Name: fabrication and characterization of layer-by-layer janus base nano-matrix to promote cartilage regeneration
Uploaded: 2022-07-06T13:20:00
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この研究は、NIH助成金7R01AR072027および7R03AR069383、NSFキャリアアワード1905785、NSF 2025362、およびコネチカット大学のサポートを受けています。この作業は、NIH助成金S10OD016435によっても部分的にサポートされています。

1. JBNtsの合成
<ol><li>JBNtモノマーを調製するには、既報の方法を利用して、種々の化合物12を合成することを含む。</li>
	<li>精製後の粗JBNtモノマーは、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で精製します。溶媒A:100%水、溶媒B:100%アセトニトリル、および溶媒C:pH=1のHCl水溶液を使用してください。3 mL/分の流量を使用してください。HPLCで得られた最?...

<ol>
	<li>Chan, B. P., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolding+in+tissue+engineering:+general+approaches+and+tissue-specific+considerations.">Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations.</a> European Spine Journal. 17, 467-479 (2008).</li><li>Heo, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+carbohydrazide-modified+gelatin+into+microparticle-suspended+oxidized+alginate+for+the+fabrication+of+complex-shaped+tissue+constructs.">3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs.</a> ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).</li><li>Almeida, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+shape-memory+alginate+scaffolds+functionalized+with+either+type+i+or+type+ii+collagen+for+cartilage+tissue+engineering.">Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).</li><li>Vinatier, C., Guicheux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+tissue+engineering:+From+biomaterials+and+stem+cells+to+osteoarthritis+treatments.">Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments.</a> Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).</li><li>Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-based+repair+for+cartilage+healing:+a+systematic+review+and+technical+note.">Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note.</a> Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).</li><li>James, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+clinical+side+effects+of+bone+morphogenetic+protein-2.">A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).</li><li>Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+and+osteoarthritis.">TGF-beta and osteoarthritis.</a> Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).</li><li>Chen, Y., Yang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-articular+drug+delivery+systems+for+arthritis+treatment.">Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment.</a> Rheumatology Current Research. 2, 106 (2012).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressing+mesenchymal+stem+cell+hypertrophy+and+endochondral+ossification+in+3D+cartilage+regeneration+with+nanofibrous+poly(l-lactic+acid)+scaffold+and+matrilin-3.">Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3.</a> Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).</li><li>Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+for+incorporating+hydrophobic+drugs+in+physiological+environments.">Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+biomimetic+Nano-Matrix+for+stem+cell+anchorage.">Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).</li><li>Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+biomimetic+nano-matrix+with+janus+base+nanotubes+and+fibronectin+for+stem+cell+adhesion.">Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion.</a> Journal of Visualized Experiments. (159), e61317 (2020).</li><li>Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+encapsulate+and+slowly+release+dexamethasone.">Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotube/hydrogel+composites+for+cartilage+tissue+engineering.">Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).</li><li>Yu, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+biomedical+techniques+for+gene+delivery.">Advanced biomedical techniques for gene delivery.</a> Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).</li><li>Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrilin-3+role+in+cartilage+development+and+osteoarthritis).">Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis).</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590 (2016).</li><li>Pei, M., Luo, J., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+and+maintaining+chondrogenesis+of+synovial+fibroblasts+by+cartilage+extracellular+matrix+protein+matrilins.">Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins.</a> Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).</li><li>Bello, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrilin3/TGFbeta3+gelatin+microparticles+promote+chondrogenesis,+prevent+hypertrophy,+and+induce+paracrine+release+in+MSC+spheroid+for+disc+regeneration.">Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration.</a> NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50 (2021).</li><li>Muttigi, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrilin-3+codelivery+with+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+promotes+articular+cartilage+regeneration+in+a+rat+osteochondral+defect+model.">Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).</li><li>Jayasuriya, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrilin-3+chondrodysplasia+mutations+cause+attenuated+chondrogenesis,+premature+hypertrophy+and+aberrant+response+to+TGF-beta+in+chondroprogenitor+cells.">Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).</li><li>Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+Beta+family:+insight+into+the+role+of+growth+factors+in+regulation+of+fracture+healing+biology+and+potential+clinical+applications.">Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications.</a> Mediators of Inflammation. 2015, 137823 (2015).</li><li>Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+osteogenesis+by+bovine+platelet+transforming+growth+factor-beta+(TGF-beta)+in+adult+mouse+femur.">Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur.</a> Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-miRNA+oligonucleotide+therapy+for+chondrosarcoma).">Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma).</a> Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).</li><li>Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+tissue+microenvironment+on+stem+cell-based+cartilage+repair.">The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+mechanical+activation+of+anabolic+transcripts+and+post-traumatic+cartilage+degeneration+in+matrilin-1+knockout+mice.">Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice.</a> PLoS One. 11 (6), 0156676 (2016).</li><li>Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+self-assembly+of+DNA-mimicking+nanotubes+to+form+a+layer-by-layer+scaffold+for+homeostatic+tissue+constructs.">Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs.</a> ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).</li><li>Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+matrilin-3+(MATN3).">Characterization of human matrilin-3 (MATN3).</a> Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).</li><li>Yau, A., Yu, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+detection+with+fluorescence-base+imaging+techniques+for+arthritis+diagnosis.">mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis.</a> Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).</li><li>Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-inspired+nanomaterials+for+enhanced+endosomal+escape.">DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).</li><li>Zhang, W., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+engineering+of+DNA-inspired+Janus+base+nanomaterials.">Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials.</a> Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670 (2019).</li><li>Yau, A., Sands, I., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-scale+surface+modifications+to+advance+current+treatment+options+for+cervical+degenerative+disc+disease+(CDDD).">Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD).</a> Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147 (2019).</li><li>Mello, M. A., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+TGF-beta1+and+triiodothyronine+on+cartilage+maturation:+in+vitro+analysis+using+long-term+high-density+micromass+cultures+of+chick+embryonic+limb+mesenchymal+cells.">Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells.</a> Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).</li><li>Shi, Y., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+TGF-beta+signaling+from+cell+membrane+to+the+nucleus.">Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus.</a> Cell. 113 (6), 685-700 (2003).</li><li>Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+delivery+via+DNA-inspired+janus+base+nanotubes+for+extracellular+matrix+penetration.">RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration.</a> MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).</li><li>Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+interfering+RNA+(siRNA)-based+therapeutics+for+cartilage+diseases.">Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases.</a> Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).</li><li>Bi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+of+PEG+onto+PMMA+microchannel+surface+to+minimize+nonspecific+adsorption.">Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption.</a> Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).</li><li>Chen, Y., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+osteoblast+functions+in+the+presence+of+BMP-7+short+peptides+for+nanostructured+biomaterial+applications.">Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).</li><li>Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+nanoparticle+delivery+with+in+vitro+bio-engineered+microtissues.">Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues.</a> Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).</li><li>Yau, A., Lee, J., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterials+for+protein+delivery+in+anticancer+applications.">Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications.</a> Pharmaceutics. 13 (2), 155 (2021).</li></ol>

