarse genéticamente para modelar enfermedades en la terapia con células madre. 
El protocolo des...

El músculo esquelético es el tejido más grande del cuerpo, representa ~ 40% del peso humano adulto, y es responsable de mantener la postura, generar movimiento, regular el metabolismo energético basal y la temperatura corporal1. El músculo esquelético es un tejido altamente dinámico y posee una notable capacidad para adaptarse a una variedad de estímulos, como el estrés mecánico, las alteraciones metabólicas y los factores ambientales diarios. Además, el músculo esquelético se regenera en respuesta a una lesión aguda, lo que lleva a la restauración completa de su morfología y funciones2. La plasticidad del músculo esquelético se basa principalmente en una población de células madre musculares residentes (MuSC), también denominadas células satélite, que se encuentran entre la membrana plasmática de miofibras y la lámina basal 2,3. En condiciones normales, los MuSC residen en el nicho muscular en estado quiescente, con sólo unas pocas divisiones para compensar la renovación celular y para reponer el conjunto de células madre4. En respuesta a la lesión, los MuSCs entran en el ciclo celular, proliferan y contribuyen a la formación de nuevas fibras musculares o regresan al nicho en un proceso de auto-renovación 2,3. Además de los MuSCs, el mantenimiento homeostático y la regeneración del músculo esquelético dependen del apoyo de una población de células musculares residentes denominadas progenitores fibroadipogénicos (PAF)5,6,7. Los FAP son células estromales mesenquimales incrustadas en el tejido conectivo muscular y capaces de diferenciarse a lo largo del linaje fibrogénico, adipogénico, osteogénico o condrogénico 5,8,9,10. Los FAP proporcionan soporte estructural para los MuSC, ya que son una fuente de proteínas de la matriz extracelular en el nicho de las células madre musculares. Las PAF también promueven el mantenimiento a largo plazo del músculo esquelético mediante la secreción de citoquinas y factores de crecimiento que proporcionan apoyo trófico para la miogénesis y el crecimiento muscular 6,11. Tras la lesión muscular aguda, los FAPs proliferan rápidamente para producir un nicho transitorio que apoya la integridad estructural del músculo regenerador y proporciona un ambiente favorable para sostener la proliferación y diferenciación de MuSCs de manera paracrina5. A medida que avanza la regeneración, los FAP se eliminan del músculo regenerativo por apoptosis, y su número regresa gradualmente al nivel basal12. Sin embargo, en condiciones que favorecen la lesión muscular crónica, los FAP anulan la señalización proapoptótica y se acumulan en el nicho muscular, donde se diferencian en fibroblastos y adipocitos productores de colágeno, lo que lleva a infiltrados de grasa ectópica y formación de cicatrices fibróticas12,13.
Debido a su multipotencia y sus capacidades regenerativas, los FAP y MuSC han sido identificados como objetivos prospectivos en medicina regenerativa para el tratamiento de trastornos del músculo esquelético. Por lo tanto, para investigar su función y potencial terapéutico, es importante establecer protocolos eficientes y reproducibles para el aislamiento y cultivo de FAPs y MuSCs.
La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) puede identificar diferentes poblaciones celulares en función de características morfológicas como el tamaño y la granularidad, y permite el aislamiento específico de células basado en el uso de anticuerpos dirigidos contra marcadores de superficie celular. En ratones adultos, los MuSC expresan la molécula de adhesión celular vascular 1 (VCAM-1, también conocida como CD106)14,15 y α7-Integrina 15, mientras que los FAP expresan el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas α (PDGFRα) y el antígeno de células madre 1 (Sca1 o Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . En el protocolo descrito aquí, los MuSC se identificaron como CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, mientras que los FAP se identificaron como CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Alternativamente, se emplearon ratones PDGFRαEGFP para aislar FAPs como eventos CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-18,19. Además, comparamos la superposición entre la señal fluorescente de las células PDGFRα-GFP+ con las células identificadas por el marcador de superficie Sca1. Nuestro análisis mostró que todas las células que expresan GFP también fueron positivas para Sca1, lo que indica que cualquiera de los enfoques puede emplearse para la identificación y aislamiento de FAPs. Finalmente, la tinción con anticuerpos marcadores específicos confirmó la pureza de cada población celular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G BD Needle 1 in. single use, sterile</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b)</td>
			<td>The University of British Columbia</td>
			<td>53-0010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD31 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSMelody Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD106 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J&#160; mouse (Female and Male)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>007669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution (1 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 40 &#181;m Cell Strainer, Blue, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Collagenase, Type II, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Dispase, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DMEM, high glucose, HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12430054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Horse Serum, New Zealand origin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse PDGF&#160;R alpha Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9624464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NCC0528893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)</td>
			<td>Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 Streptavidin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle

