Name: whole-kidney three-dimensional staining with cubic
Uploaded: 2022-07-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC at JoVE.com

Parte deste trabalho foi realizado através da colaboração com o Prof. Hiroki R. Ueda (Universidade de Tóquio), Prof. Etsuo A. Susaki (Universidade de Juntendo), Prof. Tetsuhiro Tanaka (Universidade de Tohoku), Prof. Masafumi Fukagawa, Dr. Takehiko Wada e Dr. Hirotaka Komaba (Universidade de Tokai).

Todos os experimentos foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Tóquio. Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health. Camundongos machos C57BL/6NJcl, com 8 semanas de idade, foram utilizados para o presente estudo. Os camundongos foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).
1. Preparação animal e fixação renal
<ol><li>Realize a fixação ...

<ol>
	<li>Velez-Fort, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stimulus+selectivity+and+connectivity+of+layer+six+principal+cells+reveals+cortical+microcircuits+underlying+visual+processing.">The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing.</a> Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Landscape+for+Tissue+Clearing+Based+on+Hydrophilic+Reagents.">Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents.</a> Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).</li><li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution:+toward+organism-level+systems+biology+in+mammals.">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li><li>Keller, P. J., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens.">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution.">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li><li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+three-dimensional+analysis+(CUBIC-kidney)+visualizes+abnormal+renal+sympathetic+nerves+after+ischemia/reperfusion+injury.">Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury.</a> Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).</li><li>Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+interactions+and+kidney+disease.">Neuroimmune interactions and kidney disease.</a> Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).</li><li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oral+hypoxia-inducible+factor+prolyl+hydroxylase+inhibitor+enarodustat+counteracts+alterations+in+renal+energy+metabolism+in+the+early+stages+of+diabetic+kidney+disease.">The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease.</a> Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+sympathetic+signaling+in+macrophages+blocks+systemic+inflammation+and+protects+against+renal+ischemia-reperfusion+injury.">Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+evaluation+of+total+glomerular+number+and+capillary+tuft+size+in+nephritic+kidneys+using+lightsheet+microscopy.">Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+probing+of+intact+human+organs.">Cellular and molecular probing of intact human organs.</a> Cell. 180 (4), 796-812 (2020).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+whole-organ/body+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues.">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).</li></ol>

O presente protocolo permitiu a imagem 3D de todo o rim de várias estruturas, como nervos simpáticos, ductos coletores, artérias, túbulos proximais e glomérulos 9,10,11. Esse método de coloração ofereceu observação macroscópica e levou a novas descobertas biológicas, visualizando a alteração dos nervos simpáticos renais após lesão de isquemia-reperfusão 9,10 e glomerulomegalia...

O rim é composto por várias populações celulares. Embora a patologia convencional nos dê muita informação sobre o microambiente renal, a imagem tridimensional (3D) é necessária para entender com precisão o crosstalk intercelular durante a progressão da doença renal. No passado, um grande número de cortes seriados e reconstrução de imagens precisava ser realizado para a imagem 3D de todo o órgão1. No entanto, este método exigiu muito esforço e teve problemas em termos de reprodutibilidade.
A limpeza óptica é uma boa estratégia para superar esse obstáculo 2,3. A opacidade tecidual é principalmente devido à dispersão e absorção de luz, porque cada órgão consiste em várias substâncias, incluindo água, proteínas e lipídios. Assim, a estratégia básica de clareamento tecidual é a substituição de água e lipídios nos tecidos por reagentes correspondentes ao índice de refração (IR) que possuem as mesmas propriedades ópticas que as proteínas4. Para observar um espécime transparente, uma microscopia fluorescente de folha de luz é útil5. As folhas de luz iluminam a amostra transparente de lado, e os sinais de excitação são adquiridos através da lente objetiva localizada em uma posição vertical6. Esta microscopia obtém informações de seção transversal em uma única varredura, que é diferente da microscopia fluorescente confocal ou multifóton. Assim, ele pode adquirir rapidamente imagens z-stack com um baixo nível de fotobranqueamento.
Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) é um dos métodos de clareamento tecidual que permite a imagem de órgãos inteiros por microscopia fluorescente de folha de luz 2,7,8. A coloração CUBIC e imunofluorescente de montagem completa são otimizadas no presente estudo para visualizar estruturas 3D renais de camundongos 9,10,11. Utilizando esse método de coloração de montagem completa, a alteração nos nervos simpáticos renais é visualizada após lesão de isquemia-reperfusão 9,10 e glomerulomegalia no estágio inicial da doença renal diabética 11, bem como vasos sanguíneos, túbulos proximais e ductos coletores em um rim inteiro9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td>Tissue clearing, staining, wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>D1876</td>
			<td>CUBIC-R+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37%-Formaldehyde Solution</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>16223-55</td>
			<td>Post fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>09154-85</td>
			<td>Kidney fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21436</td>
			<td>Secondary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31573</td>
			<td>Secondary antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab199975</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-podocin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0372</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab85626</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-smooth muscle actin (&#945;-SMA) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5694</td>
			<td>Primary antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocker Casein in PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>37528</td>
			<td>Staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol Tartrate</td>
			<td>Meiji</td>
			<td>005526</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6NJcl</td>
			<td>Nippon Bio-Supp.Center</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mouse strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macro-zoom microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>The observation unit of the custom-built microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine Hydrochloride</td>
			<td>Kyoritsu-Seiyaku</td>
			<td>008656</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>27803229</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Immersion oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-buthyldiethanolamine</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>B0725</td>
			<td>CUBIC-L, CUBIC-R+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>N0078</td>
			<td>CUBIC-R+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>12967-45</td>
			<td>CUBIC-L, PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon oil HIVAC-F4</td>
			<td>Shin-Etsu Chemical</td>
			<td>50449832</td>
			<td>Immersion oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-11092</td>
			<td>Staining buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-kidney three-dimensional staining with cubic

