Name: whole-kidney three-dimensional staining with cubic
Uploaded: 2022-07-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC at JoVE.com

Часть этой работы была проведена в сотрудничестве с профессором Хироки Р. Уэда (Токийский университет), профессором Эцуо А. Сусаки (Университет Дзюнтендо), профессором Тецухиро Танака (Университет Тохоку), профессором Масафуми Фукагава, доктором Такехико Вада и доктором Хиротакой Комаба (Университет Токай).

Все эксперименты были одобрены Советом по институциональному обзору Токийского университета. Все процедуры для животных были выполнены в соответствии с руководящими принципами Национального института здравоохранения. Для настоящего исследования использовались самцы мышей C57BL/6NJcl в...

<ol>
	<li>Velez-Fort, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stimulus+selectivity+and+connectivity+of+layer+six+principal+cells+reveals+cortical+microcircuits+underlying+visual+processing.">The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing.</a> Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Landscape+for+Tissue+Clearing+Based+on+Hydrophilic+Reagents.">Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents.</a> Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).</li><li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution:+toward+organism-level+systems+biology+in+mammals.">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li><li>Keller, P. J., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens.">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution.">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li><li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+three-dimensional+analysis+(CUBIC-kidney)+visualizes+abnormal+renal+sympathetic+nerves+after+ischemia/reperfusion+injury.">Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury.</a> Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).</li><li>Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+interactions+and+kidney+disease.">Neuroimmune interactions and kidney disease.</a> Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).</li><li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oral+hypoxia-inducible+factor+prolyl+hydroxylase+inhibitor+enarodustat+counteracts+alterations+in+renal+energy+metabolism+in+the+early+stages+of+diabetic+kidney+disease.">The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease.</a> Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+sympathetic+signaling+in+macrophages+blocks+systemic+inflammation+and+protects+against+renal+ischemia-reperfusion+injury.">Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+evaluation+of+total+glomerular+number+and+capillary+tuft+size+in+nephritic+kidneys+using+lightsheet+microscopy.">Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+probing+of+intact+human+organs.">Cellular and molecular probing of intact human organs.</a> Cell. 180 (4), 796-812 (2020).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+whole-organ/body+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues.">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).</li></ol>

Настоящий протокол позволял проводить 3D-визуализацию всей почки различных структур, таких как симпатические нервы, собирающие протоки, артерии, проксимальные канальцы и клубочки 9,10,11. Этот метод окрашивания предложил макроскопическо...

Почка состоит из различных клеточных популяций. Хотя обычная патология дает нам много информации о микроокружении почек, трехмерная (3D) визуализация необходима для точного понимания межклеточных перекрестных помех во время прогрессирования заболевания почек. В прошлом для 3D-визуализации всего органа1 требовалось выполнить огромное количество серийных секций и реконструкций изображений. Однако этот метод требовал слишком больших усилий и имел проблемы с точки зрения воспроизводимости.
Оптический клиринг является хорошей стратегией для преодоления этого препятствия 2,3. Помутнение тканей в основном связано с рассеянием и поглощением света, потому что каждый орган состоит из различных веществ, включая воду, белок и липиды. Таким образом, основной стратегией очистки тканей является замена воды и липидов в тканях реагентами, соответствующими показателю преломления (RI), которые обладают теми же оптическими свойствами, что и белки4. Для того чтобы наблюдать прозрачный образец, полезна световая листовая флуоресцентная микроскопия5. Световые листы освещают прозрачный образец сбоку, а сигналы возбуждения принимаются через объектив, расположенный в вертикальном положении6. Эта микроскопия получает информацию о поперечном сечении за один развертку, которая отличается от конфокальной или многофотонной флуоресцентной микроскопии. Таким образом, он может быстро получать z-стековые изображения с низким уровнем фотоотбеливания.
Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) является одним из методов очистки тканей, который позволяет визуализировать весь орган с помощью флуоресцентной микроскопиисветового листа 2,7,8. CUBIC и цельное иммунофлуоресцентное окрашивание оптимизированы в настоящем исследовании для визуализации 3D-структур почек мыши 9,10,11. С помощью этого цельно-монтажного метода окрашивания визуализируется изменение почечных симпатических нервов после ишемии-реперфузионного повреждения 9,10 и клубомерулегалии на ранней стадии диабетической болезни почек11, а также кровеносных сосудов, проксимальных канальцев и собирающих протоков во всей почке9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td>Tissue clearing, staining, wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>D1876</td>
			<td>CUBIC-R+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37%-Formaldehyde Solution</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>16223-55</td>
			<td>Post fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>09154-85</td>
			<td>Kidney fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21436</td>
			<td>Secondary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31573</td>
			<td>Secondary antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab199975</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-podocin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0372</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab85626</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-smooth muscle actin (&#945;-SMA) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5694</td>
			<td>Primary antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocker Casein in PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>37528</td>
			<td>Staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol Tartrate</td>
			<td>Meiji</td>
			<td>005526</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6NJcl</td>
			<td>Nippon Bio-Supp.Center</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mouse strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macro-zoom microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>The observation unit of the custom-built microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine Hydrochloride</td>
			<td>Kyoritsu-Seiyaku</td>
			<td>008656</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>27803229</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Immersion oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-buthyldiethanolamine</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>B0725</td>
			<td>CUBIC-L, CUBIC-R+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>N0078</td>
			<td>CUBIC-R+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>12967-45</td>
			<td>CUBIC-L, PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon oil HIVAC-F4</td>
			<td>Shin-Etsu Chemical</td>
			<td>50449832</td>
			<td>Immersion oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-11092</td>
			<td>Staining buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-kidney three-dimensional staining with cubic

