Name: fabrication and characterization of layer-by-layer janus base nano-matrix to promote cartilage regeneration
Uploaded: 2022-07-06T13:20:00
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Este trabajo cuenta con el apoyo de las subvenciones de los NIH 7R01AR072027 y 7R03AR069383, NSF Career Award 1905785, NSF 2025362 y la Universidad de Connecticut. Este trabajo también es apoyado en parte por la subvención S10OD016435 de los NIH.

1. Síntesis de JBNts
<ol><li>Preparar el monómero JBNt utilizando métodos previamente publicados, que involucran la síntesis de una variedad de compuestos12.</li>
	<li>Purifique el monómero JBNt crudo después de que se haya sintetizado con cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) utilizando una columna de fase inversa. Use el solvente A: 100% agua, el solvente B: 100% acetonitrilo y el solvente C: solución de agua HCl con pH = 1. Utilice un caudal de 3 ml/min. R...

<ol>
	<li>Chan, B. P., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolding+in+tissue+engineering:+general+approaches+and+tissue-specific+considerations.">Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations.</a> European Spine Journal. 17, 467-479 (2008).</li><li>Heo, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+carbohydrazide-modified+gelatin+into+microparticle-suspended+oxidized+alginate+for+the+fabrication+of+complex-shaped+tissue+constructs.">3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs.</a> ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).</li><li>Almeida, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+shape-memory+alginate+scaffolds+functionalized+with+either+type+i+or+type+ii+collagen+for+cartilage+tissue+engineering.">Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).</li><li>Vinatier, C., Guicheux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+tissue+engineering:+From+biomaterials+and+stem+cells+to+osteoarthritis+treatments.">Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments.</a> Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).</li><li>Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-based+repair+for+cartilage+healing:+a+systematic+review+and+technical+note.">Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note.</a> Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).</li><li>James, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+clinical+side+effects+of+bone+morphogenetic+protein-2.">A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).</li><li>Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+and+osteoarthritis.">TGF-beta and osteoarthritis.</a> Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).</li><li>Chen, Y., Yang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-articular+drug+delivery+systems+for+arthritis+treatment.">Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment.</a> Rheumatology Current Research. 2, 106 (2012).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressing+mesenchymal+stem+cell+hypertrophy+and+endochondral+ossification+in+3D+cartilage+regeneration+with+nanofibrous+poly(l-lactic+acid)+scaffold+and+matrilin-3.">Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3.</a> Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).</li><li>Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+for+incorporating+hydrophobic+drugs+in+physiological+environments.">Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+biomimetic+Nano-Matrix+for+stem+cell+anchorage.">Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).</li><li>Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+biomimetic+nano-matrix+with+janus+base+nanotubes+and+fibronectin+for+stem+cell+adhesion.">Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion.</a> Journal of Visualized Experiments. (159), e61317 (2020).</li><li>Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+encapsulate+and+slowly+release+dexamethasone.">Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotube/hydrogel+composites+for+cartilage+tissue+engineering.">Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).</li><li>Yu, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+biomedical+techniques+for+gene+delivery.">Advanced biomedical techniques for gene delivery.</a> Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).</li><li>Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrilin-3+role+in+cartilage+development+and+osteoarthritis).">Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis).</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590 (2016).</li><li>Pei, M., Luo, J., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+and+maintaining+chondrogenesis+of+synovial+fibroblasts+by+cartilage+extracellular+matrix+protein+matrilins.">Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins.</a> Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).</li><li>Bello, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrilin3/TGFbeta3+gelatin+microparticles+promote+chondrogenesis,+prevent+hypertrophy,+and+induce+paracrine+release+in+MSC+spheroid+for+disc+regeneration.">Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration.</a> NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50 (2021).</li><li>Muttigi, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrilin-3+codelivery+with+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+promotes+articular+cartilage+regeneration+in+a+rat+osteochondral+defect+model.">Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).</li><li>Jayasuriya, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrilin-3+chondrodysplasia+mutations+cause+attenuated+chondrogenesis,+premature+hypertrophy+and+aberrant+response+to+TGF-beta+in+chondroprogenitor+cells.">Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).</li><li>Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+Beta+family:+insight+into+the+role+of+growth+factors+in+regulation+of+fracture+healing+biology+and+potential+clinical+applications.">Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications.</a> Mediators of Inflammation. 2015, 137823 (2015).</li><li>Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+osteogenesis+by+bovine+platelet+transforming+growth+factor-beta+(TGF-beta)+in+adult+mouse+femur.">Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur.</a> Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-miRNA+oligonucleotide+therapy+for+chondrosarcoma).">Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma).</a> Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).</li><li>Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+tissue+microenvironment+on+stem+cell-based+cartilage+repair.">The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+mechanical+activation+of+anabolic+transcripts+and+post-traumatic+cartilage+degeneration+in+matrilin-1+knockout+mice.">Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice.</a> PLoS One. 11 (6), 0156676 (2016).</li><li>Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+self-assembly+of+DNA-mimicking+nanotubes+to+form+a+layer-by-layer+scaffold+for+homeostatic+tissue+constructs.">Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs.</a> ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).</li><li>Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+matrilin-3+(MATN3).">Characterization of human matrilin-3 (MATN3).</a> Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).</li><li>Yau, A., Yu, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+detection+with+fluorescence-base+imaging+techniques+for+arthritis+diagnosis.">mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis.</a> Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).</li><li>Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-inspired+nanomaterials+for+enhanced+endosomal+escape.">DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).</li><li>Zhang, W., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+engineering+of+DNA-inspired+Janus+base+nanomaterials.">Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials.</a> Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670 (2019).</li><li>Yau, A., Sands, I., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-scale+surface+modifications+to+advance+current+treatment+options+for+cervical+degenerative+disc+disease+(CDDD).">Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD).</a> Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147 (2019).</li><li>Mello, M. A., Tuan, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+osteoblast+functions+in+the+presence+of+BMP-7+short+peptides+for+nanostructured+biomaterial+applications.">Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).</li><li>Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+nanoparticle+delivery+with+in+vitro+bio-engineered+microtissues.">Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues.</a> Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).</li><li>Yau, A., Lee, J., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterials+for+protein+delivery+in+anticancer+applications.">Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications.</a> Pharmaceutics. 13 (2), 155 (2021).</li></ol>

