Name: facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle
Uploaded: 2022-06-08T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

MuSC izolasyonu konusundaki tavsiyeleri için Tom Cheung'a (Hong Kong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi) teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIAMS-IRP tarafından NIH hibeleri AR041126 ve AR041164 aracılığıyla finanse edildi.

Yapılan tüm hayvan deneyleri, Ulusal Artrit, Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü (NIAMS) Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (ACUC) tarafından onaylanan kurumsal kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu protokolü uygulayan araştırmacılar, yerel hayvan etiği kurallarına uymalıdır.
NOT: Bu protokol, FAP'ların ve MuSC'lerin yetişkin erkek ve dişi farelerin (3-6 ay) arka ekstremite ve yaralı tibialis anterior (TA) kaslarından nasıl izole edileceğini ayrı...

<ol>
	<li>Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+as+a+&amp;#34;mediator&amp;#34;+of+systemic+metabolism.">Muscle as a &amp;#34;mediator&amp;#34; of systemic metabolism.</a> Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).</li><li>Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+and+skeletal+muscle+regeneration.">Satellite cells and skeletal muscle regeneration.</a> Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).</li><li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells.">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).</li><li>Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+satellite+cell+contribution+to+uninjured+adult+muscle+fibers.">Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers.</a> Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).</li><li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+injury+activates+resident+fibro/adipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis.">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle.">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li><li>Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+roles+of+muscle-resident+fibro-adipogenic+progenitors+in+health,+regeneration,+neuromuscular+disorders,+and+aging.">Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging.</a> Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).</li><li>Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle.">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+progenitors+resident+in+the+skeletal+muscle+interstitium+exhibit+robust+BMP-dependent+osteogenic+activity+and+mediate+heterotopic+ossification.">Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).</li><li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+tissue-resident+PDGFR&#945;++fibro-adipogenic+progenitors+spontaneously+acquire+osteogenic+phenotype+in+an+altered+inflammatory+environment.">Murine tissue-resident PDGFR&#945;+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).</li><li>Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-adipogenic+progenitors+cross-talk+in+skeletal+muscle:+The+social+network.">Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).</li><li>Lemos, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nilotinib+reduces+muscle+fibrosis+in+chronic+muscle+injury+by+promoting+TNF-mediated+apoptosis+of+fibro/adipogenic+progenitors.">Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors.</a> Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).</li><li>Malecova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cellular+states+of+fibro-adipogenic+progenitors+during+myogenesis+and+muscular+dystrophy.">Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 9, 3670 (2018).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).</li><li>Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs):+Isolation+by+FACS+and+culture.">Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture.</a> Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).</li><li>Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+differentiation+of+fibro/adipogenic+progenitors+(FAPs)+from+skeletal+muscle.">Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).</li><li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms.">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li><li>Contreras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+TGF-&#946;+and+PDGFR&#945;+signaling+pathways+regulates+the+fate+of+stromal+fibro-adipogenic+progenitors.">Cross-talk between TGF-&#946; and PDGFR&#945; signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors.</a> Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).</li><li>Holmes, C., Stanford, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Stem+cell+antigen-1:+Expression,+function,+and+enigma.">Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma.</a> Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).</li><li>Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HGFA+Is+an+injury-regulated+systemic+factor+that+induces+the+transition+of+stem+cells+into+GAlert.">HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert.</a> Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).</li><li>Garc&#237;a-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+maintains+a+genuine+muscle+stem-cell+quiescent+state+until+geriatric+age.">FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).</li><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterioration+and+variability+of+highly+purified+collagenase+blends+used+in+clinical+islet+isolation.">Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation.</a> Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).</li><li>Walls, P. L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+potential+for+bursting+bubbles+to+damage+suspended+cells.">Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li><li>Kafadar, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sca-1+expression+is+required+for+efficient+remodeling+of+the+extracellular+matrix+during+skeletal+muscle+regeneration.">Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration.</a> Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).</li></ol>

Saf yetişkin kök hücre popülasyonlarının tanımlanması ve izolasyonu için etkili ve tekrarlanabilir protokollerin oluşturulması, işlevlerini anlamaya yönelik ilk ve en kritik adımdır. İzole FAP'lar ve MuSC'ler, kas hastalıkları için potansiyel bir tedavi olarak transplantasyon deneylerinde multiomik analiz yapmak için kullanılabilir veya kök hücre tedavisinde hastalık modellemesi için genetik olarak değiştirilebilir. 
Burada açıklanan protokol, yetişkin farelerin a...

