Name: fabrication and characterization of layer-by-layer janus base nano-matrix to promote cartilage regeneration
Uploaded: 2022-07-06T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration at JoVE.com

Diese Arbeit wird durch die NIH-Zuschüsse 7R01AR072027 und 7R03AR069383, den NSF Career Award 1905785, die NSF 2025362 und die University of Connecticut unterstützt. Diese Arbeit wird teilweise auch durch den NIH-Zuschuss S10OD016435 unterstützt.

1. Synthese von JBNts
<ol><li>Herstellung des JBNt-Monomers unter Verwendung zuvor veröffentlichter Methoden, die die Synthese einer Vielzahl von Verbindungenbeinhalten 12.</li>
	<li>Reinigen Sie das rohe JBNt-Monomer, nachdem es mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Umkehrphasensäule synthetisiert wurde. Verwenden Sie Lösungsmittel A: 100% Wasser, Lösungsmittel B: 100% Acetonitril und Lösungsmittel C: HCl-Wasserlösung mit pH = 1. Verw...

<ol>
	<li>Chan, B. P., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolding+in+tissue+engineering:+general+approaches+and+tissue-specific+considerations.">Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations.</a> European Spine Journal. 17, 467-479 (2008).</li><li>Heo, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+carbohydrazide-modified+gelatin+into+microparticle-suspended+oxidized+alginate+for+the+fabrication+of+complex-shaped+tissue+constructs.">3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs.</a> ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).</li><li>Almeida, H. 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Das Ziel dieser Studie ist es, eine biomimetische Gerüstplattform, das JBNm, zu entwickeln, um die Einschränkungen herkömmlicher Gewebekonstrukte zu überwinden, die auf Zellkulturumgebungen angewiesen sind, um die Zelldifferenzierung zu vermitteln. Das JBNm ist ein Schicht-für-Schicht-Strukturgerüst für ein selbsttragendes Knorpelgewebekonstrukt. Das innovative Design basiert auf neuartigen DNA-inspirierten Nanomaterialien, den JBNts. Das JBNm, bestehend aus JBNts30, TGF-β1 und Matrilin-3,...