El objetivo de este estudio es desarrollar una plataforma de andamio biomimético, el JBNm, para superar las limitaciones de las construcciones de tejidos convencionales que dependen de entornos de cultivo celular para mediar la diferenciación celular. El JBNm es un andamio de estructura capa por capa para una construcción autosostenible de tejido de cartílago. El diseño innovador se basa en nuevos nanomateriales inspirados en el ADN, los JBNts. El JBNm, compuesto por JBNts30, TGF-β1 y matril...

Los andamios en la ingeniería de tejidos desempeñan un papel vital en la prestación de soporte estructural para la unión celular y el posterior desarrollo de tejidos1. Por lo general, las construcciones de tejido convencionales sin ningún andamiaje dependen del entorno de cultivo celular y de factores de crecimiento agregados para mediar la diferenciación celular. Además, esta adición de moléculas bioactivas en andamios es a menudo el enfoque preferido para guiar la diferenciación y función celular 2,3. Algunos andamios pueden imitar el microambiente bioquímico de los tejidos nativos de forma independiente, mientras que otros pueden influir directamente en las funciones celulares a través de factores de crecimiento. Sin embargo, los investigadores a menudo encuentran desafíos en la selección de andamios que podrían afectar positivamente la adhesión, el crecimiento y la diferenciación celular, al tiempo que proporcionan un soporte estructural óptimo y estabilidad durante un largo período 4,5. Las moléculas bioactivas a menudo se unen libremente al andamio, lo que lleva a una rápida liberación de estas proteínas tras la implantación, lo que resulta en su liberación en lugares no deseados. Esto culmina en efectos secundarios en tejidos o células que no fueron dirigidos intencionalmente 6,7.
Los andamios suelen estar hechos de materiales poliméricos. La nanomatriz base Janus (JBNm) es una plataforma de andamio biomimético creada con un novedoso método capa por capa para la construcción autosostenible de tejido de cartílago8. Estos nuevos nanotubos inspirados en el ADN han sido nombrados nanotubos de base Janus (JBNts), ya que imitan adecuadamente la estructura y la química de la superficie del colágeno que se encuentra en la matriz extracelular (ECM). Con la adición de moléculas bioactivas, como la matrilina-3 y el factor de crecimiento transformante beta-1 (TGF-β1), el JBNm puede crear un microambiente óptimo que luego puede estimular la funcionalidad celular y tisular deseada9.
Los JBNt son nuevos nanotubos derivados de versiones sintéticas de la nucleobase adenina y timina. Los JBNts se forman a través del autoensamblaje10; Seis nucleobases sintéticas se unen para formar un anillo, y estos anillos se someten a interacciones de apilamiento de π-π para crear un nanotubo de 200-300 μm de longitud11. Estos nanotubos son estructuralmente similares a las proteínas de colágeno; al imitar un aspecto del microambiente nativo del cartílago, se ha demostrado que los JBNts proporcionan un sitio de unión favorable para los condrocitos y las células madre mesenquimales humanas (hMSCs)11,12,13,14. Debido a que los nanotubos se someten a autoensamblaje y no requieren ningún tipo de iniciador (como la luz UV), muestran un potencial emocionante como un andamio inyectable para áreas defectuosas difíciles de alcanzar15.
La matrilina-3 es una proteína estructural de la matriz extracelular que se encuentra en el cartílago. Esta proteína juega un papel significativo en la condrogénesis y la función adecuada del cartílago16,17. Recientemente, ha sido incluido en andamios de biomateriales, fomentando la condrogénesis sin hipertrofia 9,18,19. Al incluir esta proteína en el JBNm, las células del cartílago son atraídas por un andamio que contiene componentes similares a los de su microambiente nativo. Además, se ha demostrado que la matrilina-3 es necesaria para la señalización adecuada de TGF-β1 dentro de los condrocitos20. Los factores de crecimiento funcionan como moléculas de señalización, causando el crecimiento específico de una determinada célula o tejido. Por lo tanto, para lograr una regeneración óptima del cartílago, la matrilina-3 y el TGF-β1 son componentes esenciales dentro del JBNm. La adición de TGF-β1 en el andamio capa por capa puede promover aún más la regeneración del cartílago en una construcción de tejido. El TGF-β1 es un factor de crecimiento empleado para estimular el proceso de cicatrización de defectos osteocondrales, favoreciendo la proliferación y diferenciación de condrocitos y hMSC21,22. Así, el TGF-β1 juega un papel clave en la regeneración del cartílago JBNm (J/T/M JBNm)23, favoreciendo un crecimiento adecuado, especialmente cuando se localiza dentro de las capas de JBNm.
Como se mencionó anteriormente, los factores de crecimiento generalmente se ensamblan en el exterior de los andamios sin métodos específicos de incorporación. Aquí, con la nanoarquitectura diseñada con precisión de los biomateriales, el JBNm se desarrolló para la orientación específica de las células y tejidos previstos. El JBNm está compuesto por TGF-β1 adherido sobre superficies JBNt en la capa interna y matrilina-3 adherida sobre superficies JBNt en la capa externa24,25. La incorporación de TGF-β1 en la capa interna de la estructura capa por capa permite un microambiente altamente localizado a lo largo de las fibras JBNm, creando una construcción de tejido homeostático con una liberación mucho más lenta de la proteína12. La inyectabilidad del JBNm lo convierte en una construcción de tejido de cartílago ideal para diversas aplicaciones futuras de biomateriales26.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>10 % Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50062Z</td>
