Name: facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-06-08T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

Vi vill tacka Tom Cheung (Hong Kong University of Science & Technology) för råd om MuSC-isolering. Detta arbete finansierades av NIAMS-IRP genom NIH-bidrag AR041126 och AR041164.

Alla djurförsök som utfördes utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer som godkänts av djurvårds- och användningskommittén (ACUC) vid National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases (NIAMS). Utredare som utför detta protokoll måste följa sina lokala djuretiska riktlinjer.
OBS: Detta protokoll beskriver i detalj hur man isolerar FAPs och MuSC från bakbenet och skadade tibialis främre (TA) muskler hos vuxna manliga och kvinnliga möss (3-6 månader) och ...

<ol>
	<li>Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+as+a+&amp;#34;mediator&amp;#34;+of+systemic+metabolism.">Muscle as a &amp;#34;mediator&amp;#34; of systemic metabolism.</a> Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).</li><li>Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+and+skeletal+muscle+regeneration.">Satellite cells and skeletal muscle regeneration.</a> Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).</li><li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells.">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).</li><li>Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+satellite+cell+contribution+to+uninjured+adult+muscle+fibers.">Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers.</a> Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).</li><li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+injury+activates+resident+fibro/adipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis.">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle.">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li><li>Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+roles+of+muscle-resident+fibro-adipogenic+progenitors+in+health,+regeneration,+neuromuscular+disorders,+and+aging.">Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging.</a> Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).</li><li>Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle.">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+progenitors+resident+in+the+skeletal+muscle+interstitium+exhibit+robust+BMP-dependent+osteogenic+activity+and+mediate+heterotopic+ossification.">Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).</li><li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+tissue-resident+PDGFR&#945;++fibro-adipogenic+progenitors+spontaneously+acquire+osteogenic+phenotype+in+an+altered+inflammatory+environment.">Murine tissue-resident PDGFR&#945;+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).</li><li>Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-adipogenic+progenitors+cross-talk+in+skeletal+muscle:+The+social+network.">Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).</li><li>Lemos, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nilotinib+reduces+muscle+fibrosis+in+chronic+muscle+injury+by+promoting+TNF-mediated+apoptosis+of+fibro/adipogenic+progenitors.">Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors.</a> Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).</li><li>Malecova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cellular+states+of+fibro-adipogenic+progenitors+during+myogenesis+and+muscular+dystrophy.">Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 9, 3670 (2018).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).</li><li>Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs):+Isolation+by+FACS+and+culture.">Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture.</a> Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).</li><li>Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+differentiation+of+fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs)+from+skeletal+muscle.">Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).</li><li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms.">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li><li>Contreras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+TGF-&#946;+and+PDGFR&#945;+signaling+pathways+regulates+the+fate+of+stromal+fibro-adipogenic+progenitors.">Cross-talk between TGF-&#946; and PDGFR&#945; signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors.</a> Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).</li><li>Holmes, C., Stanford, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Stem+cell+antigen-1:+Expression,+function,+and+enigma.">Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma.</a> Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).</li><li>Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HGFA+Is+an+injury-regulated+systemic+factor+that+induces+the+transition+of+stem+cells+into+GAlert.">HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert.</a> Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).</li><li>Garc&#237;a-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+maintains+a+genuine+muscle+stem-cell+quiescent+state+until+geriatric+age.">FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).</li><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterioration+and+variability+of+highly+purified+collagenase+blends+used+in+clinical+islet+isolation.">Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation.</a> Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).</li><li>Walls, P. L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+potential+for+bursting+bubbles+to+damage+suspended+cells.">Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li><li>Kafadar, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sca-1+expression+is+required+for+efficient+remodeling+of+the+extracellular+matrix+during+skeletal+muscle+regeneration.">Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration.</a> Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).</li></ol>

Att upprätta effektiva och reproducerbara protokoll för identifiering och isolering av rena vuxna stamcellspopulationer är det första och mest kritiska steget mot att förstå deras funktion. Isolerade FAP och MuSC kan användas för att genomföra multiomikanalys i transplantationsexperiment som en potentiell behandling för muskelsjukdomar eller kan modifieras genetiskt för sjukdomsmodellering i stamcellsterapi. 
Protokollet som beskrivs här ger standardiserade riktlinjer för identifi...

