Name: fabrication and characterization of layer-by-layer janus base nano-matrix to promote cartilage regeneration
Uploaded: 2022-07-06T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration at JoVE.com

Dette arbeidet støttes av NIH-tilskudd 7R01AR072027 og 7R03AR069383, NSF Career Award 1905785, NSF 2025362 og University of Connecticut. Dette arbeidet støttes også delvis av NIH-stipend S10OD016435.

1. Syntese av JBNts
<ol><li>Forbered JBNt-monomeren ved bruk av tidligere publiserte metoder, som involverer syntese av en rekke forbindelser12.</li>
	<li>Rens rå JBNt-monomer etter at den har blitt syntetisert med høyytelses væskekromatografi (HPLC) ved hjelp av en omvendt fasekolonne. Bruk løsningsmiddel A: 100% vann, løsningsmiddel B: 100% acetonitril og løsningsmiddel C: HCl vannoppløsning med pH = 1. Bruk en strømningshastighet på 3 ml/min. Samle den største toppe...

<ol>
	<li>Chan, B. P., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolding+in+tissue+engineering:+general+approaches+and+tissue-specific+considerations.">Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations.</a> European Spine Journal. 17, 467-479 (2008).</li><li>Heo, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+carbohydrazide-modified+gelatin+into+microparticle-suspended+oxidized+alginate+for+the+fabrication+of+complex-shaped+tissue+constructs.">3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs.</a> ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).</li><li>Almeida, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+shape-memory+alginate+scaffolds+functionalized+with+either+type+i+or+type+ii+collagen+for+cartilage+tissue+engineering.">Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).</li><li>Vinatier, C., Guicheux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+tissue+engineering:+From+biomaterials+and+stem+cells+to+osteoarthritis+treatments.">Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments.</a> Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).</li><li>Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-based+repair+for+cartilage+healing:+a+systematic+review+and+technical+note.">Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note.</a> Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).</li><li>James, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+clinical+side+effects+of+bone+morphogenetic+protein-2.">A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).</li><li>Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+and+osteoarthritis.">TGF-beta and osteoarthritis.</a> Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).</li><li>Chen, Y., Yang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-articular+drug+delivery+systems+for+arthritis+treatment.">Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment.</a> Rheumatology Current Research. 2, 106 (2012).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressing+mesenchymal+stem+cell+hypertrophy+and+endochondral+ossification+in+3D+cartilage+regeneration+with+nanofibrous+poly(l-lactic+acid)+scaffold+and+matrilin-3.">Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3.</a> Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).</li><li>Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+for+incorporating+hydrophobic+drugs+in+physiological+environments.">Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+biomimetic+Nano-Matrix+for+stem+cell+anchorage.">Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).</li><li>Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+biomimetic+nano-matrix+with+janus+base+nanotubes+and+fibronectin+for+stem+cell+adhesion.">Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion.</a> Journal of Visualized Experiments. (159), e61317 (2020).</li><li>Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+encapsulate+and+slowly+release+dexamethasone.">Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotube/hydrogel+composites+for+cartilage+tissue+engineering.">Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).</li><li>Yu, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+biomedical+techniques+for+gene+delivery.">Advanced biomedical techniques for gene delivery.</a> Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).</li><li>Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrilin-3+role+in+cartilage+development+and+osteoarthritis).">Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis).</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590 (2016).</li><li>Pei, M., Luo, J., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+and+maintaining+chondrogenesis+of+synovial+fibroblasts+by+cartilage+extracellular+matrix+protein+matrilins.">Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins.</a> Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).</li><li>Bello, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrilin3/TGFbeta3+gelatin+microparticles+promote+chondrogenesis,+prevent+hypertrophy,+and+induce+paracrine+release+in+MSC+spheroid+for+disc+regeneration.">Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration.</a> NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50 (2021).</li><li>Muttigi, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrilin-3+codelivery+with+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+promotes+articular+cartilage+regeneration+in+a+rat+osteochondral+defect+model.">Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).</li><li>Jayasuriya, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrilin-3+chondrodysplasia+mutations+cause+attenuated+chondrogenesis,+premature+hypertrophy+and+aberrant+response+to+TGF-beta+in+chondroprogenitor+cells.">Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).</li><li>Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+Beta+family:+insight+into+the+role+of+growth+factors+in+regulation+of+fracture+healing+biology+and+potential+clinical+applications.">Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications.</a> Mediators of Inflammation. 2015, 137823 (2015).</li><li>Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+osteogenesis+by+bovine+platelet+transforming+growth+factor-beta+(TGF-beta)+in+adult+mouse+femur.">Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur.</a> Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-miRNA+oligonucleotide+therapy+for+chondrosarcoma).">Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma).</a> Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).</li><li>Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+tissue+microenvironment+on+stem+cell-based+cartilage+repair.">The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+mechanical+activation+of+anabolic+transcripts+and+post-traumatic+cartilage+degeneration+in+matrilin-1+knockout+mice.">Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice.</a> PLoS One. 11 (6), 0156676 (2016).</li><li>Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+self-assembly+of+DNA-mimicking+nanotubes+to+form+a+layer-by-layer+scaffold+for+homeostatic+tissue+constructs.">Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs.</a> ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).</li><li>Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+matrilin-3+(MATN3).">Characterization of human matrilin-3 (MATN3).</a> Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).</li><li>Yau, A., Yu, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+detection+with+fluorescence-base+imaging+techniques+for+arthritis+diagnosis.">mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis.</a> Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).</li><li>Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-inspired+nanomaterials+for+enhanced+endosomal+escape.">DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).</li><li>Zhang, W., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+engineering+of+DNA-inspired+Janus+base+nanomaterials.">Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials.</a> Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670 (2019).</li><li>Yau, A., Sands, I., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-scale+surface+modifications+to+advance+current+treatment+options+for+cervical+degenerative+disc+disease+(CDDD).">Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD).</a> Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147 (2019).</li><li>Mello, M. A., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+TGF-beta1+and+triiodothyronine+on+cartilage+maturation:+in+vitro+analysis+using+long-term+high-density+micromass+cultures+of+chick+embryonic+limb+mesenchymal+cells.">Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells.</a> Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).</li><li>Shi, Y., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+TGF-beta+signaling+from+cell+membrane+to+the+nucleus.">Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus.</a> Cell. 113 (6), 685-700 (2003).</li><li>Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+delivery+via+DNA-inspired+janus+base+nanotubes+for+extracellular+matrix+penetration.">RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration.</a> MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).</li><li>Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+interfering+RNA+(siRNA)-based+therapeutics+for+cartilage+diseases.">Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases.</a> Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).</li><li>Bi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+of+PEG+onto+PMMA+microchannel+surface+to+minimize+nonspecific+adsorption.">Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption.</a> Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).</li><li>Chen, Y., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+osteoblast+functions+in+the+presence+of+BMP-7+short+peptides+for+nanostructured+biomaterial+applications.">Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).</li><li>Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+nanoparticle+delivery+with+in+vitro+bio-engineered+microtissues.">Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues.</a> Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).</li><li>Yau, A., Lee, J., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterials+for+protein+delivery+in+anticancer+applications.">Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications.</a> Pharmaceutics. 13 (2), 155 (2021).</li></ol>