Gerüste im Tissue Engineering spielen eine wichtige Rolle bei der strukturellen Unterstützung der Zellanheftung und der anschließenden Gewebeentwicklung1. Typischerweise verlassen sich konventionelle Gewebekonstrukte ohne Gerüst auf die Zellkulturumgebung und zusätzliche Wachstumsfaktoren, um die Zelldifferenzierung zu vermitteln. Darüber hinaus ist diese Zugabe von bioaktiven Molekülen in Gerüste oft der bevorzugte Ansatz zur Steuerung der Zelldifferenzierung und -funktion 2,3. Einige Gerüste können die biochemische Mikroumgebung nativer Gewebe unabhängig voneinander nachahmen, während andere die Zellfunktionen über Wachstumsfaktoren direkt beeinflussen können. Forscher stoßen jedoch häufig auf Herausforderungen bei der Auswahl von Gerüsten, die die Zelladhäsion, das Wachstum und die Differenzierung positiv beeinflussen und gleichzeitig eine optimale strukturelle Unterstützung und Stabilität über einen langen Zeitraum bietenkönnten 4,5. Die bioaktiven Moleküle sind oft lose an das Gerüst gebunden, was zu einer schnellen Freisetzung dieser Proteine bei der Implantation führt, was zu ihrer Freisetzung an unerwünschten Stellen führt. Dies gipfelt in Nebenwirkungen auf Gewebe oder Zellen, die nicht absichtlich gezielt angegriffen wurden 6,7.
Gerüste bestehen typischerweise aus polymeren Materialien. Die Janus-Basis-Nanomatrix (JBNm) ist eine biomimetische Gerüstplattform, die mit einer neuartigen Schicht-für-Schicht-Methode für selbsttragendes Knorpelgewebekonstrukt8 erstellt wurde. Diese neuartigen DNA-inspirierten Nanoröhren wurden Janus-Basis-Nanoröhrchen (JBNts) genannt, da sie die Struktur und Oberflächenchemie von Kollagen in der extrazellulären Matrix (ECM) richtig nachahmen. Durch die Zugabe von bioaktiven Molekülen wie Matilin-3 und Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1) kann das JBNm eine optimale Mikroumgebung schaffen, die dann die gewünschte Zell- und Gewebefunktionalität stimulieren kann9.
JBNts sind neuartige Nanoröhrchen, die aus synthetischen Versionen der Nukleobase Adenin und Thymin gewonnen werden. Die JBNts werden durch Selbstorganisation10 gebildet; Sechs synthetische Nukleobasen verbinden sich zu einem Ring, und diese Ringe unterliegen π-π-Stapelwechselwirkungen, um eine Nanoröhre von 200-300 μm Länge11 zu erzeugen. Diese Nanoröhrchen ähneln strukturell Kollagenproteinen; Durch die Nachahmung eines Aspekts der nativen Knorpelmikroumgebung wurde gezeigt, dass JBNts eine günstige Bindungsstelle für Chondrozyten und humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) bieten11,12,13,14. Da die Nanoröhrchen einer Selbstorganisation unterzogen werden und keinerlei Initiator (wie UV-Licht) benötigen, zeigen sie ein aufregendes Potenzial als injizierbares Gerüst für schwer zugängliche Defektbereiche15.
Matrilin-3 ist ein strukturelles extrazelluläres Matrixprotein, das im Knorpel vorkommt. Dieses Protein spielt eine bedeutende Rolle bei der Chondrogenese und der richtigen Knorpelfunktion16,17. Vor kurzem wurde es in Biomaterialgerüste aufgenommen, was die Chondrogenese ohne Hypertrophie fördert 9,18,19. Durch die Aufnahme dieses Proteins in das JBNm werden Knorpelzellen von einem Gerüst angezogen, das ähnliche Komponenten wie seine native Mikroumgebung enthält. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Matrilin-3 für die korrekte TGF-β1-Signalisierung innerhalb der Chondrozytenbenötigt wird 20. Wachstumsfaktoren fungieren als Signalmoleküle und verursachen spezifisches Wachstum einer bestimmten Zelle oder eines bestimmten Gewebes. Um eine optimale Knorpelregeneration zu erreichen, sind Matrilin-3 und TGF-β1 wesentliche Bestandteile innerhalb des JBNm. Die Zugabe von TGF-β1 in das schichtweise Gerüst kann die Knorpelregeneration in einem Gewebekonstrukt weiter fördern. TGF-β1 ist ein Wachstumsfaktor, der eingesetzt wird, um den Heilungsprozess von osteochondralen Defekten zu fördern und die Proliferation und Differenzierung von Chondrozyten und hMSC zu fördern21,22. Somit spielt TGF-β1 eine Schlüsselrolle bei der Knorpelregeneration JBNm (J/T/M JBNm)23 und fördert das richtige Wachstum, insbesondere wenn es innerhalb der JBNm-Schichten lokalisiert ist.
Wie bereits erwähnt, werden Wachstumsfaktoren typischerweise auf der Außenseite von Gerüsten ohne spezifische Einbaumethoden montiert. Hier wurde mit der präzise gestalteten Nanoarchitektur der Biomaterialien das JBNm für das spezifische Targeting von beabsichtigten Zellen und Geweben entwickelt. Das JBNm besteht aus TGF-β1, das auf JBNt-Oberflächen in der inneren Schicht und Matrilin-3 auf JBNt-Oberflächen in der äußeren Schicht24,25 haftet. Der Einbau von TGF-β1 in die innere Schicht der Schicht-für-Schicht-Struktur ermöglicht eine stark lokalisierte Mikroumgebung entlang der JBNm-Fasern, wodurch ein homöostatisches Gewebekonstrukt mit einer viel langsameren Freisetzung des Proteins12 entsteht. Die Injektionsfähigkeit des JBNm macht es zu einem idealen Knorpelgewebekonstrukt für verschiedene zukünftige Biomaterialanwendungen26.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>10 % Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50062Z</td>
			<td>Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-740</td>
			<td>24-well plate used for comparative cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-Well Black Untreated Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>262260</td>
			<td>384-well plate used for absorption measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chambered coverglass</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>155409PK</td>
			<td>8-well coverglass used for comparative cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-91</td>
			<td>96-well plate used for comparative cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Plate non- treated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>260895</td>
			<td>96-well plate used for comparative cell culture and analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Hydrogel used for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Gel</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Hydrogel used as an environment for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A30006 (488) and A30007 (555)</td>
			<td>Fluorescent dye used to label proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen X Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>41-9771-82</td>
			<td>Antibody used to stain collagen-X.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad PCR Machine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to perform PCR on samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C28/I2 Chondrocyte Cell Line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit 8</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>96992</td>
			<td>Cell proliferation assay.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Profiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Software used to analyze cell images.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>FISHER Scientific</td>
			<td>14-955-128</td>
			<td>Container used for spectrophotometry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Cell Culture Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566032</td>
			<td>Media used to support cellular growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A4766801</td>
			<td>Serum used in cell culture medium to support cell growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td>Solution used to mount slides for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Compound used to fix samples prior to microtoming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A16110</td>
			<td>Antibody used for protein staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>PT-2501</td>
			<td>Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>PT-3003</td>
			<td>Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software used in conjunction with microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>itaq Universal SYBR Green One-Step Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725150</td>
			<td>Kit used for PCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janus-base nanotubes (JBNts)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope</td>
			<td>Tecnai</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Statistical software used for modeling and data analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrilin-3</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3017MN050</td>
			<td>Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to measure absorption values of a sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Spectral Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R HD25</td>
			<td>Confocal microscope used to analyze samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Number 1.5 Chamber Coverglass</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>152250</td>
			<td>Environment for sterile cell culture and imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Compound Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Compound used to embed cells prior to microtoming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td>Compound used to fix cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDC-32G Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td></td>
			<td>Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15-140-148</td>
			<td>Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R415</td>
			<td>F-Actin red fluorescent dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Plant Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74904</td>
			<td>Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution used to process samples prior to microtoming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF beta-1 Human ELISA Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>BMS249-4</td>
			<td>Assay kit used to determine the presence of TGF-&#946;1 in a sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-21C</td>
			<td>Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HFH10</td>
			<td>Compound used to lyse cells not fixed during staining process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Reagent used to isolate RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and characterization of layer-by-layer janus base nano-matrix to promote cartilage regeneration

