Name: whole-kidney three-dimensional staining with cubic
Uploaded: 2022-07-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC at JoVE.com

Ein Teil dieser Arbeit wurde in Zusammenarbeit mit Prof. Hiroki R. Ueda (Universität Tokio), Prof. Etsuo A. Susaki (Juntendo University), Prof. Tetsuhiro Tanaka (Tohoku University), Prof. Masafumi Fukagawa, Dr. Takehiko Wada und Dr. Hirotaka Komaba (Tokai University) durchgeführt.

Alle Experimente wurden vom University of Tokyo Institutional Review Board genehmigt. Alle Tierverfahren wurden gemäß den Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt. Männliche C57BL/6NJcl-Mäuse, 8 Wochen alt, wurden für die vorliegende Studie verwendet. Die Mäuse wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle).
1. Tierpräparation und Nierenfixierung
<ol><li>Führen Sie eine Perfusionsfixierung durch, indem Sie die fo...

<ol>
	<li>Velez-Fort, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stimulus+selectivity+and+connectivity+of+layer+six+principal+cells+reveals+cortical+microcircuits+underlying+visual+processing.">The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing.</a> Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Landscape+for+Tissue+Clearing+Based+on+Hydrophilic+Reagents.">Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents.</a> Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).</li><li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution:+toward+organism-level+systems+biology+in+mammals.">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li><li>Keller, P. J., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens.">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution.">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li><li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+three-dimensional+analysis+(CUBIC-kidney)+visualizes+abnormal+renal+sympathetic+nerves+after+ischemia/reperfusion+injury.">Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury.</a> Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).</li><li>Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+interactions+and+kidney+disease.">Neuroimmune interactions and kidney disease.</a> Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).</li><li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oral+hypoxia-inducible+factor+prolyl+hydroxylase+inhibitor+enarodustat+counteracts+alterations+in+renal+energy+metabolism+in+the+early+stages+of+diabetic+kidney+disease.">The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease.</a> Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+sympathetic+signaling+in+macrophages+blocks+systemic+inflammation+and+protects+against+renal+ischemia-reperfusion+injury.">Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+evaluation+of+total+glomerular+number+and+capillary+tuft+size+in+nephritic+kidneys+using+lightsheet+microscopy.">Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+probing+of+intact+human+organs.">Cellular and molecular probing of intact human organs.</a> Cell. 180 (4), 796-812 (2020).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+whole-organ/body+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues.">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).</li></ol>

Das vorliegende Protokoll ermöglichte die 3D-Bildgebung verschiedener Strukturen wie Sympathikusnerven, Sammelkanäle, Arterien, proximaler Tubuli und Glomeruli 9,10,11. Diese Färbemethode bot makroskopische Beobachtung und führte zu neuen biologischen Entdeckungen, indem sie die Veränderung der Nierensympathikusnerven nach Ischämie-Reperfusionsverletzung 9,10 und Glomerulomegalie im Anfan...