Målet med denne studien er å utvikle en biomimetisk stillasplattform, JBNm, for å overvinne begrensningene i konvensjonelle vevskonstruksjoner som er avhengige av cellekulturmiljøer for å formidle celledifferensiering. JBNm er et lag-for-lag struktur stillas for en selvbærende bruskvevskonstruksjon. Den innovative designen er basert på nye DNA-inspirerte nanomaterialer, JBNts. JBNm, sammensatt av JBNts30, TGF-β1 og matrilin-3, er satt sammen gjennom en ny lag-for-lag-teknikk der stillasets...

Stillas i vevsteknikk spiller en viktig rolle i å gi strukturell støtte til cellefeste og påfølgende vevsutvikling1. Vanligvis er konvensjonelle vevskonstruksjoner uten stillas avhengig av cellekulturmiljøet og tilførte vekstfaktorer for å formidle celledifferensiering. Videre er denne tilsetningen av bioaktive molekyler i stillaser ofte den foretrukne tilnærmingen for å lede celledifferensiering og funksjon 2,3. Noen stillaser kan etterligne det biokjemiske mikromiljøet i innfødte vev uavhengig, mens andre kan direkte påvirke cellefunksjoner via vekstfaktorer. Imidlertid møter forskere ofte utfordringer ved valg av stillaser som kan påvirke celleadhesjon, vekst og differensiering positivt, samtidig som det gir optimal strukturell støtte og stabilitet over en lang periode 4,5. De bioaktive molekylene er ofte løst bundet til stillaset, noe som fører til rask frigjøring av disse proteinene ved implantasjon, noe som resulterer i frigjøring på uønskede steder. Dette kulminerer i bivirkninger på vev eller celler som ikke med vilje var målrettet 6,7.
Stillaser er vanligvis laget av polymere materialer. Janus base nano-matrix (JBNm) er en biomimetisk stillasplattform laget med en ny lag-for-lag-metode for selvbærende bruskvevskonstruksjon8. Disse nye DNA-inspirerte nanorørene har blitt kalt Janus base nanorør (JBNts), da de riktig etterligner strukturen og overflatekjemien til kollagen som finnes i den ekstracellulære matrisen (ECM). Med tilsetning av bioaktive molekyler, som matrilin-3 og Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1), kan JBNm skape et optimalt mikromiljø som deretter kan stimulere ønsket celle- og vevsfunksjonalitet9.
JBNts er nye nanorør avledet fra syntetiske versjoner av nukleobase adenin og tymin. JBNts dannes gjennom selvmontering10; Seks syntetiske nukleobaser bindes for å danne en ring, og disse ringene gjennomgår π-π stablingsinteraksjoner for å skape et nanorør 200-300 μm i lengde11. Disse nanorørene er strukturelt lik kollagenproteiner; ved å etterligne et aspekt av det innfødte bruskmikromiljøet, har JBNts vist seg å gi et gunstig festested for kondrocytter og humane mesenkymale stamceller (hMSCs)11,12,13,14. Fordi nanorørene gjennomgår selvmontering og ikke krever noen form for initiator (for eksempel UV-lys), viser de spennende potensial som et injiserbart stillas for vanskelig tilgjengelige defektområder15.
Matrilin-3 er et strukturelt ekstracellulært matriksprotein som finnes i brusk. Dette proteinet spiller en viktig rolle i kondrogenese og riktig bruskfunksjon16,17. Nylig har det blitt inkludert i biomateriale stillaser, oppmuntrende kondrogenese uten hypertrofi 9,18,19. Ved å inkludere dette proteinet i JBNm, tiltrekkes bruskceller til et stillas som inneholder lignende komponenter som det opprinnelige mikromiljøet. I tillegg har det vist seg at matrilin-3 er nødvendig for riktig TGF-β1-signalering i kondrocytter20. Vekstfaktorer fungerer som signalmolekyler, noe som forårsaker spesifikk vekst av en bestemt celle eller vev. For å oppnå optimal bruskregenerering er matrilin-3 og TGF-β1 essensielle komponenter i JBNm. Tilsetningen av TGF-β1 i lag-for-lag-stillaset kan ytterligere fremme bruskregenerering i en vevskonstruksjon. TGF-β1 er en vekstfaktor som brukes til å oppmuntre helbredelsesprosessen av osteokondrale defekter, oppmuntre kondrocytt og hMSC-spredning og differensiering21,22. Dermed spiller TGF-β1 en nøkkelrolle i bruskregenerering JBNm (J / T / M JBNm) 23, og oppmuntrer til riktig vekst, spesielt når den er lokalisert i JBNm-lagene.
Som nevnt tidligere er vekstfaktorer vanligvis samlet på utsiden av stillas uten spesifikke metoder for inkorporering. Her, med den nøyaktig utformede nanoarkitekturen til biomaterialene, ble JBNm utviklet for spesifikk målretting av tiltenkte celler og vev. JBNm består av TGF-β1 festet på JBNt-overflater i det indre laget og matrilin-3 festet på JBNt-overflater i det ytre laget24,25. Inkorporeringen av TGF-β1 i det indre laget av lag-for-lag-strukturen muliggjør et svært lokalisert mikromiljø langs JBNm-fibrene, og skaper en homeostatisk vevskonstruksjon med en mye langsommere frigjøring av proteinet12. Injiserbarheten til JBNm gjør den til en ideell bruskvevskonstruksjon for ulike fremtidige biomaterialeapplikasjoner26.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 % Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50062Z</td>
			<td>Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-740</td>
			<td>24-well plate used for comparative cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-Well Black Untreated Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>262260</td>