İskelet kası, yetişkin insan ağırlığının ~% 40'ını oluşturan vücuttaki en büyük dokudur ve duruşun korunmasından, hareket üretilmesinden, bazal enerji metabolizmasının düzenlenmesinden ve vücut ısısından sorumludur1. İskelet kası oldukça dinamik bir dokudur ve mekanik stres, metabolik değişiklikler ve günlük çevresel faktörler gibi çeşitli uyaranlara uyum sağlama konusunda olağanüstü bir yeteneğe sahiptir. Ek olarak, iskelet kası akut yaralanmaya yanıt olarak yenilenir ve morfolojisinin ve fonksiyonlarının tamamen restorasyonuna yol açar2. İskelet kası plastisitesi, esas olarak, miyofiber plazma zarı ile bazal lamina 2,3 arasında yer alan uydu hücreleri olarak da adlandırılan yerleşik kas kök hücrelerinin (MuSC'ler) popülasyonuna dayanır. Normal koşullar altında, MuSC'ler kas nişinde sessiz bir durumda bulunur, hücresel ciroyu telafi etmek ve kök hücre havuzunu yenilemek için sadece birkaç bölümvardır 4. Yaralanmaya yanıt olarak, MuSC'ler hücre döngüsüne girer, çoğalır ve ya yeni kas liflerinin oluşumuna katkıda bulunur ya da kendini yenileme sürecinde nişe geri döner 2,3. MuSC'lere ek olarak, iskelet kasının homeostatik bakımı ve yenilenmesi, fibro-adipojenik progenitörler (FAP'ler) olarak adlandırılan bir kas yerleşik hücre popülasyonunun desteğine dayanır5,6,7. FAP'lar kas bağ dokusuna gömülü mezenkimal stromal hücrelerdir ve fibrojenik, adipojenik, osteojenik veya kondrojenik soy 5,8,9,10 boyunca farklılaşabilir. FAP'lar, kas kök hücre nişinde hücre dışı matriks proteinlerinin bir kaynağı oldukları için MuSC'ler için yapısal destek sağlar. FAP'lar ayrıca sitokinler ve miyogenez ve kas büyümesi için trofik destek sağlayan büyüme faktörleri salgılayarak iskelet kasının uzun süreli bakımını teşvik eder 6,11. Akut kas hasarı üzerine, FAP'lar yenilenen kasın yapısal bütünlüğünü destekleyen ve MuSC'lerin proliferasyonunu ve farklılaşmasını parakrin bir şekilde sürdürmek için elverişli bir ortam sağlayan geçici bir niş üretmek için hızla çoğalırlar5. Rejenerasyon ilerledikçe, FAP'lar apoptoz ile rejeneratif kastan temizlenir ve sayıları yavaş yavaş bazal seviye12'ye geri döner. Bununla birlikte, kronik kas hasarını destekleyen koşullarda, FAP'lar pro-apoptotik sinyallemeyi geçersiz kılar ve kollajen üreten fibroblastlara ve adipositlere farklılaşarak ektopik yağ infiltrasyonlarına ve fibrotik skar oluşumuna yol açan kas nişinde birikir12,13.
Çok etkili olmaları ve rejeneratif yetenekleri nedeniyle, FAP'lar ve MuSC'ler iskelet kası bozukluklarının tedavisinde rejeneratif tıpta prospektif hedefler olarak tanımlanmıştır. Bu nedenle, fonksiyonlarını ve terapötik potansiyellerini araştırmak için, FAP ve MuSC'lerin izolasyonu ve kültürü için etkili ve tekrarlanabilir protokoller oluşturmak önemlidir.
Floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS), boyut ve granülerlik gibi morfolojik özelliklere dayanarak farklı hücre popülasyonlarını tanımlayabilir ve hücre yüzey belirteçlerine karşı yönlendirilmiş antikorların kullanımına dayalı olarak hücreye özgü izolasyona izin verir. Yetişkin farelerde, MuSC'ler vasküler hücre adezyon molekülü 1'i (VCAM-1, CD106 olarak da bilinir) 14,15 ve α7-Integrin15'i ifade ederken, FAP'lar trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü α (PDGFRa) ve kök hücre antijeni 1'i (Sca1 veya Ly6A / E) 5,6,9,12,16,17 olarak ifade eder. . Burada açıklanan protokolde MuSC'ler CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ olarak tanımlanırken, FAP'lar CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin- olarak tanımlanmıştır. Alternatif olarak, PDGFRαEGFP fareleri, FAP'ları CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- olayları18,19 olarak izole etmek için kullanıldı. Ayrıca, PDGFRa-GFP + hücrelerinin floresan sinyali ile yüzey belirteci Sca1 tarafından tanımlanan hücreler arasındaki örtüşmeyi karşılaştırdık. Analizimiz, GFP eksprese eden tüm hücrelerin Sca1 için de pozitif olduğunu gösterdi, bu da her iki yaklaşımın da FAP'ların tanımlanması ve izolasyonu için kullanılabileceğini gösterdi. Son olarak, spesifik belirteç antikorları ile boyama, her hücre popülasyonunun saflığını doğruladı.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G BD Needle 1 in. single use, sterile</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b)</td>
			<td>The University of British Columbia</td>
			<td>53-0010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD31 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSMelody Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD106 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J&#160; mouse (Female and Male)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>007669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution (1 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 40 &#181;m Cell Strainer, Blue, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Collagenase, Type II, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Dispase, powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DMEM, high glucose, HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12430054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Horse Serum, New Zealand origin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse PDGF&#160;R alpha Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9624464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NCC0528893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)</td>
			<td>Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 Streptavidin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facs-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle

Fibro-adipojenik progenitör hücreler (FAP'ler), fibrojenik, adipojenik, osteojenik veya kondrojenik soy boyunca farklılaşabilen iskelet kası yerleşik mezenkimal stromal hücrelerin (MSC'ler) bir popülasyonudur. Kas kök hücreleri (MuSC'ler) ile birlikte FAP'lar, hücre dışı matrisi (ECM) aktif olarak korurken ve yeniden şekillendirirken, kas homeostazı, onarımı ve yenilenmesinde kritik bir rol oynar. Kronik hasar ve kas distrofileri gibi patolojik durumlarda, FAP'lar anormal aktivasyona uğrar ve kollajen üreten fibroblastlara ve adipositlere farklılaşarak fibroz ve kas içi yağ infiltrasyonuna yol açar. Bu nedenle, FAP'lar kas rejenerasyonunda, MuSC döngüsünü sürdürerek ve doku onarımını teşvik ederek veya iskelet kası dokusunun bütünlüğünü ve işlevini tehlikeye atan fibrotik skar oluşumuna ve ektopik yağ infiltrasyonlarına katkıda bulunarak ikili bir rol oynamaktadır. FAP ve MuSC'lerin uygun şekilde saflaştırılması, bu hücrelerin fizyolojik ve patolojik koşullardaki biyolojik rolünü anlamak için bir ön koşuldur. Burada, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) kullanarak FAP'ların ve MuSC'lerin yetişkin farelerin uzuv kaslarından eşzamanlı izolasyonu için standartlaştırılmış bir yöntem açıklanmaktadır. Protokol, mononüklee hücrelerin tüm ekstremite kaslarından ve yaralı tibialis anterior (TA) kaslarından mekanik ve enzimatik ayrışmasını ayrıntılı olarak açıklamaktadır. FAP'lar ve MuSC'ler daha sonra saf hücre popülasyonları elde etmek için yarı otomatik bir hücre sıralayıcısı kullanılarak izole edilir. Ek olarak, sessiz ve aktif FAP'ları ve MuSC'leri tek başına veya kokültür koşullarında kültürlemek için optimize edilmiş bir yöntem açıklıyoruz.

Bu protokol, yaklaşık bir milyon FAP'ın ve 350.000'e kadar MuSC'nin vahşi tip yetişkin farelerin (3-6 ay) yaralanmamış arka bacaklarından izole edilmesine izin verir, bu da FAP'lar için% 8'lik bir verime ve toplam olayların MuSC'leri için% 3'lük bir verime karşılık gelir. Yaralanmadan 7 gün sonra hasarlı TA'dan hücreleri ayırırken, sırasıyla% 11 ve% 4'lük bir verime karşılık gelen 300.000 FAP ve 120.000 MuSC'ye kadar elde etmek için iki ila üç TA kası toplanır. Sıralama sonrası saflık de...