この研究の目標は、細胞分化を媒介するために細胞培養環境に依存する従来の組織構築物の限界を克服するために、生体模倣足場プラットフォームであるJBNmを開発することです。JBNmは、自立可能な軟骨組織構築のための層ごとの構造足場です。革新的なデザインは、DNAに触発された新しいナノ材料であるJBNtsに基づいています。JBNts30、TGF-β1、マトリリン-3からなるJBNmは、?...

組織工学における足場は、細胞の付着とその後の組織発生の構造的サポートを提供する上で重要な役割を果たします1。典型的には、足場のない従来の組織構築物は、細胞培養環境に依存し、細胞分化を媒介するために成長因子を添加した。さらに、足場への生理活性分子のこの添加は、細胞の分化と機能を導く上でしばしば好ましいアプローチです2,3。いくつかの足場は、天然組織の生化学的微小環境を独立して模倣することができますが、他の足場は成長因子を介して細胞機能に直接影響を与えることができます。しかし、研究者は、細胞の接着、成長、分化にプラスの影響を与える可能性のある足場を選択する際に、長期間にわたって最適な構造サポートと安定性を提供するという課題に直面することがよくあります4,5。生理活性分子は足場に緩く結合していることが多く、移植時にこれらのタンパク質が急速に放出され、望ましくない場所に放出されます。これは、意図的に標的とされなかった組織または細胞への副作用で最高潮に達します6,7。
足場は通常、高分子材料でできています。ヤヌスベースナノマトリックス(JBNm)は、自立可能な軟骨組織構築物のための新しい層ごとの方法で作成された生体模倣足場プラットフォームです8。これらの新しいDNAに触発されたナノチューブは、細胞外マトリックス(ECM)に見られるコラーゲンの構造と表面化学を適切に模倣しているため、ヤヌスベースナノチューブ(JBNts)と呼ばれています。マトリリン-3やトランスフォーミング成長因子β-1(TGF-β1)などの生理活性分子を添加することで、JBNmは最適な微小環境を作り出すことができ、それが所望の細胞および組織の機能を刺激することができる9。
JBNtsは、核酸塩基アデニンとチミンの合成バージョンに由来する新しいナノチューブです。JBNtsは自己組織化10によって形成されます。6つの合成核酸塩基が結合して環を形成し、これらの環はπ-πスタッキング相互作用を受けて、長さ200〜300μmのナノチューブを形成します11。これらのナノチューブは、コラーゲンタンパク質と構造的に類似しています。JBNtsは、天然の軟骨微小環境の側面を模倣することにより、軟骨細胞およびヒト間葉系幹細胞(hMSC)に好ましい付着部位を提供することが示されています11,12,13,14。ナノチューブは自己組織化され、いかなる種類のイニシエーター(UV光など)も必要としないため、到達困難な欠陥領域の注射可能な足場として刺激的な可能性を示します15。
マトリリン-3は、軟骨に見られる構造的な細胞外マトリックスタンパク質です。このタンパク質は、軟骨形成および適切な軟骨機能において重要な役割を果たしている16,17。最近、それは生体材料足場に含まれており、肥大を伴わない軟骨形成を促進する9、18、19。このタンパク質をJBNmに含めることにより、軟骨細胞は、その天然の微小環境と同様の成分を含む足場に引き付けられます。さらに、マトリリン-3は、軟骨細胞20内の適切なTGF-β1シグナル伝達に必要であることが示されています。成長因子はシグナル伝達分子として機能し、特定の細胞または組織の特異的成長を引き起こします。したがって、最適な軟骨再生を達成するためには、マトリリン-3とTGF-β1がJBNm内の必須成分です。TGF−β1を層ごとの足場に添加すると、組織構築物における軟骨再生をさらに促進することができる。TGF-β1は、骨軟骨欠損の治癒過程を促進するために使用される成長因子であり、軟骨細胞およびhMSCの増殖および分化を促進する21,22。したがって、TGF-β1は軟骨再生JBNm(J/T/M JBNm)23において重要な役割を果たし、特にJBNm層内に局在している場合に適切な増殖を促進します。
前述のように、成長因子は通常、足場の外側に組み立てられ、特定の取り込み方法はありません。ここでは、生体材料の正確に設計されたナノアーキテクチャにより、JBNmは目的の細胞や組織を特異的に標的とするために開発されました。JBNmは、内層のJBNt表面に付着したTGF-β1と、外層のJBNt表面に付着したマトリリン-3とから構成される24,25。層ごとの構造の内層にTGF-β1を組み込むことで、JBNm繊維に沿って高度に局在化した微小環境が可能になり、タンパク質12の放出がはるかに遅い恒常性組織構築物が作成されます。JBNmの注射性は、将来のさまざまな生体材料用途に理想的な軟骨組織構築物になります26。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 % Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50062Z</td>
			<td>Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-740</td>
			<td>24-well plate used for comparative cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-Well Black Untreated Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>262260</td>
			<td>384-well plate used for absorption measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chambered coverglass</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>155409PK</td>
			<td>8-well coverglass used for comparative cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-91</td>
			<td>96-well plate used for comparative cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Plate non- treated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>260895</td>
			<td>96-well plate used for comparative cell culture and analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Hydrogel used for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Gel</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Hydrogel used as an environment for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A30006 (488) and A30007 (555)</td>
			<td>Fluorescent dye used to label proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen X Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>41-9771-82</td>
			<td>Antibody used to stain collagen-X.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad PCR Machine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to perform PCR on samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C28/I2 Chondrocyte Cell Line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit 8</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>96992</td>