			<td>384-well plate used for absorption measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chambered coverglass</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>155409PK</td>
			<td>8-well coverglass used for comparative cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-91</td>
			<td>96-well plate used for comparative cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Plate non- treated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>260895</td>
			<td>96-well plate used for comparative cell culture and analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Hydrogel used for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Gel</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Hydrogel used as an environment for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A30006 (488) and A30007 (555)</td>
			<td>Fluorescent dye used to label proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen X Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>41-9771-82</td>
			<td>Antibody used to stain collagen-X.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad PCR Machine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to perform PCR on samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C28/I2 Chondrocyte Cell Line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit 8</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>96992</td>
			<td>Cell proliferation assay.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Profiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Software used to analyze cell images.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>FISHER Scientific</td>
			<td>14-955-128</td>
			<td>Container used for spectrophotometry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Cell Culture Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566032</td>
			<td>Media used to support cellular growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A4766801</td>
			<td>Serum used in cell culture medium to support cell growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td>Solution used to mount slides for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Compound used to fix samples prior to microtoming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A16110</td>
			<td>Antibody used for protein staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>PT-2501</td>
			<td>Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>PT-3003</td>
			<td>Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software used in conjunction with microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>itaq Universal SYBR Green One-Step Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725150</td>
			<td>Kit used for PCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janus-base nanotubes (JBNts)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope</td>
			<td>Tecnai</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Statistical software used for modeling and data analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrilin-3</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3017MN050</td>
			<td>Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to measure absorption values of a sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Spectral Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R HD25</td>
			<td>Confocal microscope used to analyze samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Number 1.5 Chamber Coverglass</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>152250</td>
			<td>Environment for sterile cell culture and imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Compound Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Compound used to embed cells prior to microtoming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td>Compound used to fix cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDC-32G Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td></td>
			<td>Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15-140-148</td>
			<td>Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R415</td>
			<td>F-Actin red fluorescent dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Plant Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74904</td>
			<td>Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution used to process samples prior to microtoming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF beta-1 Human ELISA Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>BMS249-4</td>
			<td>Assay kit used to determine the presence of TGF-&#946;1 in a sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-21C</td>
			<td>Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HFH10</td>
			<td>Compound used to lyse cells not fixed during staining process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Reagent used to isolate RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and characterization of layer-by-layer janus base nano-matrix to promote cartilage regeneration

