Name: fabrication and characterization of layer-by-layer janus base nano-matrix to promote cartilage regeneration
Uploaded: 2022-07-06T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration at JoVE.com

Dette arbejde understøttes af NIH-tilskud 7R01AR072027 og 7R03AR069383, NSF Career Award 1905785, NSF 2025362 og University of Connecticut. Dette arbejde støttes også delvist af NIH-bevillingen S10OD016435.

1. Syntese af JBNts
<ol><li>Forbered JBNt-monomeren ved hjælp af tidligere offentliggjorte metoder, der involverer syntesen af en række forbindelser12.</li>
	<li>Rens rå JBNt-monomer, efter at den er blevet syntetiseret med højtydende væskekromatografi (HPLC) ved hjælp af en omvendt fasekolonne. Brug opløsningsmiddel A: 100% vand, opløsningsmiddel B: 100% acetonitril og opløsningsmiddel C: HCI-vandopløsning med pH = 1. Brug en strømningshastighed på 3 ml/min. Saml de...

<ol>
	<li>Chan, B. P., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolding+in+tissue+engineering:+general+approaches+and+tissue-specific+considerations.">Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations.</a> European Spine Journal. 17, 467-479 (2008).</li><li>Heo, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+carbohydrazide-modified+gelatin+into+microparticle-suspended+oxidized+alginate+for+the+fabrication+of+complex-shaped+tissue+constructs.">3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs.</a> ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).</li><li>Almeida, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+shape-memory+alginate+scaffolds+functionalized+with+either+type+i+or+type+ii+collagen+for+cartilage+tissue+engineering.">Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).</li><li>Vinatier, C., Guicheux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+tissue+engineering:+From+biomaterials+and+stem+cells+to+osteoarthritis+treatments.">Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments.</a> Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).</li><li>Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-based+repair+for+cartilage+healing:+a+systematic+review+and+technical+note.">Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note.</a> Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).</li><li>James, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+clinical+side+effects+of+bone+morphogenetic+protein-2.">A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).</li><li>Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+and+osteoarthritis.">TGF-beta and osteoarthritis.</a> Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).</li><li>Chen, Y., Yang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-articular+drug+delivery+systems+for+arthritis+treatment.">Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment.</a> Rheumatology Current Research. 2, 106 (2012).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressing+mesenchymal+stem+cell+hypertrophy+and+endochondral+ossification+in+3D+cartilage+regeneration+with+nanofibrous+poly(l-lactic+acid)+scaffold+and+matrilin-3.">Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3.</a> Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).</li><li>Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+for+incorporating+hydrophobic+drugs+in+physiological+environments.">Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+biomimetic+Nano-Matrix+for+stem+cell+anchorage.">Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).</li><li>Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+biomimetic+nano-matrix+with+janus+base+nanotubes+and+fibronectin+for+stem+cell+adhesion.">Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion.</a> Journal of Visualized Experiments. (159), e61317 (2020).</li><li>Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+encapsulate+and+slowly+release+dexamethasone.">Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotube/hydrogel+composites+for+cartilage+tissue+engineering.">Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).</li><li>Yu, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+biomedical+techniques+for+gene+delivery.">Advanced biomedical techniques for gene delivery.</a> Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).</li><li>Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrilin-3+role+in+cartilage+development+and+osteoarthritis).">Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis).</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590 (2016).</li><li>Pei, M., Luo, J., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+and+maintaining+chondrogenesis+of+synovial+fibroblasts+by+cartilage+extracellular+matrix+protein+matrilins.">Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins.</a> Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).</li><li>Bello, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrilin3/TGFbeta3+gelatin+microparticles+promote+chondrogenesis,+prevent+hypertrophy,+and+induce+paracrine+release+in+MSC+spheroid+for+disc+regeneration.">Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration.</a> NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50 (2021).</li><li>Muttigi, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrilin-3+codelivery+with+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+promotes+articular+cartilage+regeneration+in+a+rat+osteochondral+defect+model.">Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).</li><li>Jayasuriya, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrilin-3+chondrodysplasia+mutations+cause+attenuated+chondrogenesis,+premature+hypertrophy+and+aberrant+response+to+TGF-beta+in+chondroprogenitor+cells.">Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).</li><li>Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+Beta+family:+insight+into+the+role+of+growth+factors+in+regulation+of+fracture+healing+biology+and+potential+clinical+applications.">Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications.</a> Mediators of Inflammation. 2015, 137823 (2015).</li><li>Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+osteogenesis+by+bovine+platelet+transforming+growth+factor-beta+(TGF-beta)+in+adult+mouse+femur.">Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur.</a> Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-miRNA+oligonucleotide+therapy+for+chondrosarcoma).">Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma).</a> Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).</li><li>Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+tissue+microenvironment+on+stem+cell-based+cartilage+repair.">The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+mechanical+activation+of+anabolic+transcripts+and+post-traumatic+cartilage+degeneration+in+matrilin-1+knockout+mice.">Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice.</a> PLoS One. 11 (6), 0156676 (2016).</li><li>Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+self-assembly+of+DNA-mimicking+nanotubes+to+form+a+layer-by-layer+scaffold+for+homeostatic+tissue+constructs.">Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs.</a> ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).</li><li>Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+matrilin-3+(MATN3).">Characterization of human matrilin-3 (MATN3).</a> Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).</li><li>Yau, A., Yu, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+detection+with+fluorescence-base+imaging+techniques+for+arthritis+diagnosis.">mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis.</a> Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).</li><li>Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-inspired+nanomaterials+for+enhanced+endosomal+escape.">DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).</li><li>Zhang, W., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+engineering+of+DNA-inspired+Janus+base+nanomaterials.">Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials.</a> Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670 (2019).</li><li>Yau, A., Sands, I., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-scale+surface+modifications+to+advance+current+treatment+options+for+cervical+degenerative+disc+disease+(CDDD).">Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD).</a> Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147 (2019).</li><li>Mello, M. A., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+TGF-beta1+and+triiodothyronine+on+cartilage+maturation:+in+vitro+analysis+using+long-term+high-density+micromass+cultures+of+chick+embryonic+limb+mesenchymal+cells.">Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells.</a> Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).</li><li>Shi, Y., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+TGF-beta+signaling+from+cell+membrane+to+the+nucleus.">Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus.</a> Cell. 113 (6), 685-700 (2003).</li><li>Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+delivery+via+DNA-inspired+janus+base+nanotubes+for+extracellular+matrix+penetration.">RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration.</a> MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).</li><li>Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+interfering+RNA+(siRNA)-based+therapeutics+for+cartilage+diseases.">Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases.</a> Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).</li><li>Bi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+of+PEG+onto+PMMA+microchannel+surface+to+minimize+nonspecific+adsorption.">Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption.</a> Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).</li><li>Chen, Y., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+osteoblast+functions+in+the+presence+of+BMP-7+short+peptides+for+nanostructured+biomaterial+applications.">Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).</li><li>Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+nanoparticle+delivery+with+in+vitro+bio-engineered+microtissues.">Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues.</a> Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).</li><li>Yau, A., Lee, J., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterials+for+protein+delivery+in+anticancer+applications.">Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications.</a> Pharmaceutics. 13 (2), 155 (2021).</li></ol>

