Name: fabrication and characterization of layer-by-layer janus base nano-matrix to promote cartilage regeneration
Uploaded: 2022-07-06T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration at JoVE.com

Detta arbete stöds av NIH-bidrag 7R01AR072027 och 7R03AR069383, NSF Career Award 1905785, NSF 2025362 och University of Connecticut. Detta arbete stöds också delvis av NIH-bidrag S10OD016435.

1. Syntes av JBNts
<ol><li>Förbered JBNt-monomeren med hjälp av tidigare publicerade metoder, som involverar syntesen av en mängd olika föreningar12.</li>
	<li>Rena rå JBNt-monomer efter att den har syntetiserats med högpresterande vätskekromatografi (HPLC) med hjälp av en omvänd faskolonn. Använd lösningsmedel A: 100% vatten, lösningsmedel B: 100% acetonitril och lösningsmedel C: HCl vattenlösning med pH = 1. Använd en flödeshastighet på 3 ml/min. Samla den st?...

<ol>
	<li>Chan, B. P., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolding+in+tissue+engineering:+general+approaches+and+tissue-specific+considerations.">Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations.</a> European Spine Journal. 17, 467-479 (2008).</li><li>Heo, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+carbohydrazide-modified+gelatin+into+microparticle-suspended+oxidized+alginate+for+the+fabrication+of+complex-shaped+tissue+constructs.">3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs.</a> ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).</li><li>Almeida, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+shape-memory+alginate+scaffolds+functionalized+with+either+type+i+or+type+ii+collagen+for+cartilage+tissue+engineering.">Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).</li><li>Vinatier, C., Guicheux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+tissue+engineering:+From+biomaterials+and+stem+cells+to+osteoarthritis+treatments.">Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments.</a> Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).</li><li>Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-based+repair+for+cartilage+healing:+a+systematic+review+and+technical+note.">Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note.</a> Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).</li><li>James, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+clinical+side+effects+of+bone+morphogenetic+protein-2.">A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).</li><li>Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+and+osteoarthritis.">TGF-beta and osteoarthritis.</a> Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).</li><li>Chen, Y., Yang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-articular+drug+delivery+systems+for+arthritis+treatment.">Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment.</a> Rheumatology Current Research. 2, 106 (2012).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressing+mesenchymal+stem+cell+hypertrophy+and+endochondral+ossification+in+3D+cartilage+regeneration+with+nanofibrous+poly(l-lactic+acid)+scaffold+and+matrilin-3.">Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3.</a> Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).</li><li>Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+for+incorporating+hydrophobic+drugs+in+physiological+environments.">Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+biomimetic+Nano-Matrix+for+stem+cell+anchorage.">Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).</li><li>Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+biomimetic+nano-matrix+with+janus+base+nanotubes+and+fibronectin+for+stem+cell+adhesion.">Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion.</a> Journal of Visualized Experiments. (159), e61317 (2020).</li><li>Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+encapsulate+and+slowly+release+dexamethasone.">Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotube/hydrogel+composites+for+cartilage+tissue+engineering.">Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).</li><li>Yu, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+biomedical+techniques+for+gene+delivery.">Advanced biomedical techniques for gene delivery.</a> Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).</li><li>Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrilin-3+role+in+cartilage+development+and+osteoarthritis).">Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis).</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590 (2016).</li><li>Pei, M., Luo, J., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+and+maintaining+chondrogenesis+of+synovial+fibroblasts+by+cartilage+extracellular+matrix+protein+matrilins.">Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins.</a> Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).</li><li>Bello, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrilin3/TGFbeta3+gelatin+microparticles+promote+chondrogenesis,+prevent+hypertrophy,+and+induce+paracrine+release+in+MSC+spheroid+for+disc+regeneration.">Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration.</a> NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50 (2021).</li><li>Muttigi, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrilin-3+codelivery+with+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+promotes+articular+cartilage+regeneration+in+a+rat+osteochondral+defect+model.">Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).</li><li>Jayasuriya, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrilin-3+chondrodysplasia+mutations+cause+attenuated+chondrogenesis,+premature+hypertrophy+and+aberrant+response+to+TGF-beta+in+chondroprogenitor+cells.">Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).</li><li>Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+Beta+family:+insight+into+the+role+of+growth+factors+in+regulation+of+fracture+healing+biology+and+potential+clinical+applications.">Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications.</a> Mediators of Inflammation. 2015, 137823 (2015).</li><li>Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+osteogenesis+by+bovine+platelet+transforming+growth+factor-beta+(TGF-beta)+in+adult+mouse+femur.">Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur.</a> Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-miRNA+oligonucleotide+therapy+for+chondrosarcoma).">Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma).</a> Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).</li><li>Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+tissue+microenvironment+on+stem+cell-based+cartilage+repair.">The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+mechanical+activation+of+anabolic+transcripts+and+post-traumatic+cartilage+degeneration+in+matrilin-1+knockout+mice.">Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice.</a> PLoS One. 11 (6), 0156676 (2016).</li><li>Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+self-assembly+of+DNA-mimicking+nanotubes+to+form+a+layer-by-layer+scaffold+for+homeostatic+tissue+constructs.">Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs.</a> ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).</li><li>Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+matrilin-3+(MATN3).">Characterization of human matrilin-3 (MATN3).</a> Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).</li><li>Yau, A., Yu, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+detection+with+fluorescence-base+imaging+techniques+for+arthritis+diagnosis.">mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis.</a> Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).</li><li>Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-inspired+nanomaterials+for+enhanced+endosomal+escape.">DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).</li><li>Zhang, W., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+engineering+of+DNA-inspired+Janus+base+nanomaterials.">Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials.</a> Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670 (2019).</li><li>Yau, A., Sands, I., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-scale+surface+modifications+to+advance+current+treatment+options+for+cervical+degenerative+disc+disease+(CDDD).">Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD).</a> Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147 (2019).</li><li>Mello, M. A., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+TGF-beta1+and+triiodothyronine+on+cartilage+maturation:+in+vitro+analysis+using+long-term+high-density+micromass+cultures+of+chick+embryonic+limb+mesenchymal+cells.">Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells.</a> Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).</li><li>Shi, Y., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+TGF-beta+signaling+from+cell+membrane+to+the+nucleus.">Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus.</a> Cell. 113 (6), 685-700 (2003).</li><li>Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+delivery+via+DNA-inspired+janus+base+nanotubes+for+extracellular+matrix+penetration.">RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration.</a> MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).</li><li>Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+interfering+RNA+(siRNA)-based+therapeutics+for+cartilage+diseases.">Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases.</a> Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).</li><li>Bi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+of+PEG+onto+PMMA+microchannel+surface+to+minimize+nonspecific+adsorption.">Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption.</a> Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).</li><li>Chen, Y., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+osteoblast+functions+in+the+presence+of+BMP-7+short+peptides+for+nanostructured+biomaterial+applications.">Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).</li><li>Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+nanoparticle+delivery+with+in+vitro+bio-engineered+microtissues.">Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues.</a> Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).</li><li>Yau, A., Lee, J., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterials+for+protein+delivery+in+anticancer+applications.">Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications.</a> Pharmaceutics. 13 (2), 155 (2021).</li></ol>