Watch this Scientific Journal Video about FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle

Fibro-adipojenik progenitör hücrelerin (FAP'lar) ve kas kök hücrelerinin (MuSC'ler) kesin olarak tanımlanması, fizyolojik ve patolojik koşullarda biyolojik işlevlerini incelemek için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, FAP'ların ve MuSC'lerin yetişkin fare kaslarından izolasyonu, saflaştırılması ve kültürü için kılavuzlar sağlar.

FACS-İzolasyon ve Fibro-Adipojenik Progenitörlerin ve Kas Kök Hücrelerinin Bozulmamış ve Yaralı Fare İskelet Kasından Kültürü

Fibro-adipogenic progenitor cells (FAPs) are a population of skeletal muscle-resident mesenchymal stromal cells (MSCs) capable of differentiating along ...

Bu protokol, fibro adipojenik, progenitörler ve kas kök hücrelerinin floresan aktivatörleri kullanılarak eşzamanlı izolasyonu için bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu hücrelerin saf popülasyonları, fizyolojik ve patolojik koşullardaki biyolojik rollerini anlamak için bir ön koşuldur. Bu teknik kullanılarak, Forbes ve kas kök hücreleri tanımlandı ve koltuk altından veya yaralı kastan izole edildi.Forbes ve kas kök hücrelerinin yüksek dolgulu dokunulmazlığı, bu hücreleri sakarin transplantasyonu ve çamurlu karışım analizi gibi farklı aşağı akış teknikleri için kullanmamıza izin vermiştir. Başlamak için, ötenazi fare sırtüstü yatağını bir diseksiyon pedine yerleştirin ve% 70 etanol ile püskürtün Kirlenmeyi önlemek için fare göbek derisinin merkezini sıkıştırmak ve yatay olarak yaklaşık bir santimetre açıklığı kesmek için forseps kullanın. Altındaki kasları ortaya çıkarmak için açıklığı ters yönlere çekerek faredeki yara kenarlarını ve diski kavrayın, o sırada arka bacağın bir tarafını ortaya çıkarın.Kasları toplamadan önce, fibro adipojenik progenitör hücrelerin ve kas kök hücrelerinin izolasyonunu iyileştirmek için kuadrisepsin proksimal ucundaki hamstringler arasındaki intermüsküler yağları çıkarın. Daha sonra, dokuya zarar vermeden, alt tibialis anterior veya TA ve ekstansör digitorum longus veya EDL kaslarını açığa çıkarmak için fasyayı kırmak ve soymak için keskin forseps kullanın. Kasları tibiadan ayırmak için forsepslerin keskin ucunu TA EDL kaslarının altında çalıştırın.Tendonları kesin, TA EDL'yi ayak bileğine takın ve forseps ile tutarken, kasları TA EDL'nin uzunlamasına çizgisi boyunca makasla kesin. Tüm TA EDL kaslarını ayırmak için diz çevresindeki tendonları kesin. Kasları buz üzerinde tutulan altı santimetrelik bir kaba yerleştirin.Gastroknemius kaslarını izole etmek için ayak bileğindeki tüm tendonları kesin ve kasları tibia ve fibuladan ayırın. Diz çevresini kesin ve kasları tabağa aktarın. Kuadrisepslerin etrafındaki fasyayı soyun ve forsepslerin keskin ucunu kas ve kemik arasında çalıştırarak femurdan ayırın.Diz çevresindeki tendonları kesin ve kuadrisepsleri distal uçta forseps ile tutarken femur boyunca keserek kasın geri kalanını kesin. Kasları altı santimetrelik tabağa yerleştirin. Hamstringleri ve femur etrafındaki kalan kasları ayırın ve bunları yemeğe aktarın.Arka bacak kaslarını buz üzerinde tutulan bir tabakta toplayın. Bulaşıktan yıkama ortamını aspire edin ve kasları nemli tutmak için bir ila iki mililitre kas ayrışma tamponu ekleyin. Daha sonra, kasları iyice kıyın Kasları yırtmak ve dilimlemek için bir neşter kullanın ve daha sonra iyi kıyılmış dokudan oluşan bir bulamaç macunu elde edene kadar kası bir ila iki dakika boyunca küçük parçalara ayırmaya devam etmek için makas kullanın.Daha sonra kıyılmış kasları kas ayrışma tamponu içeren konik tüpe aktarın. Tüpleri laboratuvar filmi ile kapatın ve bir saat boyunca ajitasyonlu 37 santigrat derecelik bir su banyosunda inkübe edin. Bir saat sonra, tüpü çalkalayıcıdan çıkarın ve 50 mililitreye kadar doldurun Yıkama ortamı ile, karıştırmayı sağlamak için tüpü iki kez yavaşça ters çevirin.Hücreleri sallanan bir kova Rotorunda 250 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj yapın. 