Målet med denne undersøgelse er at udvikle en biomimetisk stilladsplatform, JBNm, for at overvinde begrænsningerne ved konventionelle vævskonstruktioner, der er afhængige af cellekulturmiljøer for at formidle celledifferentiering. JBNm er et lag-for-lag strukturstillads til en selvbærende bruskvævskonstruktion. Det innovative design er baseret på nye DNA-inspirerede nanomaterialer, JBNts. JBNm, der består af JBNts30, TGF-β1 og matrilin-3, er samlet gennem en ny lag-for-lag-teknik, hvor ...

Stilladser inden for vævsteknik spiller en afgørende rolle i at yde strukturel støtte til cellebinding og efterfølgende vævsudvikling1. Typisk er konventionelle vævskonstruktioner uden stilladser afhængige af cellekulturmiljøet og tilføjede vækstfaktorer for at formidle celledifferentiering. Desuden er denne tilsætning af bioaktive molekyler til stilladser ofte den foretrukne tilgang til styring af celledifferentiering og funktion 2,3. Nogle stilladser kan efterligne det biokemiske mikromiljø af naturligt væv uafhængigt, mens andre direkte kan påvirke cellefunktioner via vækstfaktorer. Forskere støder dog ofte på udfordringer med at vælge stilladser, der kan påvirke celleadhæsion, vækst og differentiering positivt, samtidig med at de giver optimal strukturel støtte og stabilitet over en lang periode 4,5. De bioaktive molekyler er ofte løst bundet til stilladset, hvilket fører til hurtig frigivelse af disse proteiner ved implantation, hvilket resulterer i deres frigivelse på uønskede steder. Dette kulminerer i bivirkninger på væv eller celler, der ikke bevidst blev målrettet 6,7.
Stilladser er typisk lavet af polymere materialer. Janus base nano-matrix (JBNm) er en biomimetisk stilladsplatform skabt med en ny lag-for-lag metode til selvbærende bruskvævskonstruktion8. Disse nye DNA-inspirerede nanorør er blevet navngivet Janus base nanorør (JBNts), da de korrekt efterligner strukturen og overfladekemien af kollagen, der findes i den ekstracellulære matrix (ECM). Med tilføjelsen af bioaktive molekyler, såsom matrilin-3 og Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1), kan JBNm skabe et optimalt mikromiljø, som derefter kan stimulere ønsket celle- og vævsfunktionalitet9.
JBNts er nye nanorør afledt af syntetiske versioner af nukleobase-adenin og thymin. JBNts dannes gennem selvmontering10; Seks syntetiske nukleobaser binder sig til dannelse af en ring, og disse ringe gennemgår π-π stablingsinteraktioner for at skabe et nanorør 200-300 μm i længde11. Disse nanorør ligner strukturelt kollagenproteiner; ved at efterligne et aspekt af det indfødte bruskmikromiljø har JBNts vist sig at give et gunstigt fastgørelsessted for chondrocytter og humane mesenkymale stamceller (hMSC'er)11,12,13,14. Fordi nanorørene gennemgår selvmontering og ikke kræver nogen form for initiator (såsom UV-lys), viser de spændende potentiale som et injicerbart stillads til svært tilgængelige defektområder15.
Matrilin-3 er et strukturelt ekstracellulært matrixprotein, der findes i brusk. Dette protein spiller en væsentlig rolle i chondrogenese og korrekt bruskfunktion16,17. For nylig er det blevet inkluderet i biomateriale stilladser, der tilskynder til chondrogenese uden hypertrofi 9,18,19. Ved at inkludere dette protein i JBNm tiltrækkes bruskceller til et stillads, der indeholder lignende komponenter som dets oprindelige mikromiljø. Derudover har det vist sig, at matrilin-3 er nødvendig for korrekt TGF-β1-signalering inden for kondrocytter20. Vækstfaktorer fungerer som signalmolekyler, der forårsager specifik vækst af en bestemt celle eller væv. For at opnå optimal bruskregenerering er matrilin-3 og TGF-β1 væsentlige komponenter inden for JBNm. Tilsætningen af TGF-β1 i stilladset lag for lag kan yderligere fremme bruskregenerering i en vævskonstruktion. TGF-β1 er en vækstfaktor, der anvendes til at fremme helingsprocessen af osteochondrale defekter, tilskynde til chondrocyt og hMSC-spredning og differentiering21,22. TGF-β1 spiller således en nøglerolle i bruskregenereringen JBNm (J / T / M JBNm)23, hvilket tilskynder til korrekt vækst, især når den er lokaliseret inden for JBNm-lagene.
Som tidligere nævnt samles vækstfaktorer typisk på ydersiden af stilladser uden specifikke metoder til inkorporering. Her, med biomaterialernes præcist designede nanoarkitektur, blev JBNm udviklet til specifik målretning af tilsigtede celler og væv. JBNm består af TGF-β1 klæbet på JBNt-overflader i det indre lag og matrilin-3 klæbet på JBNt-overflader i det ydre lag24,25. Inkorporeringen af TGF-β1 i det indre lag af lag-for-lag-strukturen muliggør et stærkt lokaliseret mikromiljø langs JBNm-fibrene, hvilket skaber en homeostatisk vævskonstruktion med en meget langsommere frigivelse af proteinet12. JBNm's injicerbarhed gør det til en ideel bruskvævskonstruktion til forskellige fremtidige biomaterialeanvendelser26.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 % Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50062Z</td>
			<td>Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-740</td>