Målet med denna studie är att utveckla en biomimetisk ställningsplattform, JBNm, för att övervinna begränsningarna hos konventionella vävnadskonstruktioner som förlitar sig på cellodlingsmiljöer för att förmedla celldifferentiering. JBNm är en lager-för-lager-strukturställning för en självförsörjande broskvävnadskonstruktion. Den innovativa designen är baserad på nya DNA-inspirerade nanomaterial, JBNts. JBNm, som består av JBNts30, TGF-β1 och matrilin-3, monteras genom en n...

Ställningar inom vävnadsteknik spelar en viktig roll för att ge strukturellt stöd för cellfästning och efterföljande vävnadsutveckling1. Vanligtvis förlitar sig konventionella vävnadskonstruktioner utan byggnadsställningar på cellodlingsmiljön och tillsatte tillväxtfaktorer för att förmedla celldifferentiering. Dessutom är denna tillsats av bioaktiva molekyler i byggnadsställningar ofta det föredragna tillvägagångssättet för att styra celldifferentiering och funktion 2,3. Vissa byggnadsställningar kan efterlikna den biokemiska mikromiljön hos inhemska vävnader oberoende, medan andra direkt kan påverka cellfunktioner via tillväxtfaktorer. Forskare stöter dock ofta på utmaningar när de väljer ställningar som kan påverka celladhesion, tillväxt och differentiering positivt, samtidigt som de ger optimalt strukturellt stöd och stabilitet under en lång period 4,5. De bioaktiva molekylerna är ofta löst bundna till ställningen vilket leder till snabb frisättning av dessa proteiner vid implantation, vilket resulterar i att de frigörs på oönskade platser. Detta kulminerar i biverkningar på vävnader eller celler som inte avsiktligt riktades mot 6,7.
Byggnadsställningar är vanligtvis gjorda av polymera material. Janus basnanomatris (JBNm) är en biomimetisk ställningsplattform skapad med en ny lager-för-lager-metod för självhållbar broskvävnadskonstruktion8. Dessa nya DNA-inspirerade nanorör har fått namnet Janus base nanotubes (JBNts), eftersom de korrekt efterliknar strukturen och ytkemin hos kollagen som finns i den extracellulära matrisen (ECM). Med tillsats av bioaktiva molekyler, såsom matrilin-3 och Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1), kan JBNm skapa en optimal mikromiljö som sedan kan stimulera önskad cell- och vävnadsfunktionalitet9.
JBNts är nya nanorör härledda från syntetiska versioner av nukleobasadenin och tymin. JBNts bildas genom självmontering10; Sex syntetiska nukleobaser binder för att bilda en ring, och dessa ringar genomgår π-π staplingsinteraktioner för att skapa ett nanorör 200-300 μm i längd11. Dessa nanorör liknar strukturellt kollagenproteiner; genom att efterlikna en aspekt av den inhemska broskmikromiljön har JBNts visat sig ge ett gynnsamt fästställe för kondrocyter och humana mesenkymala stamceller (hMSC)11,12,13,14. Eftersom nanorören genomgår självmontering och inte kräver någon form av initiator (t.ex. UV-ljus) visar de spännande potential som en injicerbar byggnadsställning för svåråtkomliga defekta områden15.
Matrilin-3 är ett strukturellt extracellulärt matrisprotein som finns i brosk. Detta protein spelar en viktig roll i kondrogenes och korrekt broskfunktion16,17. Nyligen har det inkluderats i biomaterialställningar, vilket uppmuntrar kondrogenes utan hypertrofi 9,18,19. Genom att inkludera detta protein i JBNm lockas broskceller till en byggnadsställning som innehåller liknande komponenter som den i dess ursprungliga mikromiljö. Dessutom har det visat sig att matrilin-3 behövs för korrekt TGF-β1-signalering inom kondrocyter20. Tillväxtfaktorer fungerar som signalmolekyler, vilket orsakar specifik tillväxt av en viss cell eller vävnad. För att uppnå optimal broskregenerering är matrilin-3 och TGF-β1 väsentliga komponenter inom JBNm. Tillsatsen av TGF-β1 i lager-för-lager-ställningen kan ytterligare främja broskregenerering i en vävnadskonstruktion. TGF-β1 är en tillväxtfaktor som används för att uppmuntra läkningsprocessen av osteokondrala defekter, vilket uppmuntrar kondrocyt- och hMSC-proliferation och differentiering21,22. Således spelar TGF-β1 en nyckelroll i broskregenereringen JBNm (J / T / M JBNm)23, vilket uppmuntrar till korrekt tillväxt, särskilt när den är lokaliserad inom JBNm-lagren.
Som tidigare nämnts monteras tillväxtfaktorer vanligtvis på utsidan av byggnadsställningar utan specifika metoder för införlivande. Här, med den exakt utformade nanoarkitekturen av biomaterialen, utvecklades JBNm för specifik inriktning av avsedda celler och vävnader. JBNm består av TGF-β1 vidhäftad på JBNt-ytor i det inre skiktet och matrilin-3 vidhäftad på JBNt-ytor i det yttre skiktet24,25. Införlivandet av TGF-β1 i det inre skiktet i lager-för-lager-strukturen möjliggör en mycket lokaliserad mikromiljö längs JBNm-fibrerna, vilket skapar en homeostatisk vävnadskonstruktion med en mycket långsammare frisättning av proteinet12. Injicerbarheten hos JBNm gör den till en idealisk broskvävnadskonstruktion för olika framtida biomaterialapplikationer26.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 % Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50062Z</td>
			<td>Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-740</td>
