Name: whole-kidney three-dimensional staining with cubic
Uploaded: 2022-07-18T13:00:00
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Une partie de ce travail a été menée en collaboration avec le professeur Hiroki R. Ueda (Université de Tokyo), le professeur Etsuo A. Susaki (Université Juntendo), le professeur Tetsuhiro Tanaka (Université de Tohoku), le professeur Masafumi Fukagawa, le Dr Takehiko Wada et le Dr Hirotaka Komaba (Université de Tokai).

Toutes les expériences ont été approuvées par le comité d’examen institutionnel de l’Université de Tokyo. Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément aux directives des National Institutes of Health. Des souris C57BL/6NJcl mâles, âgées de 8 semaines, ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été obtenues de sources commerciales (voir le tableau des matériaux).
1. Préparation animale et fixation rénale...

<ol>
	<li>Velez-Fort, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stimulus+selectivity+and+connectivity+of+layer+six+principal+cells+reveals+cortical+microcircuits+underlying+visual+processing.">The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing.</a> Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Landscape+for+Tissue+Clearing+Based+on+Hydrophilic+Reagents.">Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents.</a> Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).</li><li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution:+toward+organism-level+systems+biology+in+mammals.">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li><li>Keller, P. J., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens.">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution.">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li><li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+three-dimensional+analysis+(CUBIC-kidney)+visualizes+abnormal+renal+sympathetic+nerves+after+ischemia/reperfusion+injury.">Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury.</a> Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).</li><li>Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+interactions+and+kidney+disease.">Neuroimmune interactions and kidney disease.</a> Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).</li><li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oral+hypoxia-inducible+factor+prolyl+hydroxylase+inhibitor+enarodustat+counteracts+alterations+in+renal+energy+metabolism+in+the+early+stages+of+diabetic+kidney+disease.">The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease.</a> Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+sympathetic+signaling+in+macrophages+blocks+systemic+inflammation+and+protects+against+renal+ischemia-reperfusion+injury.">Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+evaluation+of+total+glomerular+number+and+capillary+tuft+size+in+nephritic+kidneys+using+lightsheet+microscopy.">Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+probing+of+intact+human+organs.">Cellular and molecular probing of intact human organs.</a> Cell. 180 (4), 796-812 (2020).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+whole-organ/body+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues.">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).</li></ol>

Le protocole actuel a permis l’imagerie 3D du rein entier de diverses structures telles que les nerfs sympathiques, les canaux collecteurs, les artères, les tubules proximaux et les glomérules 9,10,11. Cette méthode de coloration offrait une observation macroscopique et conduisait à de nouvelles découvertes biologiques, en visualisant l’altération des nerfs sympathiques rénaux après une lésion</sup...