Ulike stillas biomateriale er utviklet for å veilede celleadhesjon og proliferasjon i håp om å fremme spesifikke funksjoner for in vitro og in vivo bruk. Tilsetningen av vekstfaktorer i disse biomaterialestillasene gjøres vanligvis for å gi et optimalt cellekulturmiljø, formidle celledifferensiering og dets påfølgende funksjoner. Imidlertid er vekstfaktorene i et konvensjonelt biomateriale stillas vanligvis designet for å frigjøres ved implantasjon, noe som kan føre til utilsiktede bivirkninger på omgivende vev eller celler. Her har den DNA-inspirerte Janus base nano-matrisen (JBNm) vellykket oppnådd et svært lokalisert mikromiljø med en lag-for-lag-struktur for selvbærekraftige bruskvevskonstruksjoner. JBNms er selvmontert fra Janus base nanorør (JBNts), matrilin-3, og transformerende vekstfaktor beta-1 (TGF-β1) via bioaffinitet. JBNm ble montert i et TGF-β1: matrilin-3: JBNt-forhold på 1: 4: 10, da dette har vært det bestemte forholdet der riktig montering i lag-for-lag-strukturen kunne forekomme. Først ble TGF-β1-løsningen lagt til matrilin-3-løsningen. Deretter ble denne blandingen pipettert flere ganger for å sikre tilstrekkelig homogenitet før tilsetning av JBNt-løsningen. Dette dannet lag-for-lag JBNm, etter pipettering flere ganger igjen. En rekke eksperimenter ble utført for å karakterisere lag-for-lag JBNm-strukturen, JBNts alene, matrilin-3 alene og TGF-β1 alene. Dannelsen av JBNm ble studert med UV-Vis absorpsjonsspektra, og strukturen til JBNm ble observert med transmisjonselektronmikroskopi (TEM). Når det innovative lag-for-lag JBNm-stillaset dannes på molekylær skala, kan det fluorescerende fargestoffmerkede JBNm observeres. TGF-β1 er begrenset i det indre laget av den injiserbare JBNm, som kan forhindre frigjøring av vekstfaktorer til omkringliggende områder, fremme lokalisert kondrogenese og fremme et antihypertrofisk mikromiljø.