			<td>Cell proliferation assay.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Profiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Software used to analyze cell images.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>FISHER Scientific</td>
			<td>14-955-128</td>
			<td>Container used for spectrophotometry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Cell Culture Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566032</td>
			<td>Media used to support cellular growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A4766801</td>
			<td>Serum used in cell culture medium to support cell growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td>Solution used to mount slides for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Compound used to fix samples prior to microtoming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A16110</td>
			<td>Antibody used for protein staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>PT-2501</td>
			<td>Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>PT-3003</td>
			<td>Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software used in conjunction with microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>itaq Universal SYBR Green One-Step Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725150</td>
			<td>Kit used for PCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janus-base nanotubes (JBNts)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope</td>
			<td>Tecnai</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Statistical software used for modeling and data analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrilin-3</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3017MN050</td>
			<td>Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to measure absorption values of a sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Spectral Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R HD25</td>
			<td>Confocal microscope used to analyze samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Number 1.5 Chamber Coverglass</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>152250</td>
			<td>Environment for sterile cell culture and imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Compound Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Compound used to embed cells prior to microtoming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td>Compound used to fix cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDC-32G Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td></td>
			<td>Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15-140-148</td>
			<td>Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R415</td>
			<td>F-Actin red fluorescent dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Plant Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74904</td>
			<td>Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution used to process samples prior to microtoming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF beta-1 Human ELISA Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>BMS249-4</td>
			<td>Assay kit used to determine the presence of TGF-&#946;1 in a sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-21C</td>
			<td>Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HFH10</td>
			<td>Compound used to lyse cells not fixed during staining process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Reagent used to isolate RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and characterization of layer-by-layer janus base nano-matrix to promote cartilage regeneration