Le rein est composé de diverses populations cellulaires. Bien que la pathologie conventionnelle nous donne beaucoup d’informations sur le microenvironnement rénal, l’imagerie tridimensionnelle (3D) est nécessaire pour comprendre précisément la diaphonie intercellulaire au cours de la progression de la maladie rénale. Dans le passé, un grand nombre de coupes en série et de reconstruction d’images devaient être effectuées pour l’imagerie 3D de l’organe entier1. Cependant, cette méthode nécessitait trop d’efforts et présentait des problèmes en termes de reproductibilité.
Le défrichage optique est une bonne stratégie pour surmonter cet obstacle 2,3. L’opacité tissulaire est principalement due à la diffusion et à l’absorption de la lumière, car chaque organe est constitué de diverses substances, notamment de l’eau, des protéines et des lipides. Ainsi, la stratégie de base de la clairissance tissulaire consiste à remplacer l’eau et les lipides dans les tissus par des réactifs correspondant à l’indice de réfraction (IR) qui ont les mêmes propriétés optiques que les protéines4. Afin d’observer un échantillon transparent, une microscopie fluorescente à feuille de lumière est utile5. Des feuilles lumineuses éclairent l’échantillon transparent de côté, et les signaux d’excitation sont acquis à travers la lentille de l’objectif située en position verticale6. Cette microscopie permet d’obtenir des informations de coupe transversale en un seul balayage, ce qui est différent de la microscopie confocale ou multiphotonique. Ainsi, il peut rapidement acquérir des images z-stack avec un faible niveau de photoblanchiment.
Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) est l’une des méthodes de nettoyage des tissus qui permet l’imagerie d’organes entiers par microscopie fluorescenteà feuille de lumière 2,7,8. La coloration immunofluorescente CUBIC et à montage entier est optimisée dans la présente étude pour visualiser les structures 3D des reinsde souris 9,10,11. En utilisant cette méthode de coloration à montage entier, l’altération des nerfs sympathiques rénaux est visualisée après une lésion d’ischémie-reperfusion 9,10 et une glomérulomégalie au stade précoce de la maladie rénale diabétique 11, ainsi que des vaisseaux sanguins, des tubules proximaux et des canaux collecteurs dans un rein entier 9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td>Tissue clearing, staining, wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>D1876</td>
			<td>CUBIC-R+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37%-Formaldehyde Solution</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>16223-55</td>
			<td>Post fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>09154-85</td>
			<td>Kidney fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21436</td>
			<td>Secondary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31573</td>
			<td>Secondary antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab199975</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-podocin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0372</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab85626</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-smooth muscle actin (&#945;-SMA) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5694</td>
			<td>Primary antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocker Casein in PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>37528</td>
			<td>Staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol Tartrate</td>
			<td>Meiji</td>
			<td>005526</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6NJcl</td>
			<td>Nippon Bio-Supp.Center</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mouse strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macro-zoom microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>The observation unit of the custom-built microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine Hydrochloride</td>
			<td>Kyoritsu-Seiyaku</td>
			<td>008656</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>27803229</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Immersion oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-buthyldiethanolamine</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>B0725</td>
			<td>CUBIC-L, CUBIC-R+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>N0078</td>
			<td>CUBIC-R+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>12967-45</td>
			<td>CUBIC-L, PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon oil HIVAC-F4</td>
			<td>Shin-Etsu Chemical</td>
			<td>50449832</td>
			<td>Immersion oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-11092</td>
			<td>Staining buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-kidney three-dimensional staining with cubic

Bien que la pathologie conventionnelle fournisse de nombreuses informations sur la microstructure rénale, il était difficile de connaître la structure précise des vaisseaux sanguins, des tubules proximaux, des canaux collecteurs, des glomérules et des nerfs sympathiques dans le rein en raison du manque d’informations tridimensionnelles (3D). La compensation optique est une bonne stratégie pour surmonter ce gros obstacle. Plusieurs cellules d’un organe entier peuvent être analysées à une résolution unicellulaire en combinant la clairance tissulaire et la technique d’imagerie 3D. Cependant, les méthodes de marquage cellulaire pour l’imagerie des organes entiers restent sous-développées. En particulier, la coloration des organes entiers est difficile en raison de la difficulté de pénétration des anticorps. Le présent protocole a développé une coloration rénale de souris à montage entier pour l’imagerie 3D avec la méthode de nettoyage tissulaire CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis). Le protocole a permis de visualiser la dénervation sympathique rénale après une lésion d’ischémie-reperfusion et une glomérulomégalie au stade précoce de la maladie rénale diabétique d’un point de vue global. Ainsi, cette technique peut mener à de nouvelles découvertes dans la recherche rénale en fournissant une perspective macroscopique.

En utilisant cette méthode de coloration, les nerfs sympathiques [anticorps anti-tyrosine hydroxylase (TH)] et les artères [anticorps anti-actine α-muscle lisse (αSMA)] dans un rein entier (Figure 4A, B et Vidéo 1) ont été visualisés9. Des nerfs sympathiques rénaux anormaux ont également été visualisés après une lésion d’ischémie/reperfusion (IRI)9,10 (<stron...