Etter protokollen ble JBNts vellykket syntetisert og karakterisert med UV-Vis-absorpsjon og TEM. JBNm er et injiserbart fast stillas som gjennomgår en rask biomimetisk prosess. Etter at JBNts ble tilsatt til en blanding av TGF-β1 / matrilin-3-løsning i et fysiologisk miljø, ble det dannet et solidt hvitmasket stillas som indikerer vellykket montering av JBNm, som vist i figur 1. Dette ble demonstrert i karakteriseringsmetodene.
Under fysiologiske forhold er ma...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration at JoVE.com

Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration

Denne protokollen beskriver montering av en lag-for-lag Janus base nano-matrise (JBNm) stillas ved å legge Janus base nanorør (JBNts), matrilin-3, og Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1) sekvensielt. JBNm ble fabrikkert og karakterisert; I tillegg viste den utmerket bioaktivitet, oppmuntrende cellefunksjoner som vedheft, proliferasjon og differensiering.

Fabrikasjon og karakterisering av lag-for-lag Janus base nano-matrise for å fremme brusk regenerering

Various biomaterial scaffolds have been developed to guide cell adhesion and proliferation in hopes to promote specific functions for in vitro and in vivo ...

Denne protokollen viser hvordan vi samlet og karakteriserte lag for lag JBNm på molekylært nivå. JBNm innkapsler TGF-B1, og forhindrer frigjøring i det omkringliggende vevet, og fremmer dermed lokalisert kondrogenese. Dannelsen av JBNm er standardisert, slik at forskjellige JBNms kan dannes for fremtidige applikasjoner.Den unike lag for lagstruktur tillater innkapsling av vekstfaktor, noe som skaper en jevn lokalisert frigjøring, som unngår hypertrofi og opprettholder vekst. JBNm gir et homeostatisk mikromiljø for bruskvevregenerering, innenfor et begrenset sted, på grunn av dets injeksjonsevne, som kan brukes til forskjellige scenarier, som uregelmessig formede brudd eller hulrom. Til å begynne med, legg til åtte mikroliter av en milligram per milliliter TGF-B1, suspendert i vann til 32 mikroliter av en milligram per milliliter Matrilin-3 suspendert i vann.Pipette for å sikre riktig blanding av disse proteinene. Tilsett 80 mikroliter av en milligram per milliliter. Janus Base Nanorør, eller JBNts suspendert i vann, til TGF-B1, Matrilin-3 løsning.Pipette gjentatte ganger for å sikre riktig blanding. For JBNt-gruppen, tilsett fem mikroliter av en milligram per milliliter, JBNts til 50 mikroliter vann for å lage en 90,9 mikrogram per milliliter løsning. For Matrilin-3-gruppen, tilsett 40 mikroliter 10 mikrogram per milliliter Matrilin-3 til 15 mikroliter vann, for å lage en 7,3 mikrogram per milliliter løsning.For TGF-B1-gruppen, tilsett 10 mikroliter 10 mikrogram per milliliter, TGF-B1 til 45 mikroliter vann, for å lage en 1,8 mikrogram per milliliter løsning. For Janus Base Nano-Matrix eller JBNm-gruppen, legg til 40 mikroliter 10 mikrogram per milliliter, Matrilin-3 til 10 mikroliter 10 mikrogram per milliliter TGF-B1. Agiter for å sikre riktig blanding.Deretter tilsettes fem mikroliter en milligram per milliliter JBNts til løsningen, gjentatte ganger pipettering for å blande prøven. Bruk et spektrofotometer til å måle absorpsjonsspekteret til hver gruppe. Merk TGF-B1 ved å bruke et proteinmerkingssett, og følg produsentens instruksjoner.Tilsett 20 mikroliter 20 mikrogram per milliliter, merket TGF-B1, til 25 mikroliter vann, for å lage en testløsning på 8,9 mikrogram per milliliter. Merk Matrilin-3 ved å bruke et eget merkesett. Tilsett 20 mikroliter 80 mikrogram per milliliter merket Matrilin-3 til 25 mikroliter vann, for å lage en 36 mikrogram per milliliter testløsning.Bland 20 mikroliter 80 mikrogram per milliliter merket Matrilin-3 med 20 mikroliter 20 mikrogram per milliliter merket TGF-B1, og fem mikroliter vann, noe som resulterer i en merket TGF-B1, Matrilin-3-forbindelse. Pipette blandingen flere ganger for å blande. Tilsett fem mikroliter av en milligram per milliliter JBNts til 40 mikroliter vann, noe som resulterer