Die Niere besteht aus verschiedenen Zellpopulationen. Obwohl die konventionelle Pathologie uns viele Informationen über die Nierenmikroumgebung liefert, ist eine dreidimensionale (3D) Bildgebung erforderlich, um das interzelluläre Übersprechen während des Fortschreitens der Nierenerkrankung genau zu verstehen. In der Vergangenheit musste eine Vielzahl von seriellen Schnitten und Bildrekonstruktionen für die 3D-Bildgebung des gesamten Organsdurchgeführt werden 1. Diese Methode erforderte jedoch zu viel Aufwand und hatte Probleme in Bezug auf die Reproduzierbarkeit.
Optisches Löschen ist eine gute Strategie, um diese Hürde zu überwinden 2,3. Die Trübung des Gewebes ist hauptsächlich auf Lichtstreuung und -absorption zurückzuführen, da jedes Organ aus verschiedenen Substanzen besteht, darunter Wasser, Protein und Lipide. Daher besteht die grundlegende Strategie der Gewebereinigung darin, Wasser und Lipide in Geweben durch Reagenzien mit Brechungsindex (RI) zu ersetzen, die die gleichen optischen Eigenschaften wie Proteine haben4. Um eine transparente Probe zu beobachten, ist eine Leuchtblatt-Fluoreszenzmikroskopie sinnvoll5. Lichtblätter beleuchten die transparente Probe von der Seite, und Anregungssignale werden durch die Objektivlinse erfasst, die sich in vertikaler Positionbefindet 6. Diese Mikroskopie erhält Querschnittsinformationen in einem einzigen Sweep, die sich von der konfokalen oder Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie unterscheidet. So kann es schnell Z-Stack-Bilder mit einem geringen Maß an Photobleiche aufnehmen.
Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) ist eine der Gewebereinigungsmethoden, die eine Ganzorganbildgebung mittels Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie 2,7,8 ermöglicht. CUBIC und die Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung werden in der vorliegenden Studie optimiert, um 3D-Strukturen der Mausnierezu visualisieren 9,10,11. Mit dieser Whole-Mount-Färbemethode wird die Veränderung der Nierensympathikusnerven nach Ischämie-Reperfusionsverletzung 9,10 und Glomerulomegalie im Frühstadium der diabetischen Nierenerkrankung 11 sowie Blutgefäßen, proximalen Tubuli und Sammelkanälen in einerganzen Niere 9 visualisiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td>Tissue clearing, staining, wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>D1876</td>
			<td>CUBIC-R+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37%-Formaldehyde Solution</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>16223-55</td>
			<td>Post fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>09154-85</td>
			<td>Kidney fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21436</td>
			<td>Secondary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31573</td>
			<td>Secondary antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab199975</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-podocin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0372</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab85626</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-smooth muscle actin (&#945;-SMA) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5694</td>
			<td>Primary antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocker Casein in PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>37528</td>
			<td>Staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol Tartrate</td>
			<td>Meiji</td>
			<td>005526</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6NJcl</td>
			<td>Nippon Bio-Supp.Center</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mouse strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macro-zoom microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>The observation unit of the custom-built microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine Hydrochloride</td>
			<td>Kyoritsu-Seiyaku</td>
			<td>008656</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>27803229</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Immersion oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-buthyldiethanolamine</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>B0725</td>
			<td>CUBIC-L, CUBIC-R+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>N0078</td>
			<td>CUBIC-R+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>12967-45</td>
			<td>CUBIC-L, PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon oil HIVAC-F4</td>
			<td>Shin-Etsu Chemical</td>
			<td>50449832</td>
			<td>Immersion oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-11092</td>
			<td>Staining buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-kidney three-dimensional staining with cubic

Obwohl die konventionelle Pathologie zahlreiche Informationen über die Nierenmikrostruktur lieferte, war es aufgrund des Mangels an dreidimensionalen (3D) Informationen schwierig, die genaue Struktur von Blutgefäßen, proximalen Tubuli, Sammelkanälen, Glomeruli und sympathischen Nerven in der Niere zu kennen. Optisches Clearing ist eine gute Strategie, um diese große Hürde zu überwinden. Mehrere Zellen in einem ganzen Organ können mit Einzelzellauflösung analysiert werden, indem Gewebereinigung und 3D-Bildgebungstechnik kombiniert werden. Zellmarkierungsmethoden für die Bildgebung ganzer Organe sind jedoch noch unterentwickelt. Insbesondere die Färbung ganzer Organe ist aufgrund der Schwierigkeit der Antikörperpenetration eine Herausforderung. Das vorliegende Protokoll entwickelte eine vollständige Mausnierenfärbung für die 3D-Bildgebung mit der CUBIC-Methode (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis) zur Gewebereinigung. Das Protokoll hat es ermöglicht, die renale sympathische Denervierung nach Ischämie-Reperfusionsverletzung und Glomerulomegalie im Frühstadium der diabetischen Nierenerkrankung aus einem umfassenden Blickwinkel zu visualisieren. So kann diese Technik zu neuen Entdeckungen in der Nierenforschung führen, indem sie eine makroskopische Perspektive bietet.

Mit dieser Färbemethode wurden sympathische Nerven [Anti-Tyrosinhydroxylase (TH)-Antikörper] und Arterien [Anti-α-glatter Muskelaktin-Antikörper (αSMA)-Antikörper] in einer ganzen Niere sichtbar gemacht (Abbildung 4A,B und Video 1)9. Abnorme renale Sympathikusnerven wurden auch nach Ischämie/Reperfusionsverletzung (IRI) visualisiert9,10 (Abbildung 4...

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Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Gewebereinigungsmethode und eine Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung für die dreidimensionale (3D) Nierenbildgebung. Diese Technik kann makroskopische Perspektiven in der Nierenpathologie bieten, was zu neuen biologischen Entdeckungen führt.