Verschiedene Biomaterial-Scaffolds wurden entwickelt, um die Zelladhäsion und -proliferation zu steuern, in der Hoffnung, spezifische Funktionen für In-vitro - und In-vivo-Anwendungen zu fördern. Die Zugabe von Wachstumsfaktoren in diese Biomaterialgerüste erfolgt im Allgemeinen, um eine optimale Zellkulturumgebung zu schaffen, die die Zelldifferenzierung und ihre nachfolgenden Funktionen vermittelt. Die Wachstumsfaktoren in einem herkömmlichen Biomaterialgerüst sind jedoch typischerweise so konzipiert, dass sie bei der Implantation freigesetzt werden, was zu unbeabsichtigten Nebenwirkungen auf das umgebende Gewebe oder die Zellen führen kann. Hier ist es der DNA-inspirierten Janus-Basis-Nanomatrix (JBNm) gelungen, eine hochlokalisierte Mikroumgebung mit einer Schicht-für-Schicht-Struktur für selbsttragende Knorpelgewebekonstrukte zu erreichen. JBNms sind selbstorganisierend aus Janus-Basis-Nanoröhrchen (JBNts), Matrilin-3 und dem transformierenden Wachstumsfaktor beta-1 (TGF-β1) über Bioaffinität. Der JBNm wurde in einem TGF-β1:matrilin-3:JBNt-Verhältnis von 1:4:10 zusammengebaut, da dies das bestimmte Verhältnis war, bei dem eine ordnungsgemäße Montage in die Schicht-für-Schicht-Struktur erfolgen konnte. Zunächst wurde die TGF-β1-Lösung zur Matrilin-3-Lösung gegeben. Dann wurde diese Mischung mehrmals pipettiert, um eine ausreichende Homogenität vor der Zugabe der JBNt-Lösung zu gewährleisten. Dieser bildete Schicht für Schicht JBNm, nachdem er erneut mehrfach pipettiert hatte. Eine Vielzahl von Experimenten wurde durchgeführt, um die Schicht-für-Schicht-JBNm-Struktur, JBNts allein, Matilin-3 allein und TGF-β1 allein zu charakterisieren. Die Bildung von JBNm wurde mit UV-Vis-Absorptionsspektren untersucht, und die Struktur des JBNm wurde mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) beobachtet. Da das innovative schichtweise JBNm-Gerüst auf molekularer Ebene gebildet wird, konnte der fluoreszierende Farbstoff JBNm beobachtet werden. Das TGF-β1 ist in der inneren Schicht des injizierbaren JBNm eingeschlossen, was die Freisetzung von Wachstumsfaktoren in die Umgebung verhindern, die lokalisierte Chondrogenese fördern und eine antihypertrophe Mikroumgebung fördern kann.