			<td>Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-740</td>
			<td>24-well plate used for comparative cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-Well Black Untreated Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>262260</td>
			<td>384-well plate used for absorption measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chambered coverglass</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>155409PK</td>
			<td>8-well coverglass used for comparative cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-91</td>
			<td>96-well plate used for comparative cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Plate non- treated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>260895</td>
			<td>96-well plate used for comparative cell culture and analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Hydrogel used for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Gel</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Hydrogel used as an environment for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A30006 (488) and A30007 (555)</td>
			<td>Fluorescent dye used to label proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen X Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>41-9771-82</td>
			<td>Antibody used to stain collagen-X.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad PCR Machine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to perform PCR on samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C28/I2 Chondrocyte Cell Line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit 8</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>96992</td>
			<td>Cell proliferation assay.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Profiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Software used to analyze cell images.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>FISHER Scientific</td>
			<td>14-955-128</td>
			<td>Container used for spectrophotometry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Cell Culture Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566032</td>
			<td>Media used to support cellular growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A4766801</td>
			<td>Serum used in cell culture medium to support cell growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td>Solution used to mount slides for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Compound used to fix samples prior to microtoming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A16110</td>
			<td>Antibody used for protein staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>PT-2501</td>
			<td>Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>PT-3003</td>
			<td>Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software used in conjunction with microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>itaq Universal SYBR Green One-Step Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725150</td>
			<td>Kit used for PCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janus-base nanotubes (JBNts)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope</td>
			<td>Tecnai</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Statistical software used for modeling and data analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrilin-3</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3017MN050</td>
			<td>Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to measure absorption values of a sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Spectral Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R HD25</td>
			<td>Confocal microscope used to analyze samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Number 1.5 Chamber Coverglass</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>152250</td>
			<td>Environment for sterile cell culture and imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Compound Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Compound used to embed cells prior to microtoming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td>Compound used to fix cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDC-32G Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td></td>
			<td>Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15-140-148</td>
			<td>Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R415</td>
			<td>F-Actin red fluorescent dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Plant Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74904</td>
			<td>Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution used to process samples prior to microtoming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF beta-1 Human ELISA Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>BMS249-4</td>
			<td>Assay kit used to determine the presence of TGF-&#946;1 in a sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-21C</td>
			<td>Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HFH10</td>
			<td>Compound used to lyse cells not fixed during staining process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Reagent used to isolate RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and characterization of layer-by-layer janus base nano-matrix to promote cartilage regeneration