42 mililitre süpernatantı iki yeni tüpe aktarın ve orijinal tüpte sekiz mililitre bırakın. 21 mililitre süpernatant içeren yeni tüpleri 50 mililitreye kadar yıkama ortamı ile doldurun.Daha sonra hücreleri dört santigrat derecede sekiz dakika boyunca 350 kez G'de santrifüj edin. Süpernatantı aspire edin ve peletleri buz üzerinde tutun. Daha sonra, sekiz mililitre kas ayrışma tamponu içeren orijinal tüpe bir mililitre kollajenaz iki stok ve bir mililitre dis bazlı stok ekleyin.Beş mililitrelik serolojik pipet kullanarak peleti tıkanmadan 10 kez askıya alın. Çözeltiyi tüpün duvarına doğru çıkarın ve oluşum kabarcıklarından kaçının. Tüpleri laboratuvar filmi ile kapatın ve 30 dakika boyunca ajitasyonlu 37 santigrat derece su banyosunda inkübe edin.30 dakika sonra, tüpü çalkalayıcı aspirattan çıkarın ve kas süspansiyonunu 20 gauge iğneli 10 mililitrelik bir şırıngadan 10 kez çıkarın, her tüpü 50 mililitreye kadar yıkama ortamı ile doldurun ve tüpü ters çevirin. Daha sonra dört santigrat derecede beş dakika boyunca 250 kez G'de santrifüj yapın ve süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Orijinal tüpte sekiz mililitre bırakmak.Yeni tüpü 50 mililitreye kadar yıkama ortamıyla doldurun, hücreleri dört santigrat derecede sekiz dakika boyunca 350 kez G'de santrifüj edin. Süpernatantı çıkarın ve peleti buz üzerinde tutun. Sekiz mililitre yıkama ortamı içeren orijinal 50 mililitrelik konik tüpe 40 mikron naylon hücre süzgeci yerleştirin ve süzgeci bir ila iki mililitre yıkama ortamı ile önceden ıslatın.Süzgeci tutarken, peleti nazikçe yeniden askıya almak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Hücre kaybını en aza indirmek için süspansiyonu hücre süzgecinden aynı tüpe geri filtreleyin. Peletleri yeniden askıya almak ve çözeltiyi orijinal tüpte bulunan kendinden süzgeçlere aktarmak için her boruya dört ila beş mililitre yıkama ortamı ekleyerek diğer boru peletlerini orijinal tüpe geri filtreleyin.Tüm peletleri orijinal 50 mililitrelik tüpe topladıktan sonra, kendinden süzgeci dört ila beş mililitre başka bir yıkama ortamı ile durulayın. Kendinden süzgeçlerin alt tarafındaki tüm sıvıyı toplamak için 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Her tüpü 50 mililitreye kadar yıkama ortamıyla doldurun ve tüpü ters çevirin.Tüpü dört santigrat derecede beş dakika boyunca 250 kez G'de santrifüj yapın. Pelet rahatsız etmeden süpernatantı derhal çıkarın ve peleti 600 mikrolitre yıkama ortamında yeniden askıya alın. Süspansiyonu iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.Hücre süspansiyonu içeren iki milimetrelik bir tüpe CD 31 APC CD 45 APC SCA bir Pasifik Mavisi VCAM bir biyotin ve alfa yedi Integrin PE antikorları ekleyin. Hücreleri nazikçe karıştırın ve dört santigrat derecede dönen bir çalkalayıcıda 45 dakika boyunca ışıktan koruyun. Kuluçkadan sonra, iki mililitreye kadar olan tüm tüpleri yıkama ortamı ile doldurun ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 250 kez G'de santrifüj yapın.Süpernatantı çıkarın ve peleti 300 mikrolitre yıkama ortamında yeniden askıya alın. Daha sonra, tüplere streptavidin antikoru ekleyin ve hücreleri 20 dakika boyunca dört santigrat derecede dönen bir çalkalayıcıda inkübe edin. Kuluçkadan sonra, streptavidin antikoru içeren tüpleri yıkama ortamı ile iki mililitreye doldurun.Daha sonra, tüpleri santrifüj edin ve süpernatantı tamamen aspire edin. İkinci yıkamadan sonra, deney tüpündeki hücreleri 500 mikrolitre yıkama ortamında