Nach dem Protokoll wurden JBNts erfolgreich synthetisiert und mit UV-Vis-Absorption und TEM charakterisiert. Das JBNm ist ein injizierbares festes Gerüst, das einen schnellen biomimetischen Prozess durchläuft. Nachdem JBNts zu einer Mischung aus TGF-β1/Matrilin-3-Lösung in einer physiologischen Umgebung gegeben wurden, bildete sich ein festes Weißmaschengerüst, das auf den erfolgreichen Zusammenbau von JBNm hinweist, wie in Abbildung 1 zu sehen ist. Dies wurde in den Charakterisierungs...

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Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration

Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines Schicht-für-Schicht-Janus-Basis-Nanomatrix-Gerüsts (JBNm) durch nacheinander Hinzufügen von Janus-Basis-Nanoröhren (JBNts), Matrilin-3 und Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1). Der JBNm wurde hergestellt und charakterisiert; Darüber hinaus zeigte es eine ausgezeichnete Bioaktivität, die Zellfunktionen wie Adhäsion, Proliferation und Differenzierung fördert.

Herstellung und Charakterisierung von Schicht-für-Schicht-Janus-Basis-Nano-Matrix zur Förderung der Knorpelregeneration

Various biomaterial scaffolds have been developed to guide cell adhesion and proliferation in hopes to promote specific functions for in vitro and in vivo ...

