Name: whole-kidney three-dimensional staining with cubic
Uploaded: 2022-07-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC at JoVE.com

Parte di questo lavoro è stato condotto attraverso la collaborazione con il Prof. Hiroki R. Ueda (Università di Tokyo), il Prof. Etsuo A. Susaki (Juntendo University), il Prof. Tetsuhiro Tanaka (Tohoku University), il Prof. Masafumi Fukagawa, il Dr. Takehiko Wada e il Dr. Hirotaka Komaba (Tokai University).

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dall'Institutional Review Board dell'Università di Tokyo. Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite secondo le linee guida del National Institutes of Health. Topi maschi C57BL / 6NJcl, di 8 settimane, sono stati utilizzati per il presente studio. I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali).
1. Preparazione animale e fissazione dei reni
<ol><li>Eseguire la fissazione della...

<ol>
	<li>Velez-Fort, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stimulus+selectivity+and+connectivity+of+layer+six+principal+cells+reveals+cortical+microcircuits+underlying+visual+processing.">The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing.</a> Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Landscape+for+Tissue+Clearing+Based+on+Hydrophilic+Reagents.">Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents.</a> Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).</li><li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution:+toward+organism-level+systems+biology+in+mammals.">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li><li>Keller, P. J., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens.">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution.">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li><li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+three-dimensional+analysis+(CUBIC-kidney)+visualizes+abnormal+renal+sympathetic+nerves+after+ischemia/reperfusion+injury.">Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury.</a> Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).</li><li>Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+interactions+and+kidney+disease.">Neuroimmune interactions and kidney disease.</a> Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).</li><li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oral+hypoxia-inducible+factor+prolyl+hydroxylase+inhibitor+enarodustat+counteracts+alterations+in+renal+energy+metabolism+in+the+early+stages+of+diabetic+kidney+disease.">The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease.</a> Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+sympathetic+signaling+in+macrophages+blocks+systemic+inflammation+and+protects+against+renal+ischemia-reperfusion+injury.">Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+evaluation+of+total+glomerular+number+and+capillary+tuft+size+in+nephritic+kidneys+using+lightsheet+microscopy.">Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+probing+of+intact+human+organs.">Cellular and molecular probing of intact human organs.</a> Cell. 180 (4), 796-812 (2020).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+whole-organ/body+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues.">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).</li></ol>

Il presente protocollo ha permesso l'imaging 3D dell'intero rene di varie strutture come nervi simpatici, dotti collettivi, arterie, tubuli prossimali e glomeruli 9,10,11. Questo metodo di colorazione ha offerto un'osservazione macroscopica e ha portato a nuove scoperte biologiche, visualizzando l'alterazione dei nervi simpatici renali dopo danno da ischemia-riperfusione 9,10 e glomerulomegalia...