Хотя обычная патология предоставляла многочисленные сведения о микроструктуре почек, было трудно узнать точную структуру кровеносных сосудов, проксимальных канальцев, собирающих протоков, клубочков и симпатических нервов в почках из-за отсутствия трехмерной (3D) информации. Оптическая очистка является хорошей стратегией для преодоления этого большого препятствия. Несколько клеток в целом органе могут быть проанализированы с одноклеточным разрешением, сочетая очистку тканей и технику 3D-визуализации. Тем не менее, методы маркировки клеток для визуализации всего органа остаются недостаточно развитыми. В частности, окрашивание целых органов является сложной задачей из-за сложности проникновения антител. Настоящий протокол разработал окрашивание почек мыши для 3D-визуализации с помощью метода очистки тканей CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis). Протокол позволил визуализировать почечную симпатическую денервацию после ишемии-реперфузионного повреждения и гломеруломегалию на ранней стадии диабетической болезни почек с комплексной точки зрения. Таким образом, этот метод может привести к новым открытиям в исследованиях почек, обеспечивая макроскопическую перспективу.

Используя этот метод окрашивания, симпатические нервы [антитирозингидроксилазное (TH) антитело] и артерии [антитело против α гладкомышечных актинов (αSMA)] во всей почке (Рисунок 4A, B и Видео 1) были визуализированы9. Аномальные почечные симпат?...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC at JoVE.com

Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC

Настоящий протокол описывает метод очистки тканей и полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание для трехмерной (3D) визуализации почек. Этот метод может предложить макроскопические перспективы в патологии почек, что приводит к новым биологическим открытиям.

Трехмерное окрашивание цельной почки с помощью CUBIC

Although conventional pathology provided numerous information about kidney microstructure, it was difficult to know the precise structure of blood ...