Las células progenitoras fibro-adipogénicas (FAP) son una población de células estromales mesenquimales residentes en el músculo esquelético (MSC) capaces de diferenciarse a lo largo del linaje fibrogénico, adipogénico, osteogénico o condrogénico. Junto con las células madre musculares (MuSC), las FAP desempeñan un papel crítico en la homeostasis, reparación y regeneración muscular, al tiempo que mantienen y remodelan activamente la matriz extracelular (ECM). En condiciones patológicas, como daño crónico y distrofias musculares, los FAP experimentan una activación aberrante y se diferencian en fibroblastos y adipocitos productores de colágeno, lo que lleva a fibrosis e infiltración grasa intramuscular. Por lo tanto, los FAP desempeñan un doble papel en la regeneración muscular, ya sea manteniendo el recambio de MuSC y promoviendo la reparación de tejidos o contribuyendo a la formación de cicatrices fibróticas e infiltrados de grasa ectópica, que comprometen la integridad y la función del tejido muscular esquelético. Una purificación adecuada de FAPs y MuSCs es un requisito previo para comprender el papel biológico de estas células en condiciones fisiológicas y patológicas. Aquí, describimos un método estandarizado para el aislamiento simultáneo de FAP y MuSC de los músculos de las extremidades de ratones adultos utilizando la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). El protocolo describe en detalle la disociación mecánica y enzimática de células mononucleadas de músculos de extremidades enteras y músculos tibiales anteriores lesionados (TA). Los FAP y MuSC se aíslan posteriormente utilizando un clasificador celular semiautomático para obtener poblaciones celulares puras. Además, describimos un método optimizado para cultivar FAPs y MuSCs quiescentes y activados, ya sea solos o en condiciones de cocultivo.

Este protocolo permite el aislamiento de aproximadamente un millón de FAPs y hasta 350.000 MuSCs de extremidades posteriores no lesionadas de ratones adultos de tipo salvaje (3-6 meses), lo que corresponde a un rendimiento del 8% para FAPs y 3% para MuSCs del total de eventos. Al clasificar las células de TA dañadas 7 días después de la lesión, se agrupan de dos a tres músculos TA para obtener hasta 300,000 FAP y 120,000 MuSC, que corresponden a un rendimiento del 11% y 4%, respectivamente. Los valores de pureza p...

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FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle

La identificación precisa de las células progenitoras fibroadipogénicas (FAP) y las células madre musculares (MuSC) es fundamental para estudiar su función biológica en condiciones fisiológicas y patológicas. Este protocolo proporciona pautas para el aislamiento, purificación y cultivo de FAP y MuSC de músculos de ratones adultos.

FACS-aislamiento y cultivo de progenitores fibroadipogénicos y células madre musculares a partir de músculo esquelético de ratón imperturbable y lesionado

Fibro-adipogenic progenitor cells (FAPs) are a population of skeletal muscle-resident mesenchymal stromal cells (MSCs) capable of differentiating along ...