			<td>24-well plate used for comparative cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-Well Black Untreated Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>262260</td>
			<td>384-well plate used for absorption measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chambered coverglass</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>155409PK</td>
			<td>8-well coverglass used for comparative cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-91</td>
			<td>96-well plate used for comparative cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Plate non- treated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>260895</td>
			<td>96-well plate used for comparative cell culture and analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Hydrogel used for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Gel</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Hydrogel used as an environment for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A30006 (488) and A30007 (555)</td>
			<td>Fluorescent dye used to label proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen X Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>41-9771-82</td>
			<td>Antibody used to stain collagen-X.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad PCR Machine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to perform PCR on samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C28/I2 Chondrocyte Cell Line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit 8</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>96992</td>
			<td>Cell proliferation assay.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Profiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Software used to analyze cell images.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>FISHER Scientific</td>
			<td>14-955-128</td>
			<td>Container used for spectrophotometry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Cell Culture Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566032</td>
			<td>Media used to support cellular growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A4766801</td>
			<td>Serum used in cell culture medium to support cell growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td>Solution used to mount slides for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Compound used to fix samples prior to microtoming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A16110</td>
			<td>Antibody used for protein staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>PT-2501</td>
			<td>Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>PT-3003</td>
			<td>Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software used in conjunction with microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>itaq Universal SYBR Green One-Step Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725150</td>
			<td>Kit used for PCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janus-base nanotubes (JBNts)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope</td>
			<td>Tecnai</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Statistical software used for modeling and data analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrilin-3</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3017MN050</td>
			<td>Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to measure absorption values of a sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Spectral Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R HD25</td>
			<td>Confocal microscope used to analyze samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Number 1.5 Chamber Coverglass</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>152250</td>
			<td>Environment for sterile cell culture and imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Compound Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Compound used to embed cells prior to microtoming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td>Compound used to fix cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDC-32G Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td></td>
			<td>Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15-140-148</td>
			<td>Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R415</td>
			<td>F-Actin red fluorescent dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Plant Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74904</td>
			<td>Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution used to process samples prior to microtoming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF beta-1 Human ELISA Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>BMS249-4</td>
			<td>Assay kit used to determine the presence of TGF-&#946;1 in a sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-21C</td>
			<td>Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HFH10</td>
			<td>Compound used to lyse cells not fixed during staining process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Reagent used to isolate RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and characterization of layer-by-layer janus base nano-matrix to promote cartilage regeneration