Этот протокол позволяет визуализировать трехмерные структуры в полной почке, что может привести к инновационным открытиям в исследованиях почек, обеспечивая макроскопическую перспективу. Окрашивание органов цельным креплением является сложной задачей из-за сложности проникновения антител. Этот протокол продемонстрировал высокое качество, полностью установленное окрашивание почек антителами.Для начала выполните фиксацию погружения сразу после фиксации перфузии и забора проб почек, погружая почку в 4%-ный параформальдегид при четырех градусах Цельсия в течение 16 часов. Дайте три стирки с использованием PBS в течение двух часов каждая. Выполните процесс обесцвечивания и делипидации, погружая неподвижную почку в семь миллиметров 50% CUBIC-L в 14-миллилитровую трубку с круглым дном, с легким встряхиванием при комнатной температуре.Через шесть часов погрузить почку в семь миллилитров CUBIC-L в 14-миллиметровую трубку с круглым дном, с легким встряхиванием при 37 градусах Цельсия в течение пяти дней. Обновляйте CUBIC-L каждый день. После завершения обесцвечивания и делипидации используйте дозирующую ложку для обработки образцов и трижды промывайте почки PBS при комнатной температуре в течение двух часов.Разбавить делипидированную почку в первичных антителах, разведенных в окрашивающем буферном растворе, с легким встряхиванием в шейкере инкубатора при 37 градусах Цельсия в течение семи дней. Затем промывайте почки 0,5% тритоном X-100 в PBS, также известным как PBST, при комнатной температуре в течение одного дня. Для окрашивания вторичных антител обрабатывают почки вторичными антителами в буфере окрашивания, в темноте, с легким встряхиванием при 37 градусах Цельсия в течение семи дней.Зафиксируйте окрашивание с помощью промывки PBST при комнатной температуре в течение одного дня. После фиксации погружают почку в 1%-формальдегид в ПБ на три часа, и промывают ее ПБС при комнатной температуре в течение шести часов. Выполняют согласование показателя рефракции путем погружения почки в семь миллилитров 50%CUBIC-R+ в 14-миллилитровую трубку круглого дна с встряхиванием на один день, с последующим лечением семью миллилитрами CUBIC-R+ с встряхиванием при комнатной температуре в течение двух дней.С помощью метода иммунного окрашивания симпатические нервы и артерии во всей почке были визуализированы в 3D-визуализации почек. Более того, аномальные почечные симпатические нервы были визуализированы после ишемии-реперфузионной травмы. Этот протокол также облегчал визуализацию симпатических нервов во всей селезенке.Процесс количественной оценки данных для трехмерного иммунофлуоресцентного окрашивания показан здесь. Кроме того, собирали протоки, сегмент S1 проксимальных канальцев и клубочки успешно визуализировались в целой почке. Подавленная гломеруломегалия, возникающая в результате введения препарата на ранних стадиях диабетической болезни почек, также визуализировалась в 3D-визуализации.Этот протокол может маркировать конкретную молекулу во всей почке. Таким образом, исследователи могут проанализировать изменение структуры в сосудистой системе или найти редкие события в тканях почек.

Research

JoVE Journal

Medicine

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

Трехмерных изображений внутриэпидермальных ноцицептивных нервных волокон в человека биопсию кожи

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

Количественное определение клеток рака молочной железы инвазивности Использование трехмерной (3D) модель

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Трехмерная Co-культура Модель опухолью стромы взаимодействия

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Трехмерная (3D) опухоли Сфероид Вторжение Пробирной

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Трехмерная альгинат-шарик культуре человеческих клеток аденомы гипофиза

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Three-Dimensional Printing of a Complex Aortic Anomaly

Трехмерная печать сложных аорты аномалия

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

Оценка числа нефрона в целом почки использованием кислоты метод мацерации

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...

Three-Dimensional Printing Guide Template Assisted Percutaneous Vertebroplasty (PVP)

Three-Dimensional Printing Guide Template Assisted Percutaneous Vertebroplasty PVP

Трехмерная печать Руководство Шаблон Вспомогательная Перкутанная Вертебропластика (PVP)

Percutaneous vertebroplasty (PVP) is considered an effective treatment for the back pain caused by osteoporotic vertebral compression fracture. The ...

Three-Dimensional Collagen Matrix Scaffold Implantation as a Liver Regeneration Strategy

Трехмерная коллагеновая матрица каркаса имплантация как стратегия регенерации печени

Liver diseases are the leading cause of death worldwide. Excessive alcohol consumption, a high-fat diet, and hepatitis C virus infection promote fibrosis, ...

Guided Endodontics: Three-Dimensional Planning and Template-Aided Preparation of Endodontic Access Cavities

Управляемая эндодонтия: трехмерное планирование и шаблонная подготовка полостей эндодонтического доступа

Pulp canal obliterations (PCO) are often a consequence of dental trauma, such as luxation injuries. Even though dentin apposition is a sign of vital pulp, ...