Se han desarrollado varios andamios de biomateriales para guiar la adhesión y proliferación celular con la esperanza de promover funciones específicas para usos in vitro e in vivo . La adición de factores de crecimiento en estos andamios de biomateriales generalmente se realiza para proporcionar un entorno óptimo de cultivo celular, mediando la diferenciación celular y sus funciones posteriores. Sin embargo, los factores de crecimiento en un andamio de biomaterial convencional generalmente están diseñados para ser liberados después de la implantación, lo que podría provocar efectos secundarios no deseados en el tejido o las células circundantes. Aquí, la nanomatriz base Janus (JBNm) inspirada en el ADN ha logrado con éxito un microambiente altamente localizado con una estructura capa por capa para construcciones autosostenibles de tejido de cartílago. Los JBNms se autoensamblan a partir de nanotubos de base Janus (JBNts), matrilina-3 y factor de crecimiento transformante beta-1 (TGF-β1) a través de la bioafinidad. El JBNm se ensambló en una relación TGF-β1:matrilin-3:JBNt de 1:4:10, ya que esta ha sido la relación determinada en la que podría ocurrir el ensamblaje adecuado en la estructura capa por capa. Primero, se agregó la solución de TGF-β1 a la solución de matrilina-3. Luego, esta mezcla se pipeteó varias veces para garantizar una homogeneidad suficiente antes de la adición de la solución JBNt. Esto formó el JBNm capa por capa, después de pipetear varias veces nuevamente. Se realizaron una variedad de experimentos para caracterizar la estructura JBNm capa por capa, JBNts solo, matrilina-3 sola y TGF-β1 sola. La formación de JBNm se estudió con espectros de absorción UV-Vis, y la estructura del JBNm se observó con microscopía electrónica de transmisión (TEM). A medida que el innovador andamio JBNm capa por capa se forma a escala molecular, se pudo observar el JBNm marcado con colorante fluorescente. El TGF-β1 está confinado dentro de la capa interna del JBNm inyectable, que puede prevenir la liberación de factores de crecimiento a las áreas circundantes, promover la condrogénesis localizada y promover un microambiente antihipertrófico.