Olika biomaterialställningar har utvecklats för att styra celladhesion och proliferation i hopp om att främja specifika funktioner för in vitro - och in vivo-användning . Tillsatsen av tillväxtfaktorer i dessa biomaterialställningar görs i allmänhet för att ge en optimal cellodlingsmiljö, förmedla celldifferentiering och dess efterföljande funktioner. Tillväxtfaktorerna i en konventionell biomaterialställning är dock vanligtvis utformade för att frigöras vid implantation, vilket kan leda till oavsiktliga biverkningar på omgivande vävnad eller celler. Här har den DNA-inspirerade Janus-basnanomatrisen (JBNm) framgångsrikt uppnått en mycket lokaliserad mikromiljö med en lager-för-lager-struktur för självhållbara broskvävnadskonstruktioner. JBNms är självmonterade från Janus basnanorör (JBNts), matrilin-3 och transformerande tillväxtfaktor beta-1 (TGF-β1) via bioaffinitet. JBNm monterades med ett TGF-β1: matrilin-3: JBNt-förhållande på 1: 4: 10, eftersom detta har varit det bestämda förhållandet vid vilket korrekt montering i lager-för-lager-strukturen kunde inträffa. Först tillsattes TGF-β1-lösningen till matrilin-3-lösningen. Därefter pipetterades denna blandning flera gånger för att säkerställa tillräcklig homogenitet före tillsatsen av JBNt-lösningen. Detta bildade lager-för-lager JBNm, efter pipettering flera gånger igen. En mängd olika experiment utfördes för att karakterisera skikt-för-lager JBNm-strukturen, JBNts ensam, matrilin-3 ensam och TGF-β1 ensam. Bildandet av JBNm studerades med UV-Vis-absorptionsspektra, och strukturen hos JBNm observerades med transmissionselektronmikroskopi (TEM). Eftersom den innovativa lager-för-lager JBNm-ställningen bildas i molekylär skala kunde den fluorescerande färgämnesmärkta JBNm observeras. TGF-β1 är begränsad i det inre skiktet av den injicerbara JBNm, som kan förhindra frisättning av tillväxtfaktorer till omgivande områden, främja lokaliserad kondrogenes och främja en antihypertrofisk mikromiljö.