Este protocolo describe un método para el aislamiento simultáneo de células madre fibro adipogénicas, progenitoras y musculares utilizando activadores de fluorescencia de clasificación. Las poblaciones puras de estas células son un requisito previo para comprender su papel biológico en condiciones fisiológicas y patológicas. Usando esta técnica, Forbes y las células madre musculares se identificaron y aislaron de la axila o del músculo lesionado.La alta impunidad de Forbes y las células madre musculares nos ha permitido utilizar estas células para diferentes técnicas posteriores, como el trasplante de sacarina y el análisis de mezcla mudial. Para comenzar, coloque el ratón supino eutanasiado en una almohadilla de disección y rocíelo con etanol al 70% Para evitar la contaminación, use fórceps para pellizcar el centro de la piel del vientre del ratón y corte aproximadamente un centímetro abertura horizontalmente. Agarre los bordes de la herida y el disco en el ratón tirando de la abertura en las direcciones opuestas para descubrir los músculos debajo, exponer un lado de la extremidad posterior a la vez.Antes de recolectar músculos, Eliminar la grasa intermuscular entre los isquiotibiales en el extremo proximal de los cuádriceps para mejorar el aislamiento de las células progenitoras fibro adipogénicas y las células madre musculares. A continuación, sin dañar el tejido, use fórceps afilados para romper y despegar la fascia para exponer los músculos debajo del tibial anterior o TA y extensor largo de los dedos o EDL. Pase la punta afilada de los fórceps debajo de los músculos TA EDL para separar los músculos de la tibia.Corte los tendones, uniendo el TA EDL al tobillo y mientras lo sostiene con fórceps, recorte los músculos con tijeras a lo largo de la línea longitudinal del TA EDL. Corte los tendones alrededor de la rodilla para separar todos los músculos TA EDL. Coloque los músculos en un plato de seis centímetros mantenido en hielo.Para aislar los músculos gastrocnemios, corte todos los tendones del tobillo y desprenda los músculos de la tibia y el peroné. Corte alrededor de la rodilla y transfiera los músculos al plato. Despegue la fascia alrededor del cuádriceps y sepárela del fémur pasando la punta afilada de los fórceps entre el músculo y el hueso.Corte los tendones alrededor de la rodilla y recorte el resto del músculo cortando a lo largo del fémur mientras sostiene los cuádriceps con fórceps en el extremo distal. Coloque los músculos en el plato de seis centímetros. Separe los isquiotibiales y los músculos restantes alrededor del fémur y transfiéralos al plato.Reúna los músculos de las extremidades posteriores en un plato que se mantenga en hielo. Aspire el medio de lavado del plato y agregue de uno a dos mililitros de tampón de disociación muscular para mantener los músculos húmedos. A continuación, pica bien los músculos Use un bisturí para rasgar y cortar el músculo y luego use tijeras para seguir cortando el músculo en trozos pequeños durante uno o dos minutos hasta obtener una pasta de lodo de tejido bien picado.Luego transfiera los músculos picados al tubo cónico que contiene el tampón de disociación muscular. Selle los tubos con película de laboratorio e incube en un baño de agua de 37 grados centígrados con agitación durante una hora. Después de una hora, retire el tubo de la coctelera y llénelo a 50 mililitros Con el medio de lavado, invierta suavemente el tubo dos veces para asegurar la mezcla.Centrifugar las células en un rotor de cucharón oscilante a 250 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera 42 mililitros de sobrenadante en dos tubos nuevos y deje ocho mililitros en el tubo original. Llene los nuevos tubos que contienen 21 mililitros del sobrenadante hasta 50 mililitros con medio de lavado.Luego centrifugar las celdas a 350 veces G durante ocho minutos a cuatro grados centígrados. Aspire el sobrenadante y mantenga los gránulos en hielo. A continuación, agregue un mililitro de colágeno de dos caldo y un mililitro de caldo a base de dis en el tubo original que contiene ocho mililitros de tampón de disociación muscular.Utilizando una pipeta serológica de cinco mililitros resuspender el pellet 10 veces sin obstruir. Expulse la solución hacia la pared del tubo, evitando las burbujas de formación. Selle los tubos con película de laboratorio e incube en un baño de agua de 37 grados centígrados con agitación durante 30 minutos.Después de 30 minutos, retire el tubo del aspirado agitador y expulse la suspensión muscular 10 veces a través de una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 20, llene cada tubo hasta 50 mililitros con medio de lavado e invierta el tubo. Luego centrifugar a 250 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Dejando ocho mililitros en el tubo original.Llene el nuevo tubo hasta 50 mililitros con medio de lavado, vuelva a centrifugar las celdas a 350 veces G durante ocho minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante y mantenga el pellet en hielo. Coloque un filtro de celda de nylon de 40 micras en el tubo cónico original de 50 mililitros que contiene ocho mililitros de medio de lavado y humedezca previamente el filtro con uno o dos mililitros de medio de lavado.Mientras sostiene el colador, utilice una pipeta de 10 mililitros para resuspender el pellet suavemente. Filtre la suspensión a través del filtro celular de nuevo en el mismo tubo para minimizar la pérdida celular. Filtre los otros gránulos del tubo de nuevo en el tubo original agregando de cuatro a cinco mililitros de medio de lavado a cada tubo para resuspender los gránulos y transferir la solución al colador automático colocado en el