Skelettmuskeln är den största vävnaden i kroppen, som står för ~ 40% av vuxen mänsklig vikt och ansvarar för att upprätthålla hållning, generera rörelse, reglera basal energimetabolism och kroppstemperatur1. Skelettmuskeln är en mycket dynamisk vävnad och har en anmärkningsvärd förmåga att anpassa sig till en mängd olika stimuli, såsom mekanisk stress, metaboliska förändringar och dagliga miljöfaktorer. Dessutom regenererar skelettmuskeln som svar på akut skada, vilket leder till fullständig återställning av dess morfologi och funktioner2. Skelettmuskelns plasticitet är huvudsakligen beroende av en population av bosatta muskelstamceller (MuSC), även kallade satellitceller, som ligger mellan myofiberplasmamembranet och basal lamina 2,3. Under normala förhållanden bor MuSC i muskelnischen i vilande tillstånd, med bara några få divisioner för att kompensera för cellulär omsättning och för att fylla på stamcellspoolen4. Som svar på skada går MuSC: er in i cellcykeln, sprider sig och bidrar antingen till bildandet av nya muskelfibrer eller återgår till nischen i en självförnyelseprocess 2,3. Förutom MuSC är homeostatiskt underhåll och regenerering av skelettmuskeln beroende av stöd från en population av muskelboende celler som heter fibro-adipogena förfäder (FAPs)5,6,7. FAPs är mesenkymala stromaceller inbäddade i muskelbindvävnaden och kan differentieras längs fibrogen, adipogen, osteogen eller kondrogen härstamning 5,8,9,10. FAPs ger strukturellt stöd för MuSC eftersom de är en källa till extracellulära matrisproteiner i muskelstamcellsnischen. FAPs främjar också långsiktigt underhåll av skelettmuskeln genom att utsöndra cytokiner och tillväxtfaktorer som ger trofiskt stöd för myogenes och muskeltillväxt 6,11. Vid akut muskelskada sprider sig FAPs snabbt för att producera en övergående nisch som stöder den regenererande muskelns strukturella integritet och ger en gynnsam miljö för att upprätthålla MuSCs spridning och differentiering på ett parakrint sätt5. När regenereringen fortskrider rensas FAPs från den regenerativa muskeln genom apoptos, och deras antal återgår gradvis till basalnivå12. Men under förhållanden som gynnar kronisk muskelskada åsidosätter FAPs pro-apoptotisk signalering och ackumuleras i muskelnischen, där de differentieras till kollagenproducerande fibroblaster och adipocyter, vilket leder till ektopiska fettinfiltrat och fibrotisk ärrbildning12,13.
På grund av deras multipotens och deras regenerativa förmågor har FAPs och MuSCs identifierats som potentiella mål inom regenerativ medicin för behandling av skelettmuskelsjukdomar. För att undersöka deras funktion och terapeutiska potential är det därför viktigt att upprätta effektiva och reproducerbara protokoll för isolering och odling av FAPs och MuSC.
Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) kan identifiera olika cellpopulationer baserat på morfologiska egenskaper såsom storlek och granularitet och tillåter cellspecifik isolering baserat på användning av antikroppar riktade mot cellytmarkörer. Hos vuxna möss uttrycker MuSC den vaskulära celladhesionsmolekylen 1 (VCAM-1, även känd som CD106) 14,15 och α7-Integrin 15, medan FAP uttrycker den trombocyt-härledda tillväxtfaktorreceptorn α (PDGFRα) och stamcellsantigenet 1 (Sca1 eller Ly6A / E) 5,6,9,12,16,17 . I protokollet som beskrivs här identifierades MuSC:er som CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, medan FAPs identifierades som CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Alternativt användes PDGFRαEGFP-möss för att isolera FAP som CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- händelser18,19. Vidare jämförde vi överlappningen mellan den fluorescerande signalen från PDGFRα-GFP+-celler med celler som identifierats av ytmarkören Sca1. Vår analys visade att alla GFP-uttryckande celler också var positiva för Sca1, vilket indikerar att båda metoderna kan användas för identifiering och isolering av FAPs. Slutligen bekräftade färgning med specifika markörantikroppar renheten hos varje cellpopulation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G BD Needle 1 in. single use, sterile</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b)</td>
			<td>The University of British Columbia</td>
			<td>53-0010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD31 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSMelody Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD106 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J&#160; mouse (Female and Male)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>007669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution (1 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 40 &#181;m Cell Strainer, Blue, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Collagenase, Type II, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Dispase, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DMEM, high glucose, HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12430054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Horse Serum, New Zealand origin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse PDGF&#160;R alpha Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9624464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NCC0528893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)</td>
			<td>Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 Streptavidin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle

Fibro-adipogenic stamceller (FAPs) är en population av skelettmuskelboende mesenkymala stromaceller (MSC) som kan differentieras längs fibrogen, adilogen, osteogen eller kondrogen härstamning. Tillsammans med muskelstamceller (MuSC) spelar FAPs en kritisk roll i muskelhomeostas, reparation och regenerering, samtidigt som de aktivt upprätthåller och omformar den extracellulära matrisen (ECM). Vid patologiska tillstånd, såsom kronisk skada och muskeldystrofier, genomgår FAPs avvikande aktivering och differentieras till kollagenproducerande fibroblaster och adipocyter, vilket leder till fibros och intramuskulär fettinfiltration. Således spelar FAPs en dubbel roll i muskelregenerering, antingen genom att upprätthålla MuSC-omsättningen och främja vävnadsreparation eller bidra till fibrotisk ärrbildning och ektopiska fettinfiltrat, vilket äventyrar skelettmuskelvävnadens integritet och funktion. En korrekt rening av FAP och MuSC är en förutsättning för att förstå dessa cellers biologiska roll i fysiologiska såväl som i patologiska tillstånd. Här beskriver vi en standardiserad metod för samtidig isolering av FAPs och MuSC från lemmuskler hos vuxna möss med hjälp av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Protokollet beskriver i detalj den mekaniska och enzymatiska dissociationen av mononukleerade celler från hela extremitetsmuskler och skadade tibialis främre (TA) muskler. FAPs och MuSC isoleras därefter med hjälp av en halvautomatisk cellsorterare för att erhålla rena cellpopulationer. Vi beskriver dessutom en optimerad metod för odling av vilande och aktiverade FAPs och MuSCs, antingen ensamma eller i samodlingsförhållanden.

Detta protokoll tillåter isolering av cirka en miljon FAPs och upp till 350 000 MuSC från oskadade bakben hos vuxna möss av vild typ (3-6 månader), vilket motsvarar ett utbyte på 8% för FAPs och 3% för MuSCs av totala händelser. Vid sortering av celler från skadad TA 7 dagar efter skada samlas två till tre TA-muskler för att få upp till 300 000 FAP och 120 000 MuSC, vilket motsvarar ett utbyte på 11% respektive 4%. Renhetsvärden efter sortering är vanligtvis över 95% för FAP och MuSC.
<p class="jove_...

Watch this Scientific Journal Video about FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle

Den exakta identifieringen av fibro-adipogenic stamceller (FAPs) och muskelstamceller (MuSC) är avgörande för att studera deras biologiska funktion under fysiologiska och patologiska tillstånd. Detta protokoll ger riktlinjer för isolering, rening och odling av FAPs och MuSC från vuxna musmuskler.

FACS-isolering och odling av fibro-adipogena förfäder och muskelstamceller från ostörd och skadad musskelettmuskel

Fibro-adipogenic progenitor cells (FAPs) are a population of skeletal muscle-resident mesenchymal stromal cells (MSCs) capable of differentiating along ...