Dieses Protokoll zeigt, wie wir das JBNm Schicht für Schicht auf molekularer Ebene zusammengesetzt und charakterisiert haben. JBNm kapselt TGF-B1 ein und verhindert seine Freisetzung im umgebenden Gewebe, wodurch die lokalisierte Chondrogenese gefördert wird. Die Bildung des JBNm ist standardisiert, so dass verschiedene JBNms für zukünftige Anwendungen gebildet werden können.Die einzigartige Schicht-für-Schicht-Struktur ermöglicht eine Wachstumsfaktorverkapselung, wodurch eine stetige lokalisierte Freisetzung entsteht, die Hypertrophie vermeidet und das Wachstum aufrechterhält. JBNm bietet aufgrund seiner Injektionsfähigkeit eine homöostatische Mikroumgebung für die Regeneration von Knorpelgewebe an einem begrenzten Ort, die für verschiedene Szenarien wie unregelmäßig geformte Frakturen oder Hohlräume verwendet werden kann. Um zu beginnen, fügen Sie acht Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter TGF-B1, suspendiert in Wasser zu 32 Mikrolitern von einem Milligramm pro Milliliter Matrilin-3 in Wasser suspendiert.Pipetten, um das richtige Mischen dieser Proteine zu gewährleisten. Fügen Sie 80 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter hinzu. Janus Base Nanotubes, oder JBNts suspendiert in Wasser, zur TGF-B1, Matrilin-3 Lösung.Pipetten Sie wiederholt, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten. Für die JBNt-Gruppe fügen Sie fünf Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter, JBNts zu 50 Mikrolitern Wasser hinzu, um eine 90,9 Mikrogramm pro Milliliter Lösung zu erhalten. Für die Matrilin-3-Gruppe fügen Sie 40 Mikroliter von 10 Mikrogramm pro Milliliter Matrilin-3 zu 15 Mikrolitern Wasser hinzu, um eine Lösung von 7,3 Mikrogramm pro Milliliter herzustellen.Für die TGF-B1-Gruppe fügen Sie 10 Mikroliter von 10 Mikrogramm pro Milliliter TGF-B1 zu 45 Mikrolitern Wasser hinzu, um eine Lösung von 1,8 Mikrogramm pro Milliliter herzustellen. Für die Janus Base Nano-Matrix oder JBNm-Gruppe fügen Sie 40 Mikroliter von 10 Mikrogramm pro Milliliter, Matrilin-3 bis 10 Mikroliter von 10 Mikrogramm pro Milliliter TGF-B1 hinzu. Rühren, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten.Dann fügen Sie der Lösung fünf Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter JBNts hinzu und pipettieren Sie wiederholt, um die Probe zu mischen. Messen Sie mit einem Spektralphotometer das Absorptionsspektrum jeder Gruppe. Kennzeichnen Sie den TGF-B1 mit einem Proteinmarkierungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.Fügen Sie 20 Mikroliter von 20 Mikrogramm pro Milliliter, gekennzeichnet mit TGF-B1, zu 25 Mikrolitern Wasser hinzu, um eine 8,9 Mikrogramm pro Milliliter Testlösung zu erhalten. Beschriften Sie den Matrilin-3 mit einem separaten Beschriftungskit. Fügen Sie 20 Mikroliter von 80 Mikrogramm pro Milliliter markiertem Matrilin-3 zu 25 Mikrolitern Wasser hinzu, um eine Testlösung von 36 Mikrogramm pro Milliliter herzustellen.Mischen Sie 20 Mikroliter von 80 Mikrogramm pro Milliliter markiertem Matrilin-3 mit 20 Mikrolitern von 20 Mikrogramm pro Milliliter markiertem TGF-B1 und fünf Mikrolitern Wasser, was zu einer markierten TGF-B1, Matrilin-3-Verbindung führt. Pipetten Sie die Mischung mehrmals, um sie zu mischen. Fügen Sie fünf Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter JBNts zu 40 Mikrolitern Wasser hinzu, was zu einer Lösung von 111 Mikrogramm pro Milliliter führt.Dann fügen Sie fünf Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter JBNts zu der markierten TGF-B1, Matrilin-3-Lösung hinzu und pipetten Sie wiederholt, um die Verbindung zu mischen. Übertragen Sie jede Probengruppe in die Vertiefung einer schwarzen 384-Well-Platte. Laden Sie die Platte in einen Multimode-Mikroplattenleser und messen Sie bei Anregungswellenlängen von 488 und 555 Nanometern gemäß den Protokollen des Herstellers.Unter physiologischen Bedingungen war das Zetapotentialspektrum von Matrilin-3 aufgrund seines isoelektrischen Punktes negativ geladen. Nach der