Efter protokoll syntetiserades JBNts framgångsrikt och karakteriserades med UV-Vis-absorption och TEM. JBNm är en injicerbar fast ställning som genomgår en snabb biomimetisk process. Efter att JBNts tillsatts till en blandning av TGF-β1/matrilin-3-lösning i en fysiologisk miljö bildades en solid vitmaskig byggnadsställning som indikerar framgångsrik montering av JBNm, vilket framgår av figur 1. Detta demonstrerades i karakteriseringsmetoderna.
Under fysi...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration at JoVE.com

Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration

Detta protokoll beskriver sammansättningen av en lager-för-lager Janus-bas nano-matris (JBNm) ställning genom att lägga till Janus basnanorör (JBNts), matrilin-3 och transformerande tillväxtfaktor Beta-1 (TGF-β1) sekventiellt. JBNm tillverkades och karakteriserades; Dessutom visade den utmärkt bioaktivitet, uppmuntrande cellfunktioner som vidhäftning, proliferation och differentiering.

Tillverkning och karakterisering av lager-för-lager Janus Base Nano-Matrix för att främja broskregenerering

Various biomaterial scaffolds have been developed to guide cell adhesion and proliferation in hopes to promote specific functions for in vitro and in vivo ...

Detta protokoll visar hur vi monterade och karakteriserade lager för lager JBNm på molekylär nivå. JBNm kapslar in TGF-B1 och förhindrar frisättning i den omgivande vävnaden, vilket främjar lokaliserad kondrogenes. Bildandet av JBNm är standardiserat, vilket gör att olika JBNms kan bildas för framtida applikationer.Den unika lager för lager-strukturen möjliggör inkapsling av tillväxtfaktor, vilket skapar en stadig lokaliserad frisättning, som undviker hypertrofi och upprätthåller tillväxten. JBNm tillhandahåller en homeostatisk mikromiljö för regenerering av broskvävnad, inom en begränsad plats, på grund av dess injicerbarhet, som kan användas för olika scenarier, som oregelbundet formade frakturer eller håligheter. För att börja, tillsätt åtta mikroliter av ett milligram per milliliter TGF-B1, suspenderat i vatten till 32 mikroliter av ett milligram per milliliter Matrilin-3 suspenderat i vatten.Pipett för att säkerställa korrekt blandning av dessa proteiner. Tillsätt 80 mikroliter av ett milligram per milliliter. Janus Base Nanotubes, eller JBNts suspenderade i vatten, till TGF-B1, Matrilin-3-lösningen.Pipettera upprepade gånger för att säkerställa korrekt blandning. För JBNt-gruppen, tillsätt fem mikroliter av ett milligram per milliliter, JBNts till 50 mikroliter vatten för att göra en 90,9 mikrogram per milliliter lösning. För Matrilin-3-gruppen tillsätt 40 mikroliter 10 mikrogram per milliliter Matrilin-3 till 15 mikroliter vatten för att göra en 7,3 mikrogram per milliliter lösning.För TGF-B1-gruppen, tillsätt 10 mikroliter 10 mikrogram per milliliter, TGF-B1 till 45 mikroliter vatten, för att göra en 1,8 mikrogram per milliliter lösning. För Janus Base Nano-Matrix eller JBNm-gruppen, tillsätt 40 mikroliter 10 mikrogram per milliliter, Matrilin-3 till 10 mikroliter 10 mikrogram per milliliter TGF-B1. Agitera för att säkerställa korrekt blandning.Tillsätt sedan fem mikroliter av ett milligram per milliliter JBNts till lösningen, upprepade gånger pipettering för att blanda provet. Använd en spektrofotometer för att mäta absorptionsspektrumet för varje grupp. Märk TGF-B1 med hjälp av ett proteinmärkningssats enligt tillverkarens instruktioner.Tillsätt 20 mikroliter 20 mikrogram per milliliter, märkt TGF-B1, till 25 mikroliter vatten för att göra en 8,9 mikrogram per milliliter testlösning. Märk Matrilin-3 med hjälp av ett separat märkningssats. Tillsätt 20 mikroliter 80 mikrogram per milliliter märkt Matrilin-3 till 25 mikroliter vatten, för att göra en 36 mikrogram per milliliter testlösning.Blanda 20 mikroliter 80 mikrogram per milliliter märkt Matrilin-3 med 20 mikroliter 20 mikrogram per milliliter märkt TGF-B1 och fem mikroliter vatten, vilket resulterar i en märkt TGF-B1, Matrilin-3-förening. Pipettera blandningen flera gånger för att blanda. Tillsätt fem mikroliter av ett milligram per milliliter JBNts till 40 mikroliter vatten, vilket resulterar