Detta protokoll beskriver en metod för samtidig isolering av fibro adipogena, stamfäder och muskelstamceller med hjälp av fluorescensaktivatorer av sortering. Rena populationer av dessa celler är en förutsättning för att förstå deras biologiska roll i fysiologiska och patologiska tillstånd. Med hjälp av denna teknik identifierades Forbes och muskelstamceller och isolerades från antingen armhålan eller skadad muskel.Den höga fyllda straffriheten för Forbes och muskelstamceller har gjort det möjligt för oss att använda dessa celler för olika nedströmstekniker som sackarintransplantation och mudial mixanalys. För att börja, placera den avlivade musen liggande på en dissektionsdyna och spraya den med 70% etanol För att undvika kontaminering, använd pincett för att klämma fast mitten av musmagehuden och skär ungefär en centimeter öppning horisontellt. Ta tag i sårkanterna och skivan i musen genom att dra öppningen i motsatta riktningar för att avslöja musklerna under, exponera ena sidan av bakbenet vid den tiden.Innan du samlar muskler, Ta bort intermuskulärt fett mellan hamstringsna i den proximala änden av quadriceps för att förbättra isoleringen av fibro adipogenic stamceller och muskelstamceller. Därefter, utan att skada vävnaden, använd skarpa pincett för att bryta och skala av fascian för att exponera undersidan tibialis främre eller TA och extensor digitorum longus eller EDL muskler. Kör den vassa spetsen på tången under TA EDL-musklerna för att lossa musklerna från skenbenet.Klipp av senorna, fäst TA EDL på fotleden och medan du håller den med pincett, trimma musklerna med sax längs TA EDL: s längsgående linje. Skär senorna runt knäet för att lossa hela TA EDL-musklerna. Placera musklerna i en sex centimeter skål som hålls på is.För att isolera gastrocnemius muskler skära alla senor vid fotleden och lossa musklerna från skenbenet och fibula. Skär runt knäet och överför musklerna till skålen. Skala av fascian runt quadriceps och separera den från lårbenet genom att köra den skarpa spetsen av tången mellan muskeln och benet.Skär senorna runt knäet och trimma resten av muskeln genom att skära längs lårbenet medan du håller quadriceps med pincett i den distala änden. Placera musklerna i skålen på sex centimeter. Lossa hamstrings och återstående muskler runt lårbenet och överför dem till skålen.Samla bakbensmusklerna i en maträtt som hålls på is. Aspirera tvättmedium från skålen och tillsätt en till två milliliter muskeldissociationsbuffert för att hålla musklerna fuktiga. Därefter hacka musklerna noggrant Använd en skalpell för att riva och skära muskeln och använd sedan sax för att fortsätta skära muskeln i små bitar i en till två minuter tills du får en uppslamningspasta av välhackad vävnad.Överför sedan de malet musklerna till det koniska röret som innehåller muskeldissociationsbuffert. Försegla rören med laboratoriefilm och inkubera i ett 37 grader Celsius vattenbad med omrörning i en timme. Efter en timme, ta bort röret från skakaren och fyll det till 50 ml Med tvättmedium, vänd försiktigt röret två gånger för att säkerställa blandning.Centrifugera cellerna i en svängande hink Rotor vid 250 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius. Överför 42 ml supernatant till två nya rör och lämna åtta milliliter i originalröret. Fyll de nya rören som innehåller 21 ml supernatant upp till 50 ml med tvättmedium.Centrifugera sedan cellerna vid 350 gånger G i åtta minuter vid fyra grader Celsius. Aspirera supernatanten och håll pelletsen på is. Tillsätt sedan en milliliter kollagenas två lager och en milliliter disbaserad buljong i det ursprungliga röret som innehåller åtta milliliter muskeldissociationsbuffert.Använd en fem milliliters serologisk pipett återsuspendera pelleten 10 gånger utan igensättning. Mata ut lösningen mot rörets vägg och undvik bildningsbubblorna. Försegla rören med laboratoriefilm och inkubera i ett 37 grader Celsius vattenbad med omrörning i 30 minuter.Efter 30 minuter, ta bort röret från shakeraspiraten och mata ut muskelsuspensionen 10 gånger genom en 10 ml spruta med en 20 gauge nål, fyll varje rör upp till 50 ml med tvättmedium och invertera röret. Centrifugera sedan vid 250 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius och överför supernatanten till ett nytt rör. Lämnar åtta milliliter i originalröret.Fyll det nya röret upp till 50 ml med tvättmedium, centrifugera cellerna igen vid 350 gånger G i åtta minuter vid fyra grader Celsius. Ta bort supernatanten och håll pelleten på is. Placera en 40 mikron nyloncellsil i det ursprungliga 50 ml koniska röret som innehåller åtta milliliter tvättmedium och förfukta silen med en till två milliliter tvättmedium.Medan du håller silen, använd en 10 ml pipett för att återsuspendera pelleten försiktigt. Filtrera suspensionen genom cellsilen tillbaka till samma rör för att minimera cellförlusten. Filtrera tillbaka de andra rörpelletsen i originalröret genom att tillsätta fyra till fem milliliter tvättmedium till varje rör för att återsuspendera pelletsen och överföra lösningen till självsilen placerad i originalröret.Efter att ha samlat alla pellets i det ursprungliga 50 ml röret, skölj