			<td>24-well plate used for comparative cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-Well Black Untreated Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>262260</td>
			<td>384-well plate used for absorption measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chambered coverglass</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>155409PK</td>
			<td>8-well coverglass used for comparative cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-91</td>
			<td>96-well plate used for comparative cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Plate non- treated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>260895</td>
			<td>96-well plate used for comparative cell culture and analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Hydrogel used for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Gel</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Hydrogel used as an environment for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A30006 (488) and A30007 (555)</td>
			<td>Fluorescent dye used to label proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen X Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>41-9771-82</td>
			<td>Antibody used to stain collagen-X.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad PCR Machine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to perform PCR on samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C28/I2 Chondrocyte Cell Line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit 8</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>96992</td>
			<td>Cell proliferation assay.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Profiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Software used to analyze cell images.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>FISHER Scientific</td>
			<td>14-955-128</td>
			<td>Container used for spectrophotometry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Cell Culture Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566032</td>
			<td>Media used to support cellular growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A4766801</td>
			<td>Serum used in cell culture medium to support cell growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td>Solution used to mount slides for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Compound used to fix samples prior to microtoming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A16110</td>
			<td>Antibody used for protein staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>PT-2501</td>
			<td>Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>PT-3003</td>
			<td>Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software used in conjunction with microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>itaq Universal SYBR Green One-Step Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725150</td>
			<td>Kit used for PCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janus-base nanotubes (JBNts)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope</td>
			<td>Tecnai</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Statistical software used for modeling and data analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrilin-3</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3017MN050</td>
			<td>Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to measure absorption values of a sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Spectral Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R HD25</td>
			<td>Confocal microscope used to analyze samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Number 1.5 Chamber Coverglass</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>152250</td>
			<td>Environment for sterile cell culture and imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Compound Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Compound used to embed cells prior to microtoming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td>Compound used to fix cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDC-32G Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td></td>
			<td>Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15-140-148</td>
			<td>Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R415</td>
			<td>F-Actin red fluorescent dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Plant Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74904</td>
			<td>Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution used to process samples prior to microtoming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF beta-1 Human ELISA Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>BMS249-4</td>
			<td>Assay kit used to determine the presence of TGF-&#946;1 in a sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-21C</td>
			<td>Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HFH10</td>
			<td>Compound used to lyse cells not fixed during staining process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Reagent used to isolate RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and characterization of layer-by-layer janus base nano-matrix to promote cartilage regeneration