Siguiendo el protocolo, los JBNts se sintetizaron con éxito y se caracterizaron con absorción UV-Vis y TEM. El JBNm es un andamio sólido inyectable que se somete a un rápido proceso biomimético. Después de agregar JBNts a una mezcla de solución de TGF-β1 / matrilina-3 en un entorno fisiológico, se formó un andamio sólido de malla blanca que indica el ensamblaje exitoso de JBNm, como se ve en la Figura 1. Esto se demostró en los métodos de caracterización.
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Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration

Este protocolo describe el ensamblaje de un andamio de nanomatriz de base Janus (JBNm) capa por capa agregando nanotubos de base Janus (JBNts), matrilina-3 y factor de crecimiento transformante beta-1 (TGF-β1) secuencialmente. El JBNm fue fabricado y caracterizado; Además, mostró una excelente bioactividad, fomentando funciones celulares como la adhesión, proliferación y diferenciación.

Fabricación y caracterización de la nanomatriz base Janus capa por capa para promover la regeneración del cartílago

Various biomaterial scaffolds have been developed to guide cell adhesion and proliferation in hopes to promote specific functions for in vitro and in vivo ...

Este protocolo muestra cómo ensamblamos y caracterizamos el JBNm capa por capa a nivel molecular. JBNm encapsula TGF-B1 y evita su liberación en el tejido circundante, promoviendo así la condrogénesis localizada. La formación del JBNm está estandarizada, lo que permite formar diferentes JBNms para futuras aplicaciones.La estructura única capa por capa permite la encapsulación del factor de crecimiento, creando una liberación localizada constante, que evita la hipertrofia y mantiene el crecimiento. JBNm proporciona un microambiente homeostático para la regeneración del tejido del cartílago, dentro de un lugar confinado, debido a su inyectabilidad, que se puede utilizar para diferentes escenarios, como fracturas o cavidades de forma irregular. Para comenzar, agregue ocho microlitros de un miligramo por mililitro TGF-B1, suspendido en agua a 32 microlitros de un miligramo por mililitro Matrilin-3 suspendido en agua.Pipeta para asegurar la mezcla adecuada de estas proteínas. Añadir 80 microlitros de un miligramo por mililitro. Nanotubos de base Janus, o JBNts suspendidos en agua, a la solución TGF-B1, Matrilin-3.Pipetear repetidamente para asegurar una mezcla adecuada. Para el grupo JBNt, agregue cinco microlitros de un miligramo por mililitro, JBNts a 50 microlitros de agua para hacer una solución de 90.9 microgramos por mililitro. Para el grupo Matrilin-3, agregue 40 microlitros de 10 microgramos por mililitro Matrilin-3 a 15 microlitros de agua, para hacer una solución de 7.3 microgramos por mililitro.Para el grupo TGF-B1, agregue 10 microlitros de 10 microgramos por mililitro, de TGF-B1 a 45 microlitros de agua, para hacer una solución de 1.8 microgramos por mililitro. Para el grupo Janus Base Nano-Matrix o JBNm, agregue 40 microlitros de 10 microgramos por mililitro, Matrilin-3 a 10 microlitros de 10 microgramos por mililitro TGF-B1. Agitar para asegurar una mezcla adecuada.Luego, agregue cinco microlitros de un miligramo por mililitro JBNts a la solución, pipeteando repetidamente para mezclar la muestra. Usando un espectrofotómetro, medir el espectro de absorción de cada grupo. Etiquete el TGF-B1 utilizando un kit de etiquetado de proteínas, siguiendo las instrucciones del fabricante.Agregue 20 microlitros de 20 microgramos por mililitro, etiquetados como TGF-B1, a 25 microlitros de agua, para hacer una solución de prueba de 8.9 microgramos por mililitro. Etiquete el Matrilin-3 utilizando un kit de etiquetado separado. Agregue 20 microlitros de 80 microgramos por mililitro etiquetados como Matrilin-3 a 25 microlitros de agua, para hacer una solución de prueba de 36 microgramos por mililitro.Mezcle 20 microlitros de 80 microgramos por mililitro marcados como Matrilin-3 con 20 microlitros de 20 microgramos por mililitro marcados como TGF-B1, y cinco microlitros de agua, lo que resulta en un compuesto etiquetado TGF-B1, Matrilin-3. Pipetear la mezcla varias veces para mezclar. Agregue cinco microlitros de un miligramo por mililitro JBNts a 40 microlitros de agua, lo que resulta en una solución de 111 microgramos por mililitro.Luego agregue cinco microlitros de un miligramo por mililitro JBNts a la solución etiquetada de TGF-B1, Matrilin-3, y pipete repetidamente para mezclar el compuesto. Transfiera