in vitroおよびin vivo使用のための特定の機能を促進することを期待して、細胞の接着および増殖を導くために様々な生体材料足場が開発されている。これらの生体材料足場への成長因子の添加は、一般に、最適な細胞培養環境を提供し、細胞分化およびその後の機能を媒介するために行われる。ただし、従来の生体材料足場の成長因子は、通常、移植時に放出されるように設計されており、周囲の組織や細胞に意図しない副作用をもたらす可能性があります。ここでは、DNAに触発されたヤヌスベースナノマトリックス(JBNm)が、自立可能な軟骨組織構築のための層ごとの構造を持つ高度に局在化した微小環境を実現することに成功しました。JBNmsは、ヤヌスベースナノチューブ(JBNts)、マトリリン-3、およびトランスフォーミング成長因子β-1(TGF-β1)から生体親和性を介して自己組織化されます。JBNmは、TGF-β1:マトリリン-3:JBNt比1:4:10で組み立てられましたが、これは、層ごとの構造への適切な組み立てが起こり得る決定された比率です。まず、マトリリン-3溶液にTGF-β1溶液を添加した。次に、この混合物を数回ピペットで移動して、JBNt溶液を添加する前に十分な均質性を確保しました。これにより、再び数回ピペッティングした後、層ごとのJBNmが形成されました。JBNm構造、JBNts単独、マトリリン-3単独、TGF-β1単独を層ごとに特徴付けるために、様々な実験を行った。JBNmの形成を紫外可視吸収スペクトルで調べ、透過型電子顕微鏡(TEM)でJBNmの構造を観察した。革新的な層ごとのJBNm足場が分子スケールで形成されるため、蛍光色素標識JBNmを観察することができました。TGF-β1は注射可能なJBNmの内層内に閉じ込められており、周囲への成長因子の放出を防ぎ、局所的な軟骨形成を促進し、抗肥厚微小環境を促進することができます。