Forskellige biomateriale stilladser er blevet udviklet til at styre celleadhæsion og spredning i håb om at fremme specifikke funktioner til in vitro og in vivo anvendelser. Tilsætningen af vækstfaktorer i disse biomaterialestilladser udføres generelt for at give et optimalt cellekulturmiljø, medierende celledifferentiering og dets efterfølgende funktioner. Imidlertid er vækstfaktorerne i et konventionelt biomaterialestillads typisk designet til at blive frigivet ved implantation, hvilket kan resultere i utilsigtede bivirkninger på omgivende væv eller celler. Her har den DNA-inspirerede Janus base nano-matrix (JBNm) med succes opnået et meget lokaliseret mikromiljø med en lag-for-lag struktur til selvbærende bruskvævskonstruktioner. JBNms er selvsamlet fra Janus base nanorør (JBNts), matrilin-3 og transformerende vækstfaktor beta-1 (TGF-β1) via bioaffinitet. JBNm blev samlet i et TGF-β1: matrilin-3: JBNt-forhold på 1: 4: 10, da dette har været det bestemte forhold, hvor korrekt samling i lag-for-lag-strukturen kunne forekomme. Først blev TGF-β1-opløsningen tilsat til matrilin-3-opløsningen. Derefter blev denne blanding pipetteret flere gange for at sikre tilstrækkelig homogenitet før tilsætningen af JBNt-opløsningen. Dette dannede lag for lag JBNm efter pipettering flere gange igen. En række eksperimenter blev udført for at karakterisere JBNm-strukturen lag for lag, JBNts alene, matrilin-3 alene og TGF-β1 alene. Dannelsen af JBNm blev undersøgt med UV-Vis absorptionsspektre, og strukturen af JBNm blev observeret med transmissionselektronmikroskopi (TEM). Da det innovative JBNm-stillads lag for lag dannes i molekylær skala, kunne det fluorescerende farvestofmærkede JBNm observeres. TGF-β1 er begrænset inden for det indre lag af den injicerbare JBNm, som kan forhindre frigivelse af vækstfaktorer til omkringliggende områder, fremme lokaliseret chondrogenese og fremme et antihypertrofisk mikromiljø.