Il rene è composto da varie popolazioni cellulari. Sebbene la patologia convenzionale ci fornisca molte informazioni sul microambiente renale, è necessaria l'imaging tridimensionale (3D) per comprendere con precisione la diafonia intercellulare durante la progressione della malattia renale. In passato, era necessario eseguire un numero enorme di sezionamenti seriali e ricostruzione delle immagini per l'imaging 3D dell'intero organo1. Tuttavia, questo metodo richiedeva troppo sforzo e presentava problemi in termini di riproducibilità.
La compensazione ottica è una buona strategia per superare questo ostacolo 2,3. L'opacità tissutale è dovuta principalmente alla diffusione e all'assorbimento della luce perché ogni organo è costituito da varie sostanze, tra cui acqua, proteine e lipidi. Pertanto, la strategia di base della pulizia dei tessuti consiste nel sostituire l'acqua e i lipidi nei tessuti con reagenti corrispondenti all'indice di rifrazione (RI) che hanno le stesse proprietà ottiche delle proteine4. Per osservare un campione trasparente, è utile una microscopia fluorescente a foglio di luce5. I fogli luminosi illuminano il campione trasparente dal lato e i segnali di eccitazione vengono acquisiti attraverso la lente dell'obiettivo situata in posizione verticale6. Questa microscopia ottiene informazioni di sezione trasversale in un singolo sweep, che è diverso dalla microscopia fluorescente confocale o multifotone. Pertanto, può acquisire rapidamente immagini z-stack con un basso livello di photobleaching.
Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) è uno dei metodi di pulizia dei tessuti che consente l'imaging dell'intero organo mediante microscopia fluorescente a foglio luminoso 2,7,8. La colorazione immunofluorescente CUBIC e a montaggio intero è ottimizzata nel presente studio per visualizzare le strutture 3D del rene di topo 9,10,11. Utilizzando questo metodo di colorazione a montaggio intero, l'alterazione dei nervi simpatici renali viene visualizzata dopo il danno da ischemia-riperfusione 9,10 e la glomerulomegalia nella fase iniziale della malattia renale diabetica 11, così come i vasi sanguigni, i tubuli prossimali e i dotti collettori in un rene intero9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td>Tissue clearing, staining, wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>D1876</td>
			<td>CUBIC-R+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37%-Formaldehyde Solution</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>16223-55</td>
			<td>Post fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>09154-85</td>
			<td>Kidney fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21436</td>
			<td>Secondary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31573</td>
			<td>Secondary antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab199975</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-podocin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0372</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab85626</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-smooth muscle actin (&#945;-SMA) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5694</td>
			<td>Primary antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocker Casein in PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>37528</td>
			<td>Staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol Tartrate</td>
			<td>Meiji</td>
			<td>005526</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6NJcl</td>
			<td>Nippon Bio-Supp.Center</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mouse strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macro-zoom microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>The observation unit of the custom-built microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine Hydrochloride</td>
			<td>Kyoritsu-Seiyaku</td>
			<td>008656</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>27803229</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Immersion oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-buthyldiethanolamine</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>B0725</td>
			<td>CUBIC-L, CUBIC-R+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>N0078</td>
			<td>CUBIC-R+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>12967-45</td>
			<td>CUBIC-L, PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon oil HIVAC-F4</td>
			<td>Shin-Etsu Chemical</td>
			<td>50449832</td>
			<td>Immersion oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-11092</td>
			<td>Staining buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-kidney three-dimensional staining with cubic

Sebbene la patologia convenzionale fornisse numerose informazioni sulla microstruttura renale, era difficile conoscere la struttura precisa dei vasi sanguigni, dei tubuli prossimali, dei dotti collettivi, dei glomeruli e dei nervi simpatici nel rene a causa della mancanza di informazioni tridimensionali (3D). La compensazione ottica è una buona strategia per superare questo grande ostacolo. Più cellule in un intero organo possono essere analizzate alla risoluzione di una singola cellula combinando la pulizia dei tessuti e la tecnica di imaging 3D. Tuttavia, i metodi di etichettatura cellulare per l'imaging dell'intero organo rimangono sottosviluppati. In particolare, la colorazione dell'intero organo è difficile a causa della difficoltà nella penetrazione degli anticorpi. Il presente protocollo ha sviluppato una colorazione renale di topo a montaggio intero per l'imaging 3D con il metodo di pulizia dei tessuti CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis). Il protocollo ha permesso di visualizzare la denervazione simpatica renale dopo danno da ischemia-riperfusione e glomerulomegalia nella fase iniziale della malattia renale diabetica da un punto di vista completo. Pertanto, questa tecnica può portare a nuove scoperte nella ricerca sui reni fornendo una prospettiva macroscopica.

Utilizzando questo metodo di colorazione, sono stati visualizzati i nervi simpatici [anticorpo anti-tirosina idrossilasi (TH)] e le arterie [anticorpo anti-α-actina del muscolo liscio (αSMA)] in un rene intero (Figura 4A, B e Video 1). Sono stati visualizzati anche nervi simpatici renali anomali dopo ischemia/danno da riperfusione (IRI)9,10 (Figura 4C</s...

