Name: whole-kidney three-dimensional staining with cubic
Uploaded: 2022-07-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC at JoVE.com

Parte de este trabajo se llevó a cabo a través de la colaboración con el Prof. Hiroki R. Ueda (Universidad de Tokio), el Prof. Etsuo A. Susaki (Universidad de Juntendo), el Prof. Tetsuhiro Tanaka (Universidad de Tohoku), el Prof. Masafumi Fukagawa, el Dr. Takehiko Wada y el Dr. Hirotaka Komaba (Universidad de Tokai).

Todos los experimentos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Tokio. Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud. Para el presente estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6NJcl, de 8 semanas de edad. Los ratones se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de materiales).
1. Preparación animal y fijación renal
<ol><li>Realice la fijación de...

<ol>
	<li>Velez-Fort, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stimulus+selectivity+and+connectivity+of+layer+six+principal+cells+reveals+cortical+microcircuits+underlying+visual+processing.">The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing.</a> Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Landscape+for+Tissue+Clearing+Based+on+Hydrophilic+Reagents.">Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents.</a> Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).</li><li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution:+toward+organism-level+systems+biology+in+mammals.">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li><li>Keller, P. J., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens.">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution.">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li><li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+three-dimensional+analysis+(CUBIC-kidney)+visualizes+abnormal+renal+sympathetic+nerves+after+ischemia/reperfusion+injury.">Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury.</a> Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).</li><li>Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+interactions+and+kidney+disease.">Neuroimmune interactions and kidney disease.</a> Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).</li><li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oral+hypoxia-inducible+factor+prolyl+hydroxylase+inhibitor+enarodustat+counteracts+alterations+in+renal+energy+metabolism+in+the+early+stages+of+diabetic+kidney+disease.">The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease.</a> Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+sympathetic+signaling+in+macrophages+blocks+systemic+inflammation+and+protects+against+renal+ischemia-reperfusion+injury.">Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+evaluation+of+total+glomerular+number+and+capillary+tuft+size+in+nephritic+kidneys+using+lightsheet+microscopy.">Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+probing+of+intact+human+organs.">Cellular and molecular probing of intact human organs.</a> Cell. 180 (4), 796-812 (2020).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+whole-organ/body+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues.">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).</li></ol>

El presente protocolo permitió obtener imágenes 3D de todo el riñón de varias estructuras, como nervios simpáticos, conductos colectores, arterias, túbulos proximales y glomérulos 9,10,11. Este método de tinción ofreció observación macroscópica y condujo a nuevos descubrimientos biológicos, al visualizar la alteración en los nervios simpáticos renales después de la lesión por isquemia-rep...

El riñón está compuesto por varias poblaciones celulares. Aunque la patología convencional nos da mucha información sobre el microambiente renal, se necesitan imágenes tridimensionales (3D) para comprender con precisión la diafonía intercelular durante la progresión de la enfermedad renal. En el pasado, era necesario realizar una gran cantidad de seccionamiento en serie y reconstrucción de imágenes para las imágenes 3D de órgano completo1. Sin embargo, este método requería demasiado esfuerzo y tenía problemas en términos de reproducibilidad.
El clearing óptico es una buena estrategia para superar este obstáculo 2,3. La opacidad tisular se debe principalmente a la dispersión y absorción de la luz porque cada órgano consta de varias sustancias, incluyendo agua, proteínas y lípidos. Por lo tanto, la estrategia básica de limpieza de tejidos es reemplazar el agua y los lípidos en los tejidos con reactivos que coinciden con el índice de refracción (IR) que tienen las mismas propiedades ópticas que las proteínas4. Para observar una muestra transparente, una microscopía fluorescente de lámina de luz es útil5. Las láminas de luz iluminan la muestra transparente desde el lado, y las señales de excitación se adquieren a través de la lente del objetivo ubicada en posición vertical6. Esta microscopía obtiene información de sección transversal en un solo barrido, que es diferente de la microscopía fluorescente confocal o multifotónica. Por lo tanto, puede adquirir rápidamente imágenes z-stack con un bajo nivel de fotoblanqueo.
Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) es uno de los métodos de limpieza de tejidos que permite obtener imágenes de órganos completos mediante microscopía fluorescente de lámina de luz 2,7,8. La tinción inmunofluorescente cúbica y de montaje completo se optimiza en el presente estudio para visualizar estructuras 3D de riñón de ratón 9,10,11. Utilizando este método de tinción de montaje completo, la alteración de los nervios simpáticos renales se visualiza después de la lesión por isquemia-reperfusión 9,10 y glomerulomegalia en la etapa temprana de la enfermedad renal diabética 11, así como los vasos sanguíneos, los túbulos proximales y los conductos colectores en un riñón completo9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td>Tissue clearing, staining, wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>D1876</td>
			<td>CUBIC-R+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37%-Formaldehyde Solution</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>16223-55</td>
			<td>Post fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>09154-85</td>
			<td>Kidney fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21436</td>
			<td>Secondary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31573</td>
			<td>Secondary antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab199975</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-podocin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0372</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab85626</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-smooth muscle actin (&#945;-SMA) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5694</td>
			<td>Primary antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocker Casein in PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>37528</td>
			<td>Staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol Tartrate</td>
			<td>Meiji</td>
			<td>005526</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6NJcl</td>
			<td>Nippon Bio-Supp.Center</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mouse strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macro-zoom microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>The observation unit of the custom-built microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine Hydrochloride</td>
			<td>Kyoritsu-Seiyaku</td>
			<td>008656</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>27803229</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Immersion oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-buthyldiethanolamine</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>B0725</td>
			<td>CUBIC-L, CUBIC-R+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>N0078</td>
			<td>CUBIC-R+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>12967-45</td>
			<td>CUBIC-L, PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon oil HIVAC-F4</td>
			<td>Shin-Etsu Chemical</td>
			<td>50449832</td>
			<td>Immersion oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-11092</td>
			<td>Staining buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-kidney three-dimensional staining with cubic