プロトコルに従って、JBNtsの合成に成功し、UV-Vis吸収とTEMで特徴付けられました。JBNmは、迅速な生体模倣プロセスを経る注射可能な固体足場です。生理的環境でTGF-β1/マトリリン-3溶液の混合物にJBNtsを添加した後、 図1に示すように、JBNmの組み立てが成功したことを示す固体の白いメッシュの足場が形成されました。これは、特性評価方法で実証されました。
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Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration

このプロトコルは、ヤヌスベースナノチューブ(JBNts)、マトリリン-3、およびトランスフォーミング成長因子ベータ-1(TGF-β1)を順次追加することにより、層ごとのヤヌスベースナノマトリックス(JBNm)足場の組み立てを記述します。JBNmは製造され、特徴付けられました。さらに、優れた生理活性を示し、接着、増殖、分化などの細胞機能を促進しました。

軟骨再生を促進するための層ごとのヤヌスベースナノマトリックスの作製とキャラクタリゼーション

Various biomaterial scaffolds have been developed to guide cell adhesion and proliferation in hopes to promote specific functions for in vitro and in vivo ...

このプロトコルは、分子レベルでJBNmを層ごとに組み立てて特徴付けた方法を示しています。JBNmはTGF-B1をカプセル化し、周囲組織への放出を防ぎ、局所的な軟骨形成を促進します。JBNmの形成は標準化されており、将来のアプリケーションのために異なるJBNmを形成することができます。独自の層ごとの構造により、成長因子のカプセル化が可能になり、安定した局所放出が作成され、肥大を回避し、成長を維持します。JBNmは、不規則な形状の骨折や空洞などのさまざまなシナリオに使用できる注射能力により、限られた場所で軟骨組織再生のための恒常性微小環境を提供します。はじめに、水に懸濁した1ミリリットルあたり1ミリグラムのTGF-B1を8マイクロリットル、水に懸濁した1ミリリットルあたり1ミリグラムのマトリリン-3を32マイクロリットル加えます。これらのタンパク質の適切な混合を確実にするためのピペット。ミリリットルあたり1ミリグラムの80マイクロリットルを追加します。ヤヌスベースナノチューブ、または水中に懸濁したJBNtsをTGF-B1、マトリリン-3溶液に。適切なブレンドを確実にするために繰り返しピペットします。JBNtグループの場合、50マイクロリットルの水に1ミリリットルあたり1ミリグラムの5マイクロリットル、JBNtsを加えて、1ミリリットルあたり90.9マイクログラムの溶液を作ります。マトリリン-3グループの場合、1ミリリットルあたり10マイクログラムの40マイクロリットルのマトリリン-3を15マイクロリットルの水に加えて、1ミリリットルあたり7.3マイクログラムの溶液を作ります。TGF-B1グループの場合、1ミリリットルあたり10マイクログラムのTGF-B1を45マイクロリットルの水に10マイクロリットル加えて、1ミリリットルあたり1.8マイクログラムの溶液を作ります。ヤヌスベースナノマトリックスまたはJBNmグループの場合、ミリリットルあたり10マイクログラムの40マイクロリットル、ミリリットルあたり10マイクログラムのマトリリン-3を10マイクロリットルTGF-B1に追加します。適切な混合を確実にするために攪拌します。次に、1ミリリットル当たり1ミリグラムのJBNtsを5マイクロリットル溶液に加え、ピペッティングを繰り返してサンプルを混合する。分光光度計を用いて、各群の吸収スペクトルを測定する。TGF-B1は、製造元の指示に従って、タンパク質標識キットを使用して標識します。TGF-B1とラベル付けされた20マイクログラム/ミリリットルを25マイクロリットルの水に加え、1ミリリットルあたり8.9マイクログラムのテスト溶液を作ります。別のラベリングキットを使用して、マトリリン-3にラベルを付けます。20マイクロリットルの80マイクログラム/ミリリットルの標識マトリリン-3を25マイクロリットルの水に加え、1ミリリットルあたり36マイクログラムの試験溶液を作ります。20マイクロリットルの標識マトリリン-3を1ミリリットル当たり20マイクログラムの標識TGF-B1と20マイクロリットルの1ミリリットル当たりの20マイクログラム、および5マイクロリットルの水と混合し、標識TGF-B1、マトリリン-3化合物を得る。混合物を数回ピペットで混合する。