Ganznieren-dreidimensionale Färbung mit CUBIC

Although conventional pathology provided numerous information about kidney microstructure, it was difficult to know the precise structure of blood ...

Dieses Protokoll ermöglicht eine Visualisierung dreidimensionaler Strukturen in der vollen Niere, was durch eine makroskopische Perspektive zu innovativen Entdeckungen in der Nierenforschung führen kann. Die Färbung ganzer Organe ist aufgrund der Schwierigkeit der Antikörperpenetration eine Herausforderung. Dieses Protokoll hat die qualitativ hochwertige, vollständige Färbung der Nieren durch die Antikörper nachgewiesen.Um zu beginnen, führen Sie die Immersionsfixierung unmittelbar nach der Perfusionsfixierung und Nierenprobenahme durch, indem Sie die Niere 16 Stunden lang in 4% Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius tauchen. Geben Sie drei Wäschen mit PBS für jeweils zwei Stunden. Führen Sie den Entfärbungs- und Delipidierungsprozess durch, indem Sie die festsitzende Niere in sieben Millimeter 50% CUBIC-L in einem 14-Milliliter-Rundbodenrohr mit leichtem Schütteln bei Raumtemperatur eintauchen.Nach sechs Stunden tauchen Sie die Niere in sieben Milliliter CUBIC-L in einem 14 Millimeter Rundbodenrohr mit leichtem Schütteln bei 37 Grad Celsius für fünf Tage. Aktualisieren Sie CUBIC-L jeden Tag. Sobald die Entfärbung und Delipidierung abgeschlossen sind, verwenden Sie einen Dosierlöffel für die Probenhandhabung und waschen Sie die Niere dreimal mit PBS bei Raumtemperatur für zwei Stunden.Immunfärbung der delipidierten Niere in primären Antikörpern, verdünnt in Färbepufferlösung, mit leichtem Schütteln in einem Inkubatorschüttler bei 37 Grad Celsius für sieben Tage. Dann waschen Sie die Niere mit 0,5% Triton X-100 in PBS, auch bekannt als PBST, bei Raumtemperatur für einen Tag. Für die sekundäre Antikörperfärbung behandeln Sie die Niere mit sekundären Antikörpern im Färbepuffer, im Dunkeln, mit leichtem Schütteln bei 37 Grad Celsius für sieben Tage.Fixieren Sie die Flecken mit einer PBST-Wäsche bei Raumtemperatur für einen Tag. Nach der Fixierung tauchen Sie die Niere drei Stunden lang in 1% Formaldehyd in PB ein und waschen Sie sie sechs Stunden lang mit PBS bei Raumtemperatur. Führen Sie die Brechungsindexanpassung durch, indem Sie die Niere in sieben Milliliter 50% CUBIC-R+ in ein 14-Milliliter-Rundbodenrohr mit Schütteln für einen Tag tauchen, gefolgt von einer Behandlung mit sieben Milliliter CUBIC-R+ mit Schütteln bei Raumtemperatur für zwei Tage.Mit Hilfe der Immunfärbemethode wurden sympathische Nerven und Arterien in einer ganzen Niere in der 3D-Nierenbildgebung sichtbar gemacht. Darüber hinaus wurden abnormale Nierensympathikusnerven nach Ischämie-Reperfusionsverletzung visualisiert. Dieses Protokoll erleichterte auch die Visualisierung sympathischer Nerven in der gesamten Milz.Hier wird der Datenquantifizierungsprozess für die dreidimensionale Immunfluoreszenzfärbung dargestellt. Darüber hinaus wurden Sammelkanäle, das S1-Segment der proximalen Tubuli und die Glomeruli erfolgreich in einer ganzen Niere sichtbar gemacht. Die unterdrückte Glomerulomegalie, die aus der Medikamentenverabreichung in den frühen Stadien der diabetischen Nierenerkrankung resultiert, wurde auch in der 3D-Bildgebung visualisiert.Dieses Protokoll kann das spezifische Molekül in einer ganzen Niere markieren. So können Forscher Strukturveränderungen im Gefäßsystem analysieren oder seltene Ereignisse im Nierengewebe finden.

Research

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Medicine

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Medizin

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

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It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

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Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Dreidimensionale Alginat-Perle Kultur der Menschen Hypophysenadenom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

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Drei-dimensionale Druck einer komplexen Aorten Anomalie

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