självsilen med ytterligare fyra till fem milliliter tvättmedium. Använd en 1000 mikroliter pipett för att samla all vätska från undersidan av självsilen. Fyll varje rör med tvättmedium upp till 50 ml och invertera röret.Centrifugera röret vid 250 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius. Ta bort supernatanten omedelbart utan att störa pelleten och återsuspendera pelleten i 600 mikroliter tvättmedium. Överför suspensionen till ett två milliliter mikrocentrifugrör.Lägg till antikroppar CD 31 APC CD 45 APC SCA en Pacific Blue VCAM en biotin och alfa sju Integrin PE i ett två millimeter rör innehållande cellsuspension. Blanda och inkubera försiktigt cellerna i en roterande shaker vid fyra grader Celsius i 45 minuter och skydda dem från ljus. Efter inkubation fyller du alla rör upp till två milliliter med tvättmedium och centrifugerar vid 250 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius.Ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 300 mikroliter tvättmedium. Tillsätt sedan streptavidinantikropp i rör och inkubera cellerna i en roterande shaker vid fyra grader Celsius i 20 minuter. Efter inkubation fyller du rör som innehåller streptavidinantikropp till två milliliter med tvättmedium.Centrifugera sedan rören och aspirera supernatanten helt. Efter den andra tvätten, återsuspendera cellerna i experimentröret i 500 mikroliter tvättmedium. Förfukta ett cellsillock av ett fem milliliter polystyren runt bottenrör med 200 mikroliter tvättmedium.Överför cellsuspensionen från experimentröret till det runda bottenröret på fem milliliter polystyren och låt det filtrera efter tyngdkraften. Skriv ut röret på två milliliter som innehåller provsuspensionen med 300 mikroliter tvättmedium och för det genom samma sillock. Använd en 200 mikroliter pipett för att samla all vätska från undersidan av cellsilen.Försegla med lock, lämna rör på is och skydda dem från ljus. Den gating strategi som antagits för isolering av fibro adipogenic stamfader och muskelstamceller visas här. PD GFR alfa E G F P-knocken hos reportermöss uttrycker H-två B E G F P-fusionsgenen från den endogena PD G FFR-alfa-locusen, vilket möjliggör effektiv och specifik märkning av PD G GFR-alfa-härstamningen.Renheten hos de isolerade cellpopulationerna bekräftades genom immunfärgning av samodling GFP-positiv fibro adipogen stamfader och muskelstamceller med PAC-sju antikroppar. GFP-positiv fibro adipogen stamfader uttryckte inte PAC-sju-markören, medan muskelstamceller reagerade med denna antikropp. Alla GFP-uttryckande celler var positiva för SCA ett och negativa för CD 31, CD 45 VCAM one och alpha seven integrin.Den fibro adipogena stamfadern och muskelstamceller isolerade från möss som skadats med intramuskulära injektioner utan toxin sju dagar efter skada visas. När muskelstamceller aktiveras en ökning av cellulär storlek. Det är viktigt att justera parametrarna F SCA och SS CA och utöka grinden till att omfatta dessa celler i mitten.Kvantifiering av fibro adipogenic stamfader och muskelstamceller i oskadade och sju dagar efter skada TA-muskler visas här. Även om toppen och spridningen observerades mellan dag två och tre var en låg frekvens av prolifererande celler fortfarande märkbar sju dagar efter skada. Att utföra korrekt muskelbrytning är av avgörande betydelse för att frigöra en enda cell.Vidare uppnås mononukleotidcellisolering genom att suspensionen körs till en 10 ml spruta med en 20 gauge nål. Denna teknik kommer att hjälpa forskare att studera den biologiska transkriptionella och epigenomiska profilen hos Forbes och muskelstamceller i normalt tillstånd och under de djupare stadierna av muskelregenerering.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolering och Kvantitativ Immuncytokemiska karakterisering av primära myogena celler och fibroblaster från Human skelettmuskulatur

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex vivo Kultur av Pharyngeal Arches att studera hjärta och muskelstamfäder och deras nisch

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Använda Isolerad Mitokondrier från minimala kvantiteter av mus skelettmuskulatur för hög genomströmning Mikroandnings Mätningar

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Induktion av akut Skeletal Muscle Regeneration av Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Upprättande och kultur Myogenic prekursorceller / Primära myoblaster från skelettmuskulatur av vuxna och äldre människor

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Utvärdering av nervskade-inducerad åldras och In Vivo omprogrammering i skelettmuskulaturen

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolering, kultur och differentiering av benmärgens stromaceller och Osteoclast stamfäder från möss

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Tillämpningen av kronisk stimulering att studera kontraktila aktivitet-inducerad råtta skelettmuskulaturen fenotypiska anpassningar

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identifiering av skelettmuskulaturen satellit celler genom immunofluorescens med Pax7 och Laminin antikroppar

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...