Aunque la patología convencional proporcionó numerosa información sobre la microestructura renal, fue difícil conocer la estructura precisa de los vasos sanguíneos, los túbulos proximales, los conductos colectores, los glomérulos y los nervios simpáticos en el riñón debido a la falta de información tridimensional (3D). El despeje óptico es una buena estrategia para superar este gran obstáculo. Se pueden analizar múltiples células en un órgano completo a una resolución de una sola célula combinando la limpieza de tejidos y la técnica de imágenes 3D. Sin embargo, los métodos de etiquetado celular para imágenes de órganos completos siguen estando poco desarrollados. En particular, la tinción de órganos de montaje completo es un desafío debido a la dificultad en la penetración de anticuerpos. El presente protocolo desarrolló una tinción renal de ratón de montaje completo para imágenes 3D con el método de limpieza de tejidos CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis). El protocolo ha permitido visualizar la denervación simpática renal tras lesión por isquemia-reperfusión y glomerulomegalia en el estadio precoz de la enfermedad renal diabética desde un punto de vista integral. Por lo tanto, esta técnica puede conducir a nuevos descubrimientos en la investigación renal al proporcionar una perspectiva macroscópica.

Utilizando este método de tinción, se visualizaron nervios simpáticos [anticuerpo antitirosina hidroxilasa (TH)] y arterias [anticuerpo anti-α-actina músculo liso (αSMA)] en un riñón entero (Figura 4A, B y Video 1)9. También se visualizaron nervios simpáticos renales anormales después de la lesión por isquemia/reperfusión (IRI)9,10 (Figura 4C<...

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Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC

El presente protocolo describe un método de limpieza de tejidos y tinción inmunofluorescente de montaje completo para imágenes renales tridimensionales (3D). Esta técnica puede ofrecer perspectivas macroscópicas en patología renal, lo que lleva a nuevos descubrimientos biológicos.

Tinción tridimensional de riñón entero con CUBIC

Although conventional pathology provided numerous information about kidney microstructure, it was difficult to know the precise structure of blood ...

Este protocolo permite una visualización de estructuras tridimensionales en el riñón completo, lo que puede conducir a descubrimientos innovadores en la investigación renal al proporcionar una perspectiva macroscópica. La tinción de órganos de montaje completo es un desafío debido a la dificultad en la penetración de anticuerpos. Este protocolo ha demostrado la tinción de alta calidad y montaje completo de los riñones por los anticuerpos.Para comenzar, realice la fijación por inmersión inmediatamente después de la fijación de perfusión y el muestreo renal, sumergiendo el riñón en paraformaldehído al 4% a cuatro grados centígrados durante 16 horas. Dé tres lavados usando PBS durante dos horas cada uno. Realice el proceso de decoloración y deslipidación sumergiendo el riñón fijo en siete milímetros de 50% CUBIC-L en un tubo de fondo redondo de 14 mililitros, con agitación suave a temperatura ambiente.Después de seis horas, sumerja el riñón en siete mililitros de CUBIC-L en un tubo de fondo redondo de 14 milímetros, con una agitación suave a 37 grados centígrados durante cinco días. Refresque CUBIC-L todos los días. Una vez que se complete la decoloración y la deslipidación, use una cuchara dispensadora para el manejo de muestras y lave el riñón tres veces con PBS a temperatura ambiente durante dos horas.Inmunoteñir el riñón deslipidado en anticuerpos primarios diluidos en solución tampón de tinción, con agitación suave en una incubadora agitadora a 37 grados centígrados durante siete días. Luego, lave el riñón con 0.5% Triton X-100 en PBS, también conocido como PBST, a temperatura ambiente durante un día. Para la tinción secundaria de anticuerpos, trate el riñón con anticuerpos secundarios en el tampón de tinción, en la oscuridad, con una agitación suave a 37 grados centígrados durante siete días.Arregle la tinción con un lavado PBST a temperatura ambiente durante un día. Después de la fijación, sumerja el riñón en formaldehído al 1% en PB durante tres horas y lávelo con PBS a temperatura ambiente durante seis horas. Realice la coincidencia del índice de refracción sumergiendo el riñón en siete mililitros de 50% CUBIC-R + en un tubo de fondo redondo de 14 mililitros con agitación durante un día, seguido de un tratamiento con siete mililitros de CUBIC-R + con agitación a temperatura ambiente durante dos días.Con la ayuda del método de tinción inmune, los nervios y arterias simpáticos en un riñón completo se visualizaron en imágenes renales 3D. Además, se visualizaron nervios simpáticos renales anormales después de la lesión por isquemia-reperfusión. Este protocolo también facilitó la visualización de los nervios simpáticos en todo el bazo.El proceso de cuantificación de datos para la tinción inmunofluorescente tridimensional se muestra aquí. Además, los conductos colectores, el segmento S1 de los túbulos proximales y los glomérulos se visualizaron con éxito en todo un riñón. La glomerulomegalia suprimida, resultante de la administración de fármacos en las primeras etapas de la enfermedad renal diabética, también se visualizó en imágenes 3D.Este protocolo puede etiquetar la molécula específica dentro de un riñón completo. Por lo tanto, los investigadores pueden analizar la alteración de la estructura en la vasculatura o encontrar eventos raros en los tejidos renales.

Research

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