i en 111 mikrogram per milliliter løsning.Tilsett deretter fem mikroliter en milligram per milliliter JBNts til den merkede TGF-B1, Matrilin-3-løsningen, og pipetter gjentatte ganger for å blande forbindelsen. Overfør hver prøvegruppe til brønnen på en svart 384 brønnplate. Last platen inn i en multi-mode mikroplateleser, og ta målinger ved eksitasjonsbølgelengder på 488 og 555 nanometer etter produsentens protokoller.Under fysiologiske forhold ble zetapotensialspekteret til Matrilin-3 negativt ladet på grunn av dets isoelektriske punkt. Etter tilsetningen av TGF-B1 til Matrilin-3 økte zetapotensialet til TGF-B1 Matrilin-3-forbindelsen til en nær nøytral verdi. Zetapotensialet til JBNm var det høyeste blant de tre gruppene.UV-synlige absorpsjonsspektra bekreftet dannelsen av den hierarkiske lag for lag indre strukturen til JBNm, de aromatiske ringene til lysinsidekjedene og JBNts bidro til absorpsjonstoppene, henholdsvis 220 og 280 nanometer. TEM ble brukt til å karakterisere morfologien til JBNts og JBNm. Etter kombinasjon med proteiner ble tykke bunter av JBNm observert å danne en stillasstruktur.Fluorescensmikroskopi bekreftet tilstedeværelsen av lag for lagstruktur, og demonstrerte tverrsnittet av JBNm. Etter merking av den røde fluorescerende Matrilin-3 omsluttet JBNt-buntene og dannet det ytre laget av JBNm, mens det grønne fluorescerende TGF-B1 dannet et indre lag. Fluorescensresonansenergioverføringen viste utslippstopper ved 520 nanometer for merkede TGF-B1-grupper, og 570 nanometer for Matrilin-3-grupper.Effekten av JBNm på HMSCs adhesjon og celleproliferasjon ble utforsket. JBNm viste HMSCs gruppert sammen med seg selv, mens færre celler fulgte JBNts. Justeringen av celler, og størrelsen på cellene på JBNm viste at JBNts spilte en rolle i celleadhesjon, mens proteinene økte affiniteten av celleadhesjon.Etter dag én av cellekulturen viste JBNm- og TGF-B1-gruppene signifikant celleproliferasjon sammenlignet med de andre gruppene. Når cellestrukturens varighet ble økt til tre og fem dager, viste JBNm- og TGF-B1-gruppene enda mer økt celleproliferasjon. Ved fluorescerende merking av JBNm er det viktig at TGF-B1 og Matrilin-3 merkes og blandes individuelt før JBNts tilsettes, for å muliggjøre riktig dannelse av lag for lagstruktur.Videre vurdering av stillaset kan gi en forståelse av hvordan de er effektive i terapeutiske behandlinger. Nærmere bestemt kan en høy gjennomstrømningsproliferasjonsanalyse bestemme den optimale doseringen in vitro, og senere in vivo. Denne nye NanoMatriX-etableringen gjør det mulig for forskere å bruke et nanomaterialebasert injiserbart stillas for å regenerere brusk.Denne poly mimicking tilnærming gir mulighet for forbedret androgenese og counter site spredning.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Microfluidic Chip Fabrikasjon og metode for å oppdage Influensa

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Menneskelig bruskvev Fabrication Bruke Tredimensjonal Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Fabrikasjon og karakterisering av en Conformal Skin-lignende Electronic System for Quantitative, Kutan sårbehandling

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Lag-på-lag Kollagen Nedfall i mikrofluid Enheter for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

En eksperimentell og Finite Element-protokollen for å undersøke Transport av nøytrale og siktet Oppløste stoffer over Leddbrusk

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D Magnetisk Stem Cell Aggregation og bioreaktor Modning for Brusk Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Fabrikasjon og karakterisering av Griffithsin endret Fiber stillaser for forebygging av seksuelt overførbare infeksjoner

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

Fabrikasjon og karakterisering av optisk vev Phantoms som inneholder Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Fabrikasjon av Decellularized brusk-avledet Matrix stillaser

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...