i en 111 mikrogram per milliliter lösning.Tillsätt sedan fem mikroliter av ett milligram per milliliter JBNts till den märkta TGF-B1, Matrilin-3-lösningen och upprepade gånger pipett för att blanda föreningen. Överför varje provgrupp till brunnen på en svart 384-brunnsplatta. Ladda plattan i en mikroplattläsare med flera lägen och gör mätningar vid excitationsvåglängder på 488 och 555 nanometer enligt tillverkarens protokoll.Under fysiologiska förhållanden var zetapotentialspektrumet för Matrilin-3 negativt laddat på grund av dess isoelektriska punkt. Efter tillsatsen av TGF-B1 till Matrilin-3 ökade zetapotentialen hos TGF-B1 Matrilin-3-föreningen till ett nästan neutralt värde. JBNm:s zetapotential var den högsta bland de tre grupperna.UV-synliga absorptionsspektra bekräftade bildandet av det hierarkiska skiktet genom lager inre struktur av JBNm, de aromatiska ringarna i lysinsidokedjorna och JBNts bidrog till absorptionstopparna, vid 220 respektive 280 nanometer. TEM användes för att karakterisera morfologin hos JBNts och JBNm. Efter att ha kombinerats med proteiner observerades tjocka buntar av JBNm som bildade en ställningsstruktur.Fluorescensmikroskopi bekräftade närvaron av skiktet efter skiktstruktur och demonstrerade tvärsnittet av JBNm. Efter märkning omslöt den röda fluorescerande Matrilin-3 JBNt-buntarna och bildade det yttre skiktet av JBNm, medan den gröna fluorescerande TGF-B1 bildade ett inre skikt. Fluorescensresonansenergiöverföringen visade utsläppstoppar vid 520 nanometer för märkta TGF-B1-grupper och 570 nanometer för Matrilin-3-grupper.Effekten av JBNm på HMSC:s vidhäftning och cellproliferation undersöktes. JBNm visade HMSC grupperade tillsammans med sig själv, medan färre celler följde JBNts. Inriktningen av celler och storleken på cellerna på JBNm visade att JBNts spelade en roll i celladhesion, medan proteinerna ökade affiniteten hos celladhesion.Efter dag ett av cellodling visade JBNm- och TGF-B1-grupperna signifikant cellproliferation jämfört med de andra grupperna. När cellstrukturens varaktighet ökades till tre och fem dagar visade JBNm- och TGF-B1-grupperna ännu mer ökad cellproliferation. Vid fluorescerande märkning av JBNm är det viktigt att TGF-B1 och Matrilin-3 märks individuellt och blandas innan JBNts tillsätts, för att möjliggöra korrekt bildning av skiktet efter lagerstruktur.Ytterligare bedömning av ställningen kan ge en förståelse för hur de är effektiva vid terapeutiska behandlingar. Mer specifikt kan en spridningsanalys med hög genomströmning bestämma den optimala dosen in vitro och senare in vivo. Denna nya NanoMatriX-skapelse gör det möjligt för forskare att använda en nanomaterialbaserad injicerbar byggnadsställning för att regenerera brosk.Denna poly härmande tillvägagångssätt möjliggör förbättrad androgenes och motverka spridning av platsen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Mikroflödessystem Chip Fabrication och metod för att upptäcka influensa

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Human Brosk Tissue Fabrication Använda Tredimensionell Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Tillverkning och karakterisering av en Konform Skin liknande elektroniska systemet för kvantitativ hud- Sårbehandling

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Skikt för skikt kollagendeponering i mikroflödessystem enheter för Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

En Experimental och Finite Element protokoll för att undersöka transport av neutrala och laddade Lösta ämnen över Ledbrosk

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D Magnetic Stem Cell Aggregation och Bioreaktor Mognad för brosk Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Tillverkning och karakterisering av Griffithsin modifierade Fiber ställningar för Prevention av sexuellt överförbara infektioner

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

Tillverkning och karakterisering av optiska vävnad fantomer som innehåller Makrostrukturell

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Tillverkning av cell-lösa brosk-derived Matrix ställningar

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...