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Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC

Il presente protocollo descrive un metodo di pulizia dei tessuti e una colorazione immunofluorescente a montaggio intero per l'imaging renale tridimensionale (3D). Questa tecnica può offrire prospettive macroscopiche nella patologia renale, portando a nuove scoperte biologiche.

Colorazione tridimensionale a rene intero con CUBIC

Although conventional pathology provided numerous information about kidney microstructure, it was difficult to know the precise structure of blood ...

Questo protocollo consente una visualizzazione di strutture tridimensionali in rene pieno, che può portare a scoperte innovative nella ricerca renale fornendo una prospettiva macroscopica. La colorazione dell'intero organo è difficile a causa della difficoltà nella penetrazione degli anticorpi. Questo protocollo ha dimostrato l'alta qualità, colorazione a montaggio intero dei reni da parte degli anticorpi.Per iniziare, eseguire la fissazione per immersione immediatamente dopo la fissazione della perfusione e il prelievo del rene, immergendo il rene in paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius per 16 ore. Dare tre lavaggi usando PBS per due ore ciascuno. Eseguire il processo di decolorazione e delipidazione immergendo il rene fisso in sette millimetri di 50%CUBIC-L in un tubo a fondo tondo da 14 millilitri, con agitazione delicata a temperatura ambiente.Dopo sei ore, immergere il rene in sette millilitri di CUBIC-L in un tubo a fondo rotondo da 14 millimetri, con un leggero scuotimento a 37 gradi Celsius per cinque giorni. Aggiornare CUBIC-L ogni giorno. Una volta completata la decolorazione e la delipidazione, utilizzare un cucchiaio dosatore per la manipolazione del campione e lavare il rene tre volte con PBS a temperatura ambiente per due ore.Colorare il rene delipidizzato in anticorpi primari diluiti in soluzione tampone colorante, con leggero scuotimento in uno shaker incubatore a 37 gradi Celsius per sette giorni. Quindi, lavare il rene con 0,5% Triton X-100 in PBS, noto anche come PBST, a temperatura ambiente per un giorno. Per la colorazione degli anticorpi secondari, trattare il rene con anticorpi secondari nel tampone di colorazione, al buio, con un leggero scuotimento a 37 gradi Celsius per sette giorni.Fissare la colorazione con un lavaggio PBST a temperatura ambiente per un giorno. Dopo la fissazione, immergere il rene in formaldeide all'1% in PB per tre ore e lavarlo con PBS a temperatura ambiente per sei ore. Eseguire la corrispondenza dell'indice di rifrazione immergendo il rene in sette millilitri di 50% CUBIC-R+in un tubo a fondo tondo da 14 millilitri agitando per un giorno, seguito da un trattamento con sette millilitri di CUBIC-R+ agitando a temperatura ambiente per due giorni.Con l'aiuto del metodo di colorazione immunitaria, i nervi simpatici e le arterie in un rene intero sono stati visualizzati nell'imaging renale 3D. Inoltre, i nervi simpatici renali anormali sono stati visualizzati dopo danno da ischemia-riperfusione. Questo protocollo ha anche facilitato la visualizzazione dei nervi simpatici in tutta la milza.Il processo di quantificazione dei dati per la colorazione immunofluorescente tridimensionale è visualizzato qui. Inoltre, i dotti di raccolta, il segmento S1 dei tubuli prossimali e i glomeruli sono stati visualizzati con successo in un intero rene. La glomerulomegalia soppressa, derivante dalla somministrazione di farmaci nelle prime fasi della malattia renale diabetica, è stata visualizzata anche nell'imaging 3D.Questo protocollo può etichettare la molecola specifica all'interno di un intero rene. Pertanto, i ricercatori possono analizzare l'alterazione della struttura nel sistema vascolare o trovare eventi rari nei tessuti renali.

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