tubo original.Después de recoger todos los gránulos en el tubo original de 50 mililitros, enjuague el colador automático con otros cuatro a cinco mililitros de medio de lavado. Utilice una pipeta de 1000 microlitros para recoger todo el líquido de la parte inferior del colador automático. Llene cada tubo con medio de lavado de hasta 50 mililitros e invierta el tubo.Centrifugar el tubo a 250 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante inmediatamente sin alterar el pellet y vuelva a suspender el pellet en 600 microlitros de medio de lavado. Transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros.Agregue anticuerpos CD 31 APC CD 45 APC SCA un Pacific Blue VCAM una biotina y alfa siete Integrina PE en un tubo de dos milímetros que contenga suspensión celular. Mezcle e incube suavemente las células en un agitador giratorio a cuatro grados centígrados durante 45 minutos protegiéndolas de la luz. Después de la incubación, llene todos los tubos hasta dos mililitros con medio de lavado y centrifugar a 250 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 300 microlitros de medio de lavado. A continuación, agregue el anticuerpo de estreptavidina en tubos e incube las células en un agitador giratorio a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Después de la incubación, llene los tubos que contienen anticuerpos contra la estreptavidina hasta dos mililitros con medio de lavado.Luego, centrifugar los tubos y aspirar el sobrenadante por completo. Después del segundo lavado, resuspenda las células en el tubo experimental en 500 microlitros de medio de lavado. Moje previamente una tapa de filtro celular de un tubo inferior redondo de poliestireno de cinco mililitros con 200 microlitros de medio de lavado.Transfiera la suspensión celular del tubo experimental al tubo inferior redondo de poliestireno de cinco mililitros y permita que se filtre por gravedad. Imprima el tubo de dos mililitros que contiene la suspensión de muestra experimental con 300 microlitros de medio de lavado y páselo a través del mismo tapón filtrante. Utilice una pipeta de 200 microlitros para recoger todo el líquido de la parte inferior del filtro celular.Selle con una tapa, deje los tubos en hielo y protéjalos de la luz. Aquí se muestra la estrategia de compuerta adoptada para el aislamiento de progenitores fibro adipogénicos y células madre musculares. El golpe PD GFR alfa E G F P en ratones reporteros expresa el gen de fusión H two B E G F P del locus alfa endógeno PD G FFR, lo que permite un etiquetado eficiente y específico del linaje alfa PD G GF.La pureza de las poblaciones celulares aisladas se confirmó mediante inmunotinción de cocultivo de progenitores fibro adipogénicos positivos para GFP y células madre musculares con anticuerpos PAC-siete. El progenitor fibro adipogénico positivo para GFP no expresó el marcador PAC-siete, mientras que las células madre musculares reaccionaron con este anticuerpo. Todas las células que expresan GFP fueron positivas para SCA uno y negativas para CD 31, CD 45 VCAM uno e integrina alfa siete.Se muestran el progenitor fibro adipogénico y las células madre musculares aisladas de ratones lesionados con inyecciones intramusculares sin toxina siete días después de la lesión. A medida que las células madre musculares se activan un aumento en el tamaño celular. Es importante ajustar los parámetros F SCA y SS CA y expandir la puerta para incluir esas celdas en el centro.Aquí se muestra la cuantificación de progenitores fibro adipogénicos y células madre musculares en músculos TA no lesionados y siete días después de la lesión. Aunque el pico y la proliferación se observaron entre los días dos y tres, una baja tasa de proliferación de células seguía siendo apreciable siete días después de la lesión. Realizar una picada muscular adecuada es de vital importancia para liberar una sola célula.Además, el aislamiento de células mononucleótidas se logra ejecutando la suspensión a una jeringa de 10 mililitros con una aguja calibre 20. Esta técnica ayudará a los científicos a estudiar el perfil biológico transcripcional y epigenómico de Forbes y las células madre musculares en condiciones normales y durante las etapas más profundas de la regeneración muscular.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Cultura de faríngea Arcos para el Estudio de corazón y músculo Progenitores y su nicho

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Uso de mitocondrias aisladas a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para alta microplacas rendimiento Mediciones respiratorias

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

La inducción de la regeneración muscular esquelético aguda por inyección Cardiotoxin

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Preparación y cultivo de células precursoras miogénica / mioblastos primarios de músculo esquelético de los seres humanos adultos y envejecidos

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluación de la senescencia inducida por la lesión y en Vivo de reprogramación en el músculo esquelético

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Aislamiento, cultivo y diferenciación de células estromales de médula ósea y progenitores de los osteoclastos de los ratones

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Aplicación de la estimulación crónica para estudiar adaptaciones fenotípicas de músculo esquelético de rata inducida por actividad contráctil

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identificación de células satélite del músculo esquelético por inmunofluorescencia con anticuerpos de laminina y Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...