yeniden askıya alın. 200 mikrolitre yıkama ortamına sahip beş mililitrelik polistiren yuvarlak alt tüpün bir hücre süzgeci kapağını önceden ıslatın.Hücre süspansiyonunu deney tüpünden beş mililitrelik polistiren yuvarlak alt tüpe aktarın ve yerçekimi ile filtrelenmesine izin verin. Deneysel numune süspansiyonunu içeren iki mililitrelik tüpü 300 mikrolitre yıkama ortamı ile yazdırın ve aynı süzgeç kapağından geçirin. Hücre süzgecinin alt tarafındaki tüm sıvıyı toplamak için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın.Bir kapakla kapatın, tüpleri buz üzerinde bırakın ve ışıktan koruyun. Fibro adipojenik progenitör ve kas kök hücrelerinin izolasyonu için benimsenen geçit stratejisi burada gösterilmiştir. Muhabir farelerdeki PD GFR alfa E G F P vuruşu, endojen PD G FFR alfa lokusundaki H iki B E G F P füzyon genini ifade eder ve PD G GFR alfa soyunun verimli ve spesifik olarak etiketlenmesini sağlar.İzole hücre popülasyonlarının saflığı, ko-kültür GFP pozitif fibro adipojenik progenitör ve kas kök hücrelerinin PAC-yedi antikorları ile immün boyanması ile doğrulandı. GFP pozitif fibro adipojenik progenitör PAC-seven belirtecini eksprese etmezken, kas kök hücreleri bu antikor ile reaksiyona girdi. Tüm GFP eksprese eden hücreler SCA bir için pozitif ve CD 31, CD 45 VCAM bir ve alfa yedi integrin için negatifti.Fibro adipojenik progenitör ve yaralanmadan yedi gün sonra toksin içermeyen intramüsküler enjeksiyonlarla yaralanan farelerden izole edilen kas kök hücreleri gösterilmiştir. Kas kök hücreleri aktive edildikçe hücresel boyutta bir artış. F SCA ve SS CA parametrelerini ayarlamak ve kapıyı bu hücreleri merkeze dahil edecek şekilde genişletmek önemlidir.Fibro adipojenik progenitör ve kas kök hücrelerinin yaralanmamış ve yaralanma sonrası yedi gün sonraki TA kaslarında nicelleştirilmesi burada gösterilmiştir. Her ne kadar pik ve proliferasyon iki ila üç gün arasında gözlense de, düşük proliferasyon hücresi oranı, yaralanmadan yedi gün sonra hala kayda değerdi. Uygun kas kıyma işleminin yapılması, tek bir hücrenin serbest bırakılması için kritik öneme sahiptir.Ayrıca, mononükleotid hücre izolasyonu, süspansiyonun 20 ölçülü bir iğne ile 10 mililitrelik bir şırıngaya çalıştırılmasıyla elde edilir. Bu teknik, bilim adamlarının Forbes ve kas kök hücrelerinin biyolojik transkripsiyonel ve epigenomik profilini normal durumda ve kas rejenerasyonunun daha derin aşamalarında incelemelerine yardımcı olacaktır.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Faringeal Arches Ex Vivo Kültür Kalp ve kas atalarıdır ve Bunların Niche Eğitim için

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Yüksek verim Mikroplate Solunum Ölçümler Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen kondriyayı İzole kullanma

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Cardiotoxin Enjeksiyonu ile Akut İskelet Kası Regeneration indüksiyon

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Yetişkin ve Yaşlı İnsanların İskelet Kası miyojenik Öncü Hücreler / İlköğretim miyoblastların hazırlanması ve Kültür

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Yaralanma kaynaklı yaşlanma ve In Vivo kas iskelet yeniden programlama değerlendirilmesi

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Yalıtım, kültür ve kemik iliği Stromal hücreler ve Osteoklast ataları fareler gelen farklılaşma

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Contractile fare faaliyet kaynaklı kas iskelet fenotipik uyarlamalar çalışmaya kronik stimulasyon uygulanması

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Kas iskelet uydu hücreleri tarafından Pax7 ve Laminin antikorlar ile ayirt tanımlaması

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...