Zugabe des TGF-B1 zum Matrilin-3 stieg das Zetapotential der TGF-B1 Matrilin-3-Verbindung auf einen nahezu neutralen Wert. Das Zetapotential von JBNm war das höchste unter den drei Gruppen.Die UV-sichtbaren Absorptionsspektren bestätigten die Bildung der hierarchischen Schicht-für-Schicht-Innenstruktur des JBNm, der aromatischen Ringe der Lysinseitenketten und der JBNts trugen mit 220 bzw. 280 Nanometern zu den Absorptionsspitzen bei. TEM wurde verwendet, um die Morphologie der JBNts und JBNm zu charakterisieren. Nach der Kombination mit Proteinen wurden dicke Bündel von JBNm beobachtet, die eine Gerüststruktur bildeten.Die Fluoreszenzmikroskopie bestätigte das Vorhandensein der Schichtstruktur und demonstrierte den Querschnitt des JBNm. Nach der Markierung umhüllte das rot fluoreszierende Matrilin-3 die JBNt-Bündel und bildete die äußere Schicht des JBNm, während das grün fluoreszierende TGF-B1 eine innere Schicht bildete. Der Fluoreszenzresonanzenergietransfer zeigte Emissionsspitzen bei 520 Nanometern für markierte TGF-B1-Gruppen und 570 Nanometer für Matrilin-3-Gruppen.Die Wirkung von JBNm auf die Adhäsion und Zellproliferation von HMSC wurde untersucht. Der JBNm zeigte, dass HMSCs zusammen mit sich selbst gruppiert waren, während weniger Zellen an JBNts hafteten. Die Ausrichtung der Zellen und die Größe der Zellen auf dem JBNm zeigten, dass JBNts eine Rolle bei der Zelladhäsion spielten, während die Proteine die Affinität der Zelladhäsion erhöhten.Nach dem ersten Tag der Zellkultur zeigten die JBNm- und TGF-B1-Gruppen im Vergleich zu den anderen Gruppen eine signifikante Zellproliferation. Wenn die Zellstrukturdauer auf drei und fünf Tage erhöht wurde, zeigten die JBNm- und TGF-B1-Gruppen eine noch erhöhte Zellproliferation. Bei der fluoreszierenden Markierung des JBNm ist es wichtig, dass TGF-B1 und Matrilin-3 vor dem Hinzufügen der JBNts einzeln markiert und gemischt werden, um eine korrekte Bildung der Schichtstruktur zu ermöglichen.Eine weitere Beurteilung des Gerüsts kann ein Verständnis dafür liefern, wie sie bei therapeutischen Behandlungen wirksam sind. Genauer gesagt kann ein Hochdurchsatz-Proliferationstest die optimale Dosierung in vitro und später in vivo bestimmen. Diese neuartige NanoMatriX-Kreation ermöglicht es Forschern, ein injizierbares Gerüst auf Nanomaterialbasis zur Regeneration von Knorpel zu verwenden.Dieser Poly-Nachahmungsansatz ermöglicht eine verbesserte Androgenese und die Verbreitung von Gegenstellen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Mikrofluidischen Chip Herstellung und Verfahren zur Influenza Detect

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

Forschung

Biotechnik

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Menschliches Knorpelgewebe Herstellung unter Verwendung von dreidimensionalen Inkjet-Drucktechnologie

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Herstellung und Charakterisierung eines Conformal-Haut-like Electronic System for Quantitative, kutane Wundmanagement

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Schicht-für-Schicht der Kollagenabscheidung in Mikrofluidik-Vorrichtungen zum Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Eine experimentelle und Finite-Elemente-Protokoll den Transport von neutralen und geladenen gelösten Stoffen durch Gelenkknorpel zur Untersuchung

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D Magnetic Stem Cell Aggregation und Bioreactor Ausreifung für Knorpelregeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Herstellung und Charakterisierung von Griffithsin-modifizierte Faser Gerüste für die Prävention von sexuell übertragbare Infektionen

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

Herstellung und Charakterisierung von optischen Gewebe Phantome, die Makrostruktur enthalten

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Herstellung von Decellularized Knorpel abgeleitet Matrix Gerüste

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...