1ミリリットルあたり5マイクロリットルのJBNtsを40マイクロリットルの水に加えると、1ミリリットルあたり111マイクログラムの溶液になります。次に、標識したTGF-B1、マトリリン-3溶液に1ミリグラム/ミリグラムのJBNtsを5マイクロリットル加え、ピペットで繰り返し化合物を混合します。各サンプル群を黒色の384ウェルプレートのウェルに移します。プレートをマルチモードマイクロプレートリーダーにロードし、メーカーのプロトコルに従って488ナノメートルと555ナノメートルの励起波長で測定を行います。生理学的条件下では、マトリリン-3のゼータ電位スペクトルは、その等電点のために負に帯電した。TGF-B1をマトリリン-3に添加した後、TGF-B1マトリリン-3化合物のゼータ電位は中性に近い値まで増加した。JBNmのゼータ電位は3群の中で最も高かった。紫外可視吸収スペクトルは、JBNmの層内部構造、リジン側鎖の芳香環、およびJBNtsがそれぞれ220ナノメートルおよび280ナノメートルの吸収ピークに寄与することにより、階層層の形成を確認した。TEMは、JBNtsおよびJBNmの形態を特徴付けるために使用された。タンパク質と結合した後、JBNmの厚い束が足場構造を形成するのが観察された。蛍光顕微鏡は層構造ごとに層の存在を確認し、JBNmの断面を示した。赤色蛍光マトリリン-3を標識した後、JBNtバンドルを包み込み、JBNmの外層を形成し、一方、緑色蛍光TGF-B1は内層を形成した。蛍光共鳴エネルギー移動は、標識されたTGF-B1群で520ナノメートル、マトリリン-3群で570ナノメートルに発光ピークを示した。HMSCの接着と細胞増殖に対するJBNmの効果を調べました。JBNmは、HMSCがそれ自体と一緒にクラスター化していることを示しましたが、JBNtsに接着する細胞は少なかった。JBNm上の細胞の整列と細胞の大きさは、JBNtsが細胞接着に関与し、タンパク質が細胞接着の親和性を高めることを示しました。細胞培養1日目後、JBNm群およびTGF-B1群は他の群と比較して有意な細胞増殖を示した。細胞構造の持続時間を3日および5日に延長すると、JBNmおよびTGF-B1グループはさらに細胞増殖の増加を示しました。JBNmを蛍光標識する場合、JBNtsを添加する前にTGF-B1とマトリリン-3を個別に標識して混合し、層ごとの構造を適切に形成することが重要です。足場のさらなる評価は、それらが治療的治療においてどのように有効であるかの理解を提供することができる。より具体的には、ハイスループット増殖アッセイにより、インビトロで、および後にインビボで最適な投与量を決定することができる。この新しいNanoMatriXの作成により、研究者はナノ材料ベースの注射可能な足場を利用して軟骨を再生することができます。このポリ模倣アプローチは、アンドロジェネシスおよびカウンターサイト増殖の増強を可能にする。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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マイクロ流体チップの作製とインフルエンザを検出する方法

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

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Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

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Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

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実験および有限要素議定書は、関節軟骨全体で中性および荷電溶質の輸送を調査します

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

軟骨再生のための3次元磁気幹細胞凝集およびバイオリアクター成熟

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Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

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Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

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