cada grupo de muestra al pozo de una placa de pocillo negro 384. Cargue la placa en un lector de microplacas multimodo y tome medidas en longitudes de onda de excitación de 488 y 555 nanómetros siguiendo los protocolos del fabricante.En condiciones fisiológicas, el espectro de potencial zeta de Matrilin-3 se cargó negativamente debido a su punto isoeléctrico. Después de la adición del TGF-B1 a la Matrilina-3, el potencial zeta del compuesto TGF-B1 Matrilina-3 aumentó a un valor casi neutro. El potencial zeta de JBNm fue el más alto entre los tres grupos.Los espectros de absorción UV visibles confirmaron la formación de la estructura interior jerárquica capa por capa del JBNm, los anillos aromáticos de las cadenas laterales de lisina, y los JBNts contribuyeron a los picos de absorción, a 220 y 280 nanómetros respectivamente. Se utilizó TEM para caracterizar la morfología de los JBNts y JBNm. Después de combinarse con proteínas, se observaron haces gruesos de JBNm formando una estructura de andamio.La microscopía de fluorescencia confirmó la presencia de la estructura capa por capa, y demostró la sección transversal del JBNm. Después de etiquetar, el fluorescente rojo Matrilin-3 envolvió los haces JBNt y formó la capa externa del JBNm, mientras que el TGF-B1 fluorescente verde formó una capa interna. La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia mostró picos de emisión a 520 nanómetros para los grupos TGF-B1 marcados y 570 nanómetros para los grupos Matrilin-3.Se exploró el efecto de JBNm en la adhesión y proliferación celular de HMSC. El JBNm mostró HMSC agrupados junto con él, mientras que menos células se adhirieron a JBNts. La alineación de las células y el tamaño de las células en el JBNm demostraron que los JBNts desempeñaron un papel en la adhesión celular, mientras que las proteínas aumentaron la afinidad de la adhesión celular.Después del primer día de cultivo celular, los grupos JBNm y TGF-B1 mostraron una proliferación celular significativa en comparación con los otros grupos. Cuando la duración de la estructura celular se incrementó a tres y cinco días, los grupos JBNm y TGF-B1 demostraron una proliferación celular aún mayor. Al etiquetar fluorescentemente el JBNm, es importante que el TGF-B1 y el Matrilin-3 se etiqueten individualmente y se mezclen antes de agregar los JBNts, para permitir la formación adecuada de la estructura capa por capa.Una evaluación adicional del andamio puede proporcionar una comprensión de cómo son efectivos en los tratamientos terapéuticos. Más específicamente, un ensayo de proliferación de alto rendimiento, puede determinar la dosis óptima in vitro, y más tarde in vivo. Esta nueva creación de NanoMatriX permite a los investigadores utilizar un andamio inyectable basado en nanomateriales para regenerar el cartílago.Este enfoque de imitación poli permite una androgénesis mejorada y la proliferación del contrasitio.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Fabricación de chips de microfluidos y método para detectar la influenza

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

Investigación

Bioingeniería

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

El cartílago humano Tissue Fabrication Usando tridimensional Tecnología de impresión inyección de tinta

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Fabricación y caracterización de un sistema electrónico conforme de la piel-como para la gestión cuantitativa, cutánea de la herida

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Capa por capa deposición de colágeno en dispositivos de microfluidos para microtejidos Estabilización

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Un experimental y el Protocolo de elementos finitos para investigar el transporte de solutos neutros y cargadas a través de cartílago articular

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D agregación magnética Stem Cell y biorreactor de maduración para la regeneración del cartílago

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Fabricación y caracterización de andamios de fibra modificado Griffithsin para la prevención de infecciones de transmisión sexual

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

Fabricación y caracterización de tejido óptico fantasmas que contiene macroestructura

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Fabricación de andamios de Decellularized derivados de cartílago matriz

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...