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Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC

Le présent protocole décrit une méthode de nettoyage tissulaire et une coloration immunofluorescente à montage entier pour l’imagerie rénale tridimensionnelle (3D). Cette technique peut offrir des perspectives macroscopiques en pathologie rénale, conduisant à de nouvelles découvertes biologiques.

Coloration tridimensionnelle des reins entiers avec CUBIC

Although conventional pathology provided numerous information about kidney microstructure, it was difficult to know the precise structure of blood ...

Ce protocole permet une visualisation des structures tridimensionnelles en rein complet, ce qui peut mener à des découvertes innovantes dans la recherche rénale en fournissant une perspective macroscopique. La coloration des organes entiers est difficile en raison de la difficulté de pénétration des anticorps. Ce protocole a démontré la coloration complète de haute qualité des reins par les anticorps.Pour commencer, effectuez la fixation par immersion immédiatement après la fixation de perfusion et le prélèvement rénal, en immergeant le rein dans du paraformaldéhyde à 4% à quatre degrés Celsius pendant 16 heures. Donnez trois lavages en utilisant PBS pendant deux heures chacun. Effectuer le processus de décoloration et de délipidation en immergeant le rein fixe dans sept millimètres de 50% CUBIC-L dans un tube à fond rond de 14 millilitres, en agitant doucement à température ambiante.Après six heures, plongez le rein dans sept millilitres de CUBIC-L dans un tube à fond rond de 14 millimètres, en agitant doucement à 37 degrés Celsius pendant cinq jours. Actualisez CUBIC-L tous les jours. Une fois la décoloration et la délipidation terminées, utilisez une cuillère de distribution pour la manipulation de l’échantillon et lavez le rein trois fois avec du PBS à température ambiante pendant deux heures.Immunocolorer le rein délipidé dans des anticorps primaires dilués dans une solution tampon de coloration, avec agitation douce dans un agitateur incubateur à 37 degrés Celsius pendant sept jours. Ensuite, lavez le rein avec 0,5% Triton X-100 dans PBS, également connu sous le nom de PBST, à température ambiante pendant une journée. Pour la coloration des anticorps secondaires, traiter le rein avec des anticorps secondaires dans le tampon de coloration, dans l’obscurité, avec une légère agitation à 37 degrés Celsius pendant sept jours.Fixez la coloration avec un lavage PBST à température ambiante pendant une journée. Après la fixation, immergez le rein dans du formaldéhyde à 1% dans du PB pendant trois heures et lavez-le avec du PBS à température ambiante pendant six heures. Effectuez l’appariement de l’indice de réfraction en immergeant le rein dans sept millilitres de 50% CUBIC-R+ dans un tube à fond rond de 14 millilitres avec agitation pendant une journée, suivi d’un traitement avec sept millilitres de CUBIC-R+ avec agitation à température ambiante pendant deux jours.Avec l’aide de la méthode de coloration immunitaire, les nerfs sympathiques et les artères d’un rein entier ont été visualisés en imagerie rénale 3D. De plus, des nerfs sympathiques rénaux anormaux ont été visualisés après une lésion d’ischémie-reperfusion. Ce protocole a également facilité la visualisation des nerfs sympathiques dans toute la rate.Le processus de quantification des données pour la coloration immunofluorescente tridimensionnelle est présenté ici. De plus, les canaux collecteurs, le segment S1 des tubules proximaux et les glomérules ont été visualisés avec succès dans un rein entier. La glomérulomégalie supprimée, résultant de l’administration de médicaments dans les premiers stades de la maladie rénale diabétique, a également été visualisée en imagerie 3D.Ce protocole peut marquer la molécule spécifique dans un rein entier. Ainsi, les chercheurs peuvent analyser l’altération de la structure dans le système vasculaire ou trouver des événements rares dans les tissus rénaux.

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