Efter protokollen blev JBNts med succes syntetiseret og karakteriseret med UV-Vis-absorption og TEM. JBNm er et injicerbart fast stillads, der gennemgår en hurtig biomimetisk proces. Efter at JBNts blev tilsat til en blanding af TGF-β1/matrilin-3-opløsning i et fysiologisk miljø, blev der dannet et fast hvidmasket stillads, der indikerer den vellykkede samling af JBNm, som det ses i figur 1. Dette blev demonstreret i karakteriseringsmetoderne.
Under fysiologis...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration at JoVE.com

Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration

Denne protokol beskriver samlingen af et lag for lag Janus base nano-matrix (JBNm) stillads ved at tilføje Janus base nanorør (JBNts), matrilin-3 og Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1) sekventielt. JBNm blev fabrikeret og karakteriseret; Derudover viste den fremragende bioaktivitet og tilskyndede cellefunktioner såsom vedhæftning, spredning og differentiering.

Fremstilling og karakterisering af lag-for-lag Janus base nano-matrix for at fremme bruskregenerering

Various biomaterial scaffolds have been developed to guide cell adhesion and proliferation in hopes to promote specific functions for in vitro and in vivo ...

Denne protokol viser, hvordan vi samlede og karakteriserede lag for lag JBNm på molekylært niveau. JBNm indkapsler TGF-B1 og forhindrer dets frigivelse i det omgivende væv og fremmer dermed lokaliseret chondrogenese. Dannelsen af JBNm er standardiseret, hvilket gør det muligt at danne forskellige JBNms til fremtidige applikationer.Den unikke lag for lag struktur giver mulighed for vækstfaktor indkapsling, hvilket skaber en stabil lokaliseret frigivelse, som undgår hypertrofi og opretholder vækst. JBNm giver et homeostatisk mikromiljø til regenerering af bruskvæv inden for et begrænset sted på grund af dets injicerbarhed, som kan bruges til forskellige scenarier, som uregelmæssigt formede brud eller hulrum. Til at begynde med tilsættes otte mikroliter et milligram pr. milliliter TGF-B1, suspenderet i vand til 32 mikroliter af et milligram pr. milliliter Matrilin-3 suspenderet i vand.Pipette for at sikre korrekt blanding af disse proteiner. Tilsæt 80 mikroliter af et milligram pr. Milliliter. Janus Base Nanorør, eller JBNts suspenderet i vand, til TGF-B1, Matrilin-3 opløsningen.Pipetter gentagne gange for at sikre korrekt blanding. For JBNt-gruppen tilsættes fem mikroliter et milligram pr. milliliter, JBNts til 50 mikroliter vand for at fremstille en opløsning på 90,9 mikrogram pr. milliliter. For Matrilin-3-gruppen tilsættes 40 mikroliter 10 mikrogram pr. milliliter Matrilin-3 til 15 mikroliter vand for at fremstille en 7,3 mikrogram pr. milliliter opløsning.For TGF-B1-gruppen tilsættes 10 mikroliter 10 mikrogram pr. milliliter TGF-B1 til 45 mikroliter vand for at fremstille en opløsning på 1,8 mikrogram pr. milliliter. For Janus Base Nano-Matrix eller JBNm-gruppen tilsættes 40 mikroliter 10 mikrogram pr. milliliter, Matrilin-3 til 10 mikroliter 10 mikrogram pr. milliliter TGF-B1. Agitere for at sikre korrekt blanding.Derefter tilsættes fem mikroliter af et milligram pr. milliliter JBNts til opløsningen, gentagne gange pipettering for at blande prøven. Ved hjælp af et spektrofotometer måles absorptionsspektret for hver gruppe. Mærk TGF-B1 ved hjælp af et proteinmærkningssæt efter producentens anvisninger.Tilsæt 20 mikroliter 20 mikrogram pr. milliliter, mærket TGF-B1, til 25 mikroliter vand for at fremstille en testopløsning på 8,9 mikrogram pr. milliliter. Mærk Matrilin-3 ved hjælp af et separat mærkningssæt. Tilsæt 20 mikroliter 80 mikrogram pr. milliliter mærket Matrilin-3 til 25 mikroliter vand for at fremstille en testopløsning på 36 mikrogram pr. milliliter.Bland 20 mikroliter 80 mikrogram pr. milliliter mærket Matrilin-3 med 20 mikroliter 20 mikrogram pr. milliliter mærket TGF-B1 og fem mikroliter vand, hvilket resulterer i en mærket TGF-B1, Matrilin-3-forbindelse. Pipetter blandingen flere gange for at blande. Tilsæt fem mikroliter af et milligram pr. milliliter JBNts til 40 mikroliter vand, hvilket