Embora a patologia convencional fornecesse inúmeras informações sobre a microestrutura renal, era difícil saber a estrutura precisa dos vasos sanguíneos, túbulos proximais, ductos coletores, glomérulos e nervos simpáticos no rim devido à falta de informações tridimensionais (3D). A limpeza óptica é uma boa estratégia para superar esse grande obstáculo. Múltiplas células em um órgão inteiro podem ser analisadas em resolução de célula única, combinando limpeza de tecido e técnica de imagem 3D. No entanto, os métodos de marcação celular para imagens de órgãos inteiros permanecem subdesenvolvidos. Em particular, a coloração de órgãos de montagem inteira é um desafio devido à dificuldade de penetração de anticorpos. O presente protocolo desenvolveu uma coloração renal de camundongo de montagem completa para imagens 3D com o método de clareamento tecidual CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis). O protocolo possibilitou visualizar a denervação simpática renal após lesão de isquemia-reperfusão e glomerulomegalia no estágio inicial da doença renal diabética de um ponto de vista abrangente. Assim, esta técnica pode levar a novas descobertas na pesquisa renal, fornecendo uma perspectiva macroscópica.

Utilizando esse método de coloração, foram visualizados nervos simpáticos [anticorpo antitirosina hidroxilase (TH)] e artérias [anticorpo anti-actina do músculo liso (αSMA) anti-α] em um rim inteiro (Figura 4A,B e Vídeo 1)9. Nervos simpáticos renais anormais também foram visualizados após lesão de isquemia/reperfusão (IRA)9,10 (Figura 4C</str...

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Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC

O presente protocolo descreve um método de clareamento tecidual e coloração imunofluorescente de montagem completa para imagens renais tridimensionais (3D). Esta técnica pode oferecer perspectivas macroscópicas na patologia renal, levando a novas descobertas biológicas.

Coloração tridimensional de rim inteiro com CUBIC

Although conventional pathology provided numerous information about kidney microstructure, it was difficult to know the precise structure of blood ...

Este protocolo permite uma visualização de estruturas tridimensionais em rim completo, o que pode levar a descobertas inovadoras na pesquisa renal, fornecendo uma perspectiva macroscópica. A coloração de órgãos de montagem inteira é um desafio devido à dificuldade de penetração de anticorpos. Este protocolo demonstrou a coloração de alta qualidade e montagem completa dos rins pelos anticorpos.Para começar, realizar a fixação da imersão imediatamente após a fixação da perfusão e amostragem renal, imergindo o rim em paraformaldeído a 4% a quatro graus Celsius por 16 horas. Dê três lavagens usando PBS por duas horas cada. Realizar o processo de descoloração e deslipidação imergindo o rim fixo em sete milímetros de 50%CUBIC-L em um tubo de fundo redondo de 14 mililitros, com agitação suave à temperatura ambiente.Após seis horas, mergulhe o rim em sete mililitros de CUBIC-L em um tubo de fundo redondo de 14 milímetros, com agitação suave a 37 graus Celsius por cinco dias. Atualize CUBIC-L todos os dias. Uma vez que a descoloração e a deslipidação estejam completas, use uma colher de dosagem para o manuseio da amostra e lave o rim três vezes com PBS à temperatura ambiente por duas horas.Imunocorante do rim deslipidado em anticorpos primários diluídos em solução tampão de coloração, com agitação suave em um agitador de incubadora a 37 graus Celsius por sete dias. Em seguida, lave o rim com 0,5%Triton X-100 em PBS, também conhecido como PBST, à temperatura ambiente por um dia. Para a coloração de anticorpos secundários, trate o rim com anticorpos secundários no tampão de coloração, no escuro, com agitação suave a 37 graus Celsius por sete dias.Fixe a coloração com uma lavagem PBST à temperatura ambiente durante um dia. Após a fixação, mergulhe o rim em formaldeído a 1% em PB por três horas e lave-o com PBS à temperatura ambiente por seis horas. Realizar a correspondência do índice de refração imergindo o rim em sete mililitros de 50%CUBIC-R+em um tubo de fundo redondo de 14 mililitros com agitação por um dia, seguido de tratamento com sete mililitros de CUBIC-R+com agitação à temperatura ambiente por dois dias.Com a ajuda do método de coloração imunológica, nervos e artérias simpáticas em um rim inteiro foram visualizados em imagens renais 3D. Além disso, nervos simpáticos renais anormais foram visualizados após lesão de isquemia-reperfusão. Este protocolo também facilitou a visualização dos nervos simpáticos em todo o baço.O processo de quantificação dos dados para a coloração imunofluorescente tridimensional é apresentado aqui. Além disso, os ductos coletores, o segmento S1 dos túbulos proximais e os glomérulos foram visualizados com sucesso em todo um rim. A glomerulomegalia suprimida, resultante da administração de medicamentos nos estágios iniciais da doença renal diabética, também foi visualizada em imagens 3D.Este protocolo pode rotular a molécula específica dentro de um rim inteiro. Assim, os pesquisadores podem analisar a alteração da estrutura na vasculatura ou encontrar eventos raros nos tecidos renais.

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