resulterer i en 111 mikrogram pr. milliliter opløsning.Derefter tilsættes fem mikroliter et milligram pr. milliliter JBNts til den mærkede TGF-B1, Matrilin-3-opløsning og gentagne gange pipette for at blande forbindelsen. Hver prøvegruppe overføres til brønden på en sort 384-brøndplade. Indlæs pladen i en multi-mode mikropladelæser, og tag målinger ved excitationsbølgelængder på 488 og 555 nanometer efter producentens protokoller.Under fysiologiske forhold blev zeta-potentialespektret af Matrilin-3 negativt ladet på grund af dets isoelektriske punkt. Efter tilsætningen af TGF-B1 til Matrilin-3 steg zeta-potentialet for TGF-B1 Matrilin-3-forbindelsen til en næsten neutral værdi. JBNm's zetapotentiale var det højeste blandt de tre grupper.De UV-synlige absorptionsspektre bekræftede dannelsen af den hierarkiske lag for lag indvendige struktur af JBNm, de aromatiske ringe af lysinsidekæderne, og JBNts bidrog til absorptionstoppene ved henholdsvis 220 og 280 nanometer. TEM blev brugt til at karakterisere morfologien af JBNts og JBNm. Efter kombination med proteiner blev tykke bundter af JBNm observeret danne en stilladsstruktur.Fluorescensmikroskopi bekræftede tilstedeværelsen af lag for lagstruktur og demonstrerede tværsnittet af JBNm. Efter mærkning af den røde fluorescerende Matrilin-3 omsluttede JBNt-bundterne og dannede det ydre lag af JBNm, mens den grønne fluorescerende TGF-B1 dannede et indre lag. Fluorescensresonansenergioverførslen viste emissionstoppe ved 520 nanometer for mærkede TGF-B1-grupper og 570 nanometer for Matrilin-3-grupper.Effekten af JBNm på HMSC's vedhæftning og celleproliferation blev undersøgt. JBNm viste HMSC'er grupperet sammen med sig selv, mens færre celler overholdt JBNts. Justeringen af celler og størrelsen af cellerne på JBNm viste, at JBNts spillede en rolle i celleadhæsion, mens proteinerne øgede affiniteten af celleadhæsion.Efter dag et af cellekultur viste JBNm- og TGF-B1-grupper signifikant celleproliferation sammenlignet med de andre grupper. Da cellestrukturens varighed blev øget til tre og fem dage, viste JBNm- og TGF-B1-grupperne endnu mere øget celleproliferation. Når JBNm fluorescerende mærkes, er det vigtigt, at TGF-B1 og Matrilin-3 mærkes og blandes individuelt, før JBNts tilsættes, for at muliggøre korrekt dannelse af lag for lagstruktur.Yderligere vurdering af stilladset kan give en forståelse af, hvordan de er effektive i terapeutiske behandlinger. Mere specifikt kan et højt gennemstrømningsproliferationsassay bestemme den optimale dosis in vitro og senere in vivo. Denne nye NanoMatriX-skabelse giver forskere mulighed for at bruge et nanomaterialebaseret injicerbart stillads til at regenerere brusk.Denne polyefterlignende tilgang giver mulighed for forbedret androgenese og spredning af modsted.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Mikrofluid chip fabrikation og metode til at påvise Influenza

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Menneskelige bruskvæv Fabrication Brug Tre-dimensionel Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Fremstilling og karakterisering af en Conformal Hud-lignende elektroniske system for kvantitativ, Kutan Wound Management

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Layer-by-lags kollagenaflejring i mikrofluidapparater for Microtissue Stabilisering

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

En eksperimentel og Finite Element-protokollen til undersøgelse af Transport af Neutrale og sigtet Opløste stoffer tværs Ledbrusken

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D Magnetisk Stem Cell Aggregering og bioreaktor Modning til Brusk Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Fremstilling og karakterisering af Griffithsin-ændret Fiber stilladser til forebyggelse af seksuelt overførte infektioner

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

Fremstilling og karakterisering af optiske væv Phantoms indeholdende Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Fabrikation